Havalandırmanın Beta Glukan Verimine Etkisinin İncelenmesi

S.cerevisiae mayasının farklı çoğalma koşullarında beta glukan içeriğinin değişkenlik gösterdiği bilinmektedir. Beta glukan içeriğine oksijen derişiminin etkisini incelemek amacıyla farklı havalandırma koşullarında, 4 ayrı biyoreaktörde mikroorganizma çoğaltma deneyi gerçekleştirilmiştir. Deneysel çalışmalar; aynı taze katı besi ortamından sırasıyla 5 mL, 50 mL ve 500 mL’lik sıvı besi ortamlarına mikroorganizma aktarımı ardından 34.7 ^oC ve 150 rpm karıştırma hızında inkübatörde çoğaltılmasıyla gerçekleştirilmiştir. Hava beslemesiz (mikrobiyolojik filtreli), hava beslemeli (1 vvm hava akışlı), anaerobik (t=0’da azot geçirilerek ortamdaki oksijen uzaklaştırılmış ve izole edilmiş) ve 4. saatten itibaren 1 vvm hava akışlı erlen biyoreaktörlerde çeşitli havalandırma profilleri uygulanmış ve mikroorganizma çoğalması sürdürülmüştür (Şekil 4.8). Mikroorganizmaların çoğalma süresi olan 8 saatin sonunda biyoreaktörlerden alınan örnekler, Bölüm 4.4’teki adımlar izlenerek ekstrakte edilmiştir.

Farklı havalandırma koşulları ile mikroorganizmanın metabolik yol izlerinde farklılıklar yaratılarak beta glukan veriminin değiştirilebildiği gözlenmiştir ve bundan hareketle deneysel çalışmalara O2 ile devam edilmiştir.

41

Şekil 4.8 Farklı havalandırma profilleri deneyi

4.10 Oksijen Derişiminin Beta Glukan Verimine Etkisinin İncelendiği Deneyler

Tez çalışmasının bu bölümünde farklı oksijen derişimlerinin beta glukan verimine etkilerini incelemek için üç ayrı deneysel çalışma gerçekleştirilmiştir.

4.10.1 Kesikli oksijen beslemesi

Farklı oksijen derişimlerinin mikroorganizma ve beta glukan verimi üzerine etkisinin incelenmesi ve aynı zamanda biyoreaktöre beslenebilecek oksijen limitlerinin anlaşılabilmesi amacıyla üç ayrı oksijen derişiminde çalışılmıştır. Deneysel çalışmada ağzı kapalı, hava izolasyonu bulunan, ağzı tıpalı, steril 100 mL’lik biyoreaktörlerde çalışılmıştır.

42

İlk olarak mikroorganizma katı besi ortamından, 15 mL’lik sıvı besi ortamına aktarılmıştır. Bölüm 4.4’te anlatıldığı şekilde 1:10 ölçek büyütme oranı ile çalışılmıştır.

Daha sonra kaynak biyoreaktörden 5’er mL ayrılmış ve santrifüjlenerek 50 mL’lik, pH’ı 4.8 olarak ayarlanmış olan taze sıvı besi ortamları bulunduran üç adet biyoreaktöre laminer akışlı kabinde aktarılmıştır. Mikroorganizma aktarımı yapıldığında (t=0 st anında) mikroorganizma derişimi ve canlı hücre sayımı için numuneler alınmıştır.

Mikroorganizma aktarımı yapıldıktan hemen sonra biyoreaktörlerin ağzı tıpa ile kapatılmıştır. Kapatılan biyoreaktörlerden iki dakika boyunca azot geçirilmiş, içerideki tüm oksijen süpürülmüştür. Tüm izolasyonları sağlandıktan sonra KB-1 numaralı biyoreaktöre hiç oksijen beslenmemiş, KB-2 numaralı biyoreaktöre sadece başlangıçta 25 mL (102.3 mmol) oksijen beslenmiş, KB-3 numaralı biyoreaktöre ise sadece başlangıçta 50 mL (204.6 mmol) oksijen beslenmiştir. Deneysel çalışma boyunca t=0 st anından itibaren her saat başı biyoreaktörlerin tepe boşluğundan oksijen numunesi alınıp, gaz kromatografi cihazında analizi yapılmıştır. Mikroorganizma çoğalması boyunca ortamda sadece O₂ değil, başlangıçta oksijenin süpürülmesi için kullanılan N₂ gazı ve fermentasyon sonucu oluşan CO2’de bulunmaktadır. Fakat kullanılan kolon ve metod şartları göz önünde bulundurulduğunda gaz kromatografi cihazında sadece oksijen analizi gerçekleştirilmiştir. 34.7 °C sıcaklık ve 150 rpm karıştırma hızına set edilmiş olan inkübatörde 8 saat boyunca mikroorganizma çoğaltma işlemi sürdürülmüştür. Deneysel çalışmanın şematik gösterimi şekil 4.9’da, inkübatörde çoğaltma esnasındaki görüntüleri ise şekil 4.10’da verilmiştir.

43

Şeki l 4.10 İnkübatörde çoğaltma işlemi devam ederken biyoreaktörler

5 mL m.o.

25 mL Oksijen 15mL

Sıvı Besi Ort.+ Mikroorganizma

5 mL m.o.

Oksijensiz

5 mL m.o.

50 mL Oksijen

50 mL Besi ortamı 50 mL

Besi ortamı 50 mL

Besi ortamı

Katı-Katı Aktarım

KB-1 KB-2 KB-3

Şekil 4.9 Deneysel çalışmanın şematik gösterimi

44 4.10.2 Oksijen besleme profilleri

Tez çalışmasının bu bölümünde biyoreaktörlere beslenen oksijen miktarının değişik aralıklarla (2 saatte bir), değişik oranlarda beslenmesiyle oluşturulan profillerin beta glukan verimine etkisi incelenmiştir. Bunun için dört ayrı biyoreaktörde farklı oksijen profillerinde çalışılmıştır. Deneysel çalışmaya başlamadan önce biyoreaktörlerin hepsinden 2 dakika boyunca azot geçirilmiş, içeride kalan tüm oksijen süpürülmüştür.

Daha sonra AB-25-I ve II numaralı biyoreaktörlere toplam 25 mL (102.3 mmol) oksijen beslenmiş, AB-50-I ve II numaralı biyoreaktörlere ise toplam 50 mL (204.6 mmol) oksijen beslenmiştir. Bu oksijen miktarlarının biyoreaktörlere besleme profilleri çizelge 4.2’de, inkübatörde çoğalmanın devam ettiği biyoreaktörler de şekil 4.11’de verilmiştir.

Çizelge 4.2 Oksijen besleme profilleri tablosu

Profil No

t=0 st’te beslenen O2

hacmi, mL

t=2 st’te beslenen O2 hacmi, mL

t=4 st’te beslenen O2 hacmi, mL

Eklenen toplam O2

hacmi, mL

AB-25-I 5 10 10 25

AB-25-II 10 10 5 25

AB-50-I 10 20 20 50

AB-50-II 20 20 10 50

Şekil 4.11 Oksijen besleme profil deneyi esnasında biyoreaktörler

45

Sekiz saat boyunca; her iki saatte bir, biyoreaktöre oksijen eklenmeden önce ve eklendikten sonra GC cihazında oksijen analizi yapılmıştır. Deneyin başlatıldığı ve 8.

saatin sonunda canlı mikroorganizma sayımı ve mikroorganizma derişimi için numuneler alınmıştır. Ayrıca deneysel çalışmanın sonunda beta glukan ekstraksiyonu yapılmış ve glikoz analizleri de gerçekleştirilmiştir.

4.10.3 Çoğaltma süresinin etkisi

Bölüm 5.5.3’te anlatılacağı üzere mikroorganizma çoğalması için 8 saatin yetersiz olduğu değerlendirilerek çoğaltma işleminin 12 saat boyunca sürdürülmesine karar verilmiştir. Farklı oksijen derişimlerinin denendiği çalışma tekrarlanmıştır. Tıpalı biyoreaktörlere ek olarak bir mikrobiyolojik filtreli biyoreaktör de deney setine eklenmiştir. Böylece farklı koşulları temsil eden biyoreaktörler; MF (mikrobiyolojik filtreli), KB-1 (oksijensiz), KB-2 (25 mL, 101.3 mmol oksijen) ve KB-3 (50 mL, 203.7 mmol oksijen) olarak kodlanmıştır. Deney başlatıldığı anda (t=0 st); oksijen analizi, mikroorganizma derişimi analizi, canlı mikroorganizma sayımı yapılmıştır.

Deneysel çalışma boyunca her iki saatte bir mikroorganizma derişimi analizi yapılmıştır. 12. saatin sonunda tekrar canlı mikroorganizma sayımı yapılmış olup, glikoz analizi ve beta glukan ekstraksiyonu işlemleri de gerçekleştirilmiştir.