ANKARA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ
YÜKSEK LİSANS TEZİ
FARKLI HAVALANDIRMA PROFİLLERİNDE MAYA ÇOĞALMASININ BETA GLUKAN VERİMİNE ETKİSİNİN İNCELENMESİ
Fatoş KOÇAK
KİMYA MÜHENDİSLİĞİ ANABİLİM DALI
ANKARA 2019
Her hakkı saklıdır
ii ÖZET Yüksek Lisans Tezi
FARKLI HAVALANDIRMA PROFİLLERİNDE MAYA ÇOĞALMASININ BETA GLUKAN VERİMİNE ETKİSİNİN İNCELENMESİ
Fatoş KOÇAK Ankara Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Kimya Mühendisliği Anabilim Dalı Danışman: Doç. Dr. Suna ERTUNÇ
Bu çalışmada Saccharomyces cerevisiae mayası çoğaltılan besi ortamında oksijen derişiminin, oksijen besleme profillerinin ve glikoz derişimi-oksijen derişimi ikili etkileşimlerinin maya hücre duvarı bileşeni olan beta glukan verimine etkileri incelenmiştir. İnsan sağlığına iyi yöndeki etkileri ve üretim maliyetinin düşük olması sebebiyle beta glukan kaynağı olarak Saccharomyces cerevisiae mayası kullanılmıştır.
Mikroorganizmaların çoğaltıldıkları koşullar; hücre çoğalmasını, yapısını ve ürettikleri ürünlerin çeşitleri ile kalitesini değiştirmektedir Mikroorganizmanın temel çoğalma koşullarından olan karbon kaynağı (glikoz) ve oksijen derişiminin beta glukan verimine etkisi incelenmiştir. Öncelikle ön çoğaltmada adımında mikroorganizmanın santrifüjlenerek aşılanmasının, maya derişimini arttırdığı belirlenmiştir. Çalışmalar ilk olarak limitlerin belirlenmesi amacıyla küçük ölçekte, çoklu denemeler halinde gerçekleştirilmiştir. Kesikli ve aralıklı-beslemeli olarak gerçekleştirilen oksijen beslemesinin ve oksijen derişiminin en uygun koşulu, beta glukan verimi değerlendirilerek belirlenmiştir. Sistem sınırlarına ve besleme profiline (kesikli) karar verildikten sonra iki seviyeli tam faktöriyel deneysel tasarım yöntemi kullanılarak deneyler gerçekleştirilmiştir. Tasarım deneylerinin sonuçlarına göre, oksijen ve glikoz derişimleri arttıkça beta glukan veriminin arttığı belirlenmiştir. Regresyon modeli incelendiğinde; en yüksek beta glukan verimi olan 0.811 g yaş bg/ g kmo değerinin, 200 g/L glikoz ve 50 mL oksijenin kesikli beslendiği şartlarda elde edildiği belirlenmiştir.
Son olarak deney tasarım matrisindeki merkez nokta koşullarında (130 g/L glikoz, 25 mL oksijen) 5 L’lik karıştırmalı kesikli işletilen biyoreaktörde maya çoğaltılarak, sonuçlar küçük ölçekle karşılaştırılmış ve birbirlerine yakın olduğu (0.5 g yaş bg/g kmo) belirlenmiştir.
Haziran 2019, 101 sayfa
Anahtar Kelimeler: Saccharomyces cerevisiae, maya, beta glukan verimi, oksijen derişimi, deney tasarımı
iii ABSTRACT Master Thesis
INVESTIGATION OF THE EFFECT OF YEAST GROWTH UNDER DIFFERENT AERATION PROFILES ON BETA GLUCAN YIELD
Fatoş KOÇAK Ankara University
Graduate School of Natural and Applied Sciences Department of Chemical Engineering Supervisor: Assoc.Prof. Dr. Suna ERTUNÇ
In this study, the effects of oxygen concentration, aeration profile and glucose-oxygen concentration couple interaction on the yield of beta-glucan, the yeast cell wall component, were investigated in the Saccharomyces cerevisiae growth medium.
Because of its positive effects on human health and low cost of production Saccharomyces cerevisiae was used as beta glucan source. Microorganisms’ growth conditions changes cell multiplication and structure, products’ variety and quality.
Effects of carbon source and oxygen concentration, growth conditions of the microorganism, were investigated on the beta-glucan yield extracted from cell wall of the yeast. Firstly, it was determined the inoculation by using centrifuged microorganism in the pre-culture step increased the yeast concentration. Studies were carried out in a small scale and multiple trials in order to determine the limits. The optimal condition of oxygen supply and concentration in batch and intermittent feedings was determined by evaluating beta glucan yield. After defining limits of the system and selecting the oxygen feeding type as batch, experiments were performed by using two level-full factorial experimental design method. According to the results it was concluded that both the oxygen and glucose concentrations were increased, beta glucan yield was also increased. When the model is examined, the highest beta glucan yield was 0.811 g wet bg/g dry yeast under batch feeding of 200 g/L glucose and 50 mL oxygen conditions.
Finally, yeast was grown in 5L-stirred-batch bioreactor at the center point (130 g/L glucose, 25 mL oxygen) and results were compared with small scale and observed close to each other (0.5g wet bg/g dry yeast).
June 2019, 101 pages
Key Words: Saccharomyces cerevisiae, yeast, beta glucan yield, oxygen concentration, experimental design
iv TEŞEKKÜR
Yüksek lisans çalışmalarımda beni sadece yüksek lisans öğrencisi olarak değil ailesinin bir ferdi olarak gören; üstümden elini hiç çekmeyip, desteğini hiç esirgemeyen; diğer yandan bana tecrübeleriyle yön veren, her düştüğümde kaldıran, proses kontrol dünyasında varlığımı hissettiren, öpülesi ellerini sırtımdan hiç çekmemesini dilediğim canım hocam Doç. Dr. Suna ERTUNÇ’a en büyük teşekkürlerimi sunarım.
Deneysel çalışmalarımı gerçekleştirmemi sağlayan, laboratuvar cihazlarını yüksek lisans çalışmama destek olmak amacıyla benimle paylaşan Prof. Dr. Güzide ÇALIK GARCIA hocama teşekkürü bir borç bilirim.
Enstrümantal analizlerimde her daim bana yardımcı olan, metotlarımı oturturken yaşadığım umutsuzluklarımı gideren, karşılaştığım tatsızlıklarda hep bir çözümü olan güler yüzlü, güzel kalpli hocam Uzm. Dr. Nilüfer VURAL’a sonsuz teşekkürlerimi sunarım.
Beni öz kardeşi olarak görüp pozitif enerjisiyle hayatımı renklendiren, aynı anlarda laboratuvarda bulunamadığımız zamanlarda bile (Kanada’dan dahi) gerek bilimsel gerekse manevi olarak desteğini asla eksik etmeyen, sıcacık kalbi ile içimi ısıtan Zeynep YILMAZER HİTİT hocama (ablama); güler yüzü ve olumlu kişiliğiyle umutsuz anlarımda yüzümü hep güldüren Kıvanç HİTİT abime ve ailemizin yeni ferdi, sosyal bebeğimiz, fındık kurdumuz Atlas HİTİT’ciğime hayatımda var oldukları için çok çok teşekkür ederim.
Kardeşliğin sadece aynı anne babadan doğarak olmadığını öğrendiğim, bana Ankara’yı anlamlı hale getiren, 10 yıldır dostluk nedir onunla yaşayarak öğrendiğim ve gerektiğinde deneysel çalışmalarımda benimle sabahlara kadar tartımlar yapan canım kardeşim (fahri kimya mühendisi) Okutman Gizem ERGİNER’e sonsuz teşekkür ederim. Uzman Ece TURUNÇ dostumun da sonsuz sabrı, huzur verici konuşmaları ve destekleri için; gece gündüz hiç bıkmadan deneysel çalışmalarımda yanımda olan minnoş Sıla ELDEMİR ve Efe YORGANCIOĞLU kardeşlerime de teşekkürü bir borç bilirim.
Bu uzun süren yüksek lisans eğitimim boyunca bana maddi manevi desteklerini hiç eksik etmeyen, konuşurken bir şey söylemesem de moralimin bozuk olduğunu hissedip sonsuz moraller veren canlarım; Babacığım Rahmi KOÇAK, anneciğim Zübeyde KOÇAK, ortancam, buğdaycığım ve canım en yakın arkadaşım, kız kardeşim Melis İpek KOÇAK ve minik kardeşim, basketçim, gurur kaynağım Harun Can KOÇAK’a sonsuz teşekkür ederim. Sizleri çok seviyorum canım ailem, varlığınıza ve desteğinize minnettarım.
Fatoş KOÇAK Ankara, Haziran 2019
v İÇİNDEKİLER
TEZ ONAY SAYFASI
ETİK ... i
ÖZET ... ii
ABSTRACT ... ii
TEŞEKKÜR ... iv
SİMGELER DİZİNİ ... vii
ŞEKİLLER DİZİNİ ... ix
ÇİZELGELER DİZİNİ ... xii
1. GİRİŞ ... 1
2. KAYNAK ARAŞTIRMASI ... 4
3. KURAMSAL TEMELLER ... 9
3.1 Maya Yapısı ve Çoğalması ... 9
3.2 Mayaların Endüstriyel Uygulamaları ... 11
3.3 Beta Glukanın Yapısı ve Kaynakları ... 12
3.4 Beta Glukanın Kullanım Alanları ... 15
3.5 Mayadan Beta Glukan Üretim Prosesi ... 16
3.6 Beta Glukan Üretim Verimini Etkileyen Faktörler ... 19
3.6.1. Maya çoğalmasını etkileyen faktörler ... 20
3.6.2 Beta glukan ekstraksiyonunu etkileyen faktörler ... 26
3.7. Deneysel Tasarıma Dayalı Optimizasyon: Tam Faktöriyel Tasarım ... 26
4. MATERYAL VE YÖNTEM ... 28
4.1 Mikroorganizma Çoğaltılması ... 28
4.2 Besi Ortamları ... 28
4.2.1 Katı besi ortamı ... 29
4.2.2 Sıvı besi ortamı ... 30
4.3 Canlı Mikroorganizma Sayımı ... 31
4.4 Mikroorganizma Derişimi Analizi ve Kalibrasyonu ... 33
4.5 Beta Glukan Ekstraksiyonu ... 34
4.6 DNS Yöntemi ile Glikoz Tayini ve Kalibrasyonu... 36
4.7 Gaz Kromatografi Cihazı ile Oksijen Analizi ve Kalibrasyonu ... 36
4.8 Ön Çoğaltmada Aşılama Türünün Etkisi Deneyleri... 37
4.9 Havalandırmanın Beta Glukan Verimine Etkisinin İncelenmesi ... 40
vi
4.10 Oksijen Derişiminin Beta Glukan Verimine Etkisinin İncelendiği
Deneyler ... 41
4.10.1 Kesikli oksijen beslemesi ... 41
4.10.2 Oksijen besleme profilleri... 44
4.10.3 Çoğaltma süresinin etkisi ... 45
4.11 İstatistiksel Deneysel Tasarım Çalışmaları ... 45
4.12 Pilot Ölçekli Biyoreaktör Deneyi ... 48
5. ARAŞTIRMA BULGULARI ... 51
5.1 Canlı Mikroorganizma Sayımı ... 51
5.2 Kalibrasyon Çalışmaları ... 54
5.2.1 Mikroorganizma derişimi kalibrasyonu ... 54
5.2.2 Glikoz derişimi kalibrasyonu ... 55
5.2.3 Oksijen derişimi kalibrasyonu ... 56
5.3 Ön Çoğaltmada Aşılama Türünün Etkisi ... 57
5.4 Havalandırmanın Beta Glukan Verimine Etkisi ... 61
5.5 Oksijen Derişiminin Beta Glukan Verimine Etkisi ... 61
5.5.1 Kesikli oksijen beslemesi (KB) sonuçları ... 61
5.5.2 Aralıklı oksijen beslemesi (AB) profilleri sonuçları ... 65
5.5.3 Çoğaltma süresinin etkisi ... 73
5.6 İstatistiksel Deneysel Çalışma Sonuçları ... 75
5.6.1 Deney tasarımı-I sonuçları ... 75
5.6.2 Deney tasarımı-II sonuçları ... 81
5.7 Pilot Ölçekli Biyoreaktör Deneyi ... 83
5.8 Deneysel çalışmalar sonucu elde edilen beta glukanın FTIR Analizi ... 86
6. TARTIŞMA VE SONUÇLAR ... 88
KAYNAKLAR ... 93
EKLER ... 98
EK 1 Kesikli Oksijen Besleme Deneyi; Mikroorganizma Derişim ve Kütle Değerleri ... 99
EK 2 Aralıklı Oksijen Besleme Profil Deneyleri; Mikroorganizma Derişim ve Kütle Değerleri ... 100
ÖZGEÇMİŞ ... 101
vii
SİMGELER DİZİNİ
atm Atmosfer basıncı
η Beta glukan verimi (g yaş beta glukan/g kuru mikroorganizma) ηO2 Beta glukan verimi (g yaş beta glukan/mmol tüketilen O2) ηs Beta glukan verimi (g yaş beta glukan/g tüketilen substrat) Cs Substrat derişimi (g glikoz/L)
Cx Mikroorganizma derişimi (g kuru mikroorganizma/L) CH3COOH Asetik Asit
Cs Tüketilen glikoz derişimi (g glikoz/L) HCl Hidroklorik Asit
Mx Mikroorganizma kütlesi (g kuru mikroorganizma)
N Karıştırma hızı
NaOH Sodyumhidroksit
nm Nanometre
°C Santigrat derece rpm devir/dk
st Saat
vvm volume air/volume medium/min
Kısaltmalar
AB Aralıklı Besleme
ASE Accelerated Solvent Extraction
bg beta glukan
CFU Colony Forming Unit DHA Docosahexaenoic acid DNS 3,5-Dinitrosalisilik asit
DO Dissolved Oxygen Concentration DP Degree of Polymerization DTT 1,4-Ditio treitol
EFSA European Food Safety Authority
viii FDA US Food Drug Administration FTIR Fourier Transform Infrared
GC Gaz Kromatografi
HPAEC Yüksek performanslı anyon değişimi kromatografisi IDF International Diabetes Federation
KB Kesikli Besleme
kh kuru hücre
kmo kuru mikroorganizma
MAE Microwave Assisted Extraction MF Mikrobiyolojik Filtreli
mo mikroorganizma
NMR Nükleer Manyetik Rezonans SDA Sabouraud Dekstroz Agar UAE Ultrasound Assisted Extraction
UV Ultraviyole
YPG Yeast Extract-Peptone-Glucose Broth Medium
ix
ŞEKİLLER DİZİNİ
Şekil 3.1 Maya hücre duvarındaki bileşikler ve dizilişleri ... 10
Şekil 3.2 Çeşitli beta glukan yapıları ... 13
Şekil 3.3 S.cerevisiae hücre duvarı materyalleri, beta glukan çeşitleri ve dizilişleri ... 14
Şekil 4.1 Katı besi ortamı ... 30
Şekil 4.2 Taze katı besi ortamına aktarım işlemi ... 32
Şekil 4.3 Canlı mikroorganizma sayımı deney yöntemi ... 32
Şekil 4.4 Beta glukan ekstraksiyon işlemi adımları ... 35
Şekil 4.5 Gaz kromatografi cihazı ... 37
Şekil 4.6 Deneysel çalışmanın şematik gösterimi ... 39
Şekil 4.7 Santrifüj sonrası numuneler ... 39
Şekil 4.8 Farklı havalandırma profilleri deneyi ... 41
Şekil 4.9 Deneysel çalışmanın şematik gösterimi ... 43
Şekil 4.10 İnkübatörde çoğaltma işlemi devam ederken biyoreaktörler ... 43
Şekil 4.11 Oksijen besleme profil deneyi esnasında biyoreaktörler ... 44
Şekil 4.12 İstatistiksel deneysel tasarım çalışmasında kullanılan biyoreaktörler ... 46
Şekil 4.13 Deneysel çalışma esnasında biyoreaktörler ... 47
Şekil 4.14 Deney düzeneği ... 49
Şekil 4.15 5 L’lik çelik biyoreaktör sistemi ... 50
Şekil 5.1 Ekim yapıldıktan 24 st sonra petri kapları ... 52
Şekil 5.2 104 seyreltme oranlı aktarımın 24 st sonraki görüntüsü... 52
Şekil 5.3 105 seyreltme oranlı aktarımın 24 st sonraki görüntüsü... 53
Şekil 5.4 106 seyreltme oranlı aktarımın 24 st sonraki görüntüsü... 53
Şekil 5.5 107 seyreltme oranlı aktarımın 24 st sonraki görüntüsü... 54
Şekil 5.6 Kuru mikroorganizma derişimi kalibrasyon grafiği ... 55
Şekil 5.7 DNS yöntemi ile glikoz analizi kalibrasyon grafiği ... 56
Şekil 5.8 Oksijen kalibrasyon grafiği ... 57
Şekil 5.9 Kesikli oksijen beslemesi durumunda mikroorganizma derişiminin zamanla değişimi (Cs0=20 g/L, T=34.7 °C, pH=4.8, N=150 rpm, t=8 st) ... 62
Şekil 5.10 Kesikli oksijen beslemesi durumunda canlı mikroorganizma sayısı değerleri ... 62
x
Şekil 5.11 Kesikli oksijen beslemesi için beta glukan verimi (g yaş bg/g kmo) ... 63 Şekil 5.12 Kesikli oksijen beslemesi için glikozun zamanla değişimi grafiği ... 63 Şekil 5.13 Kesikli oksijen beslemesi için O2 tüketiminin zamanla değişimi ... 64 Şekil 5.14 KB-2 numaralı biyoreaktör (25 mL O2 eklenen) için t=0 st’te gaz
fazdan alınan örneğin GC kromatogramı ... 64 Şekil 5.15 KB-2 numaralı biyoreaktör (25 mL O2 eklenen) için t=8 st’te gaz
fazdan alınan örneğin GC kromatogramı ... 65 Şekil 5.16 Aralıklı oksijen besleme profilleri için canlı mikroorganizma sayısı
grafiği ... 66 Şekil 5.17 AB-25-I ve AB-25-II profilleri için (toplam 25 mL oksijen beslenen)
biyoreaktörlerdeki oksijen değişimleri ... 67 Şekil 5.18 AB-50-I ve AB-50-II profilleri için (toplamda 50 mL oksijen beslenen)
biyoreaktörlerindeki oksijen değişimleri ... 67 Şekil 5.19 25 mL’lik kesikli ve aralıklı oksijen beslenen biyoreaktörlerde canlı
hücre sayılarının karşılaştırılması (Cs0=20 g/L, T=34.7 °C, pH=4.8, N=150 rpm, t=8 st) ... 69 Şekil 5.20 25 mL’lik kesikli ve aralıklı oksijen beslenen biyoreaktörlerde mo
kütlelerinin karşılaştırılması (Cs0=20 g/L, T=34.7 °C, pH=4.8, N=150 rpm, t=8 st) ... 69 Şekil 5.21 25 mL’lik kesikli ve aralıklı oksijen beslenen biyoreaktörlerde beta
glukan verimlerinin karşılaştırılması (g yaş bg/g kmo) ... 70 Şekil 5.22 25 mL’lik kesikli ve aralıklı oksijen beslenen biyoreaktörlerde glikoz
derişimleri karşılaştırılması ... 70 Şekil 5.23 50 mL’lik kesikli ve aralıklı oksijen beslenen biyoreaktörlerde canlı hücre sayılarının karşılaştırılması ... 71 Şekil 5.24 50 mL’lik kesikli ve aralıklı oksijen beslenen biyoreaktörlerde mo
kütlelerinin karşılaştırılması ... 72 Şekil 5.25 50 mL’lik kesikli ve aralıklı oksijen beslenen biyoreaktörlerde glikoz
derişimlerinin karşılaştırılması ... 72 Şekil 5.26 50 mL’lik kesikli ve aralıklı oksijen beslenen biyoreaktörlerde beta glukan verimlerinin karşılaştırılması (g yaş bg/g kmo) ... 73
xi
Şekil 5.27 12 st’lik çoğaltmada mikroorganizma derişiminin zamanla değişimi
grafiği ... 74
Şekil 5.28 Canlı mikroorganizma sayısının t=0 ve t=12 st’teki değerleri ... 74
Şekil 5.29 Deney Tasarımı-I için oksijen ve substrat derişiminin beta glukan verimine etkisi ... 77
Şekil 5.30 Deney Tasarımı-I için oksijen ve substrat derişiminin beta glukan verimine etkisinin yanıt yüzey grafiği ... 77
Şekil 5.31 Deney Tasarımı-I için oksijen ve substrat derişiminin substrat verimine etkisi ... 78
Şekil 5.32 Deney Tasarımı-I için oksijen ve substrat derişiminin substrat verimine etkisinin yanıt yüzey grafiği ... 78
Şekil 5.33 Deney Tasarımı-I için oksijen ve substrat derişiminin oksijen verimine etkisi ... 79
Şekil 5.34 Deney Tasarımı-I için oksijen ve substrat derişiminin oksijen verimine etkisinin yanıt yüzey grafiği ... 79
Şekil 5.35 Deney Tasarımı-II için oksijen ve substrat derişiminin beta glukan verimine etkisi ... 82
Şekil 5.36 Deney Tasarımı-II için oksijen ve substrat derişiminin beta glukan verimine etkisinin yanıt yüzey grafiği ... 82
Şekil 5.37 Pilot ölçekli biyoreaktörde mikroorganizma kütlesinin zamanla değişimi ... 84
Şekil 5.38 Pilot ölçekli biyoreaktörde çoğalma boyunca glikoz tüketimi değerleri ... 84
Şekil 5.39 Pilot ölçekli biyoreaktörde oksijen mol miktarının zamanla değişimi ... 85
Şekil 5.40 Pilot ölçekli biyoreaktörde beta glukan verimleri (g yaş bg/g kmo) ... 85
Şekil 5.41 Ekstraksiyon sonucu elde edilen ve ticari beta glukanın FTIR spektrumları ... 87
xii
ÇİZELGELER DİZİNİ
Çizelge 3.1 Saccharomyces cerevisiae’nin taksonomik hiyerarşisi ... 9
Çizelge 4.1 Katı besi ortamı bileşimi ... 30
Çizelge 4.2 Oksijen besleme profilleri tablosu ... 44
Çizelge 4.3 Deney tasarımı-I için faktör düzeyleri ... 47
Çizelge 4.4 Deney tasarımı-II için faktör düzeyleri ... 48
Çizelge 5.1 Çeşitli seyreltme oranları için mikroorganizma ekiminden 24 st sonraki koloni sayıları ... 51
Çizelge 5.2 Ön çoğaltmada iki farklı aşılama türü kullanılarak çoğaltılan mikroorganizmaların derişimleri (Cs0=20 g/L, T=34.7 °C, pH=4.8, N=150 rpm, t=8 st) ... 58
Çizelge 5.3 Ön çoğaltmada iki farklı aşılama türü kullanılarak mikroorganizma çoğaltmada t=0 st ve t=8 st için canlı mikroorganizma sayıları ... 59
Çizelge 5.4 Ön çoğaltmada iki farklı aşılama türü kullanılarak mikroorganizma çoğaltmada t=8 st’te glikoz derişimleri ... 59
Çizelge 5.5 Ön çoğaltmada iki farklı aşılama türü kullanılarak mikroorganizma çoğaltmada beta glukan verimleri (Cs0=20 g/L, T=34.7 °C, pH=4.8, N=150 rpm, t=8 st) ... 60
Çizelge 5.6 Çeşitli havalandırma profillerinde elde edilen beta glukan verimleri ... 61
Çizelge 5.7 Kesikli oksijen beslemesi için beta glukan verimi ... 63
Çizelge 5.8 Aralıklı oksijen besleme (AB) profilleri ... 66
Çizelge 5.9 Aralıklı oksijen besleme profilleri için beta glukan verimleri ... 66
Çizelge 5.10 Aralıklı oksijen besleme profilleri için t=8 st için besi ortamındaki glikoz derişimleri (Cs0=20 g/L, T=34.7 °C, pH=4.8, N=150 rpm, t=8 st) ... 66
Çizelge 5.11 25 mL’lik kesikli ve aralıklı oksijen beslenen biyoreaktörlerde besleme koşulları ... 68
Çizelge 5.12 50 mL’lik kesikli ve aralıklı oksijen beslenen biyoreaktörlerde besleme koşulları ... 71
Çizelge 5.13 12 st’lik çoğaltmada t=12 st’te glikoz analizi sonuçları ... 75
Çizelge 5.14 12 st’lik çoğaltmada beta glukan verimi değerleri ... 75
Çizelge 5.15 Deney Tasarımı-I koşulları ve sonuçları ... 76
Çizelge 5.16 Deney Tasarımı-I’in beta glukan verimi için ANOVA sonuçları ... 80
Çizelge 5.17 Deney Tasarımı-II koşulları ve sonuçları ... 81
Çizelge 5.18 Deney Tasarımı-II’in beta glukan verimi için ANOVA sonuçları ... 83
1 1. GİRİŞ
Beslenme ve beslenme şeklinin sağlığa etkisi ile ilgili yapılan son dönemdeki çalışmalarda; besinlerin metabolik aktivitelerimiz için makro ve mikrobesleyiciler hariç sağlık üzerinde olumlu etkileri olan çeşitli bileşenleri de içerdikleri görülmüş ve bu bileşenlerin insan sağlığında oluşabilecek problemleri giderebildiği veya ortaya çıkabilecek bazı hastalıkları engellediği bilimsel olarak ispatlanmıştır. Bu çalışmalarla, artan farkındalıkla birlikte insan sağlığının korunmasında beslenme desteğinin önemi artmış ve bu amaçla doğal, organik, katkısız, çeşitli fonksiyonel besinler ve sağlık ürünleri daha fazla tüketilmeye başlanmıştır. Düzenli fonksiyonel besin tüketiminin kanser ve kardiyovasküler rahatsızlıklardan korunma ve tedavisinde etkili olduğu;
gastrointestinal sistemin sağlığının korunması, menopoz semptomlarının hafifletilmesi, göz sağlığının korunması gibi çeşitli birçok alanda da etkili olduğu görülmüştür (Coşkun 2005). Bu fonksiyonel besinlerden biri olan ve hemen hemen içerisinde bulunduğu gıdalarla insan sağlığına ciddi olumlu etkileri olan beta glukan, son dönemlerde kullanılan ve çok fazla araştırma yapılan, ayrıca çeşitli ülkelerin teşvik sağladığı bir gıda takviyesidir.
Beta glukan, FDA (Food Drug Administration) ve EFSA (European Food Safety Administration) tarafından onaylı olan, herhangi bir yan etkisi olmayan bir gıda takviyesidir. Beta glukan çeşitli tahılların (yulaf, buğday, arpa vb.) hücre çeperlerinde, alg, maya (Saccharomyces cerevisiae vb.), bakteri (Alcaligenes faecalis vb.) ve mantarların (Candida albicans, Aspergillus fumigatus vb.) hücre duvarlarında bulunan bir polisakkarittir. Elde edildiği kaynağına göre beta glukan yapıları değiştiği gibi, insan sağlığına etkileri de değişiklik göstermektedir. Örneğin; (1,3)-(1,6) bağlı beta glukanın bağışıklık sistemini aktive edici özelliği olduğu bilinmektedir. (1.3)-(1,4) bağ yapısında bulunan beta glukanın sindirim sistemini düzenleyici etkisinin olduğu bilinmektedir.
Hem insan sağlığına etkilerinin çok fazla olması, hem de mayaların ucuz temin edilip, kolayca çoğaltılabildiklerinden dolayı bu tez çalışmasında beta glukan kaynağı olarak Saccharomyces cerevisiae (ekmek mayası) kullanılmıştır.
2
Mikroorganizmaların hücre duvarı bileşimi ve yapısı, büyümesi ve çoğalması çoğaltıldıkları besi ortamındaki bileşenler, biyoreaktör işletim türü gibi çoğalma koşullarına ciddi bir biçimde bağlıdır. Mayanın çoğaltıldığı ortamın havalandırma koşulları, sıcaklık, pH, karbon kaynağı gibi parametreler maya hücre gelişiminde, hücre duvarındaki polisakkarit bileşiminde ve maya kuru kütlesinde önemli bir etkiye sahiptir.
Maya hücre duvarı materyali olan beta glukan veriminin arttırılması amacıyla mikroorganizma çoğalma koşullarının belirlenmesi büyük bir önem taşımaktadır.
Bu yüksek lisans tez çalışmasında, fakültatif bir mikroorganizma olan Saccharomyces cerevisiae çoğaltılan bir biyoreaktörde, hücre büyümesi ve çoğalmasında başlıca etkili olan oksijen ve substrat derişiminin maya derişimi ve beta glukan verimine etkilerinin incelenmesi amaçlanmıştır. Öncelikle Saccharomyces cerevisiae mayasının çoğaltıldığı son ölçek büyütme adımında santrifüjlenen maya hücreleri taze besi ortamına aktarılarak santrifüjlemenin mikroorganizma derişimine ve beta glukan verimine etkisi incelenmiştir.
Çalışmanın sonraki basamağında oksijen derişiminin mikroorganizma derişimine ve beta glukan verimine etkisi incelenmiştir. Bu amaçla, 50 mL’lik besi ortamı içeren 100 mL’lik biyoreaktörlere tepe boşluğu hacmi göz önünde bulundurularak farklı derişimlerde (maksimum 50 mL, 204.6 mmol) kesikli oksijen beslemeleri yapılarak mikroorganizma derişimi, canlı mikroorganizma sayısı, beta glukan verimi, glikoz derişimi ve oksijen derişiminin zamanla değişimleri incelenmiştir. Saf oksijen gazı, belirlenen derişimlerinde biyoreaktörlere farklı profillerde aralıklı (intermittent) beslenerek maya derişimi ve beta glukan verimi açısından incelemeler yapılmıştır.
Biyoreaktörlere oksijenin aralıklı beslenmesiyle oluşturulan profillerin beta glukan verimi üzerine etkisinin olmadığı değerlendirilmiştir. Bu nedenle oksijenin aralıklı beslenmesi yerine kesikli beslenmesi uygun görülüp çalışmalara bu kapsamda devam edilmiştir.
Mikroorganizmanın derişimi ve beta glukan verimine glikoz ve oksijen derişimlerinin ikili etkileşimlerini incelemek üzere deneysel çalışmalar gerçekleştirilmiştir. Bu amaçla;
3
birden çok proses değişkeninin (faktör) yanıtlar (response) üzerine etkilerini eş anlı ortaya koyabilen deneysel tasarıma dayalı istatistiksel optimizasyon yöntemi olan Tam Faktöriyel Tasarım (Full Factorial Design) kullanılmıştır. Beta glukan, substrat ve oksijen verimlerinin yanıt değişkenleri olduğu proseste optimum glikoz ve oksijen derişimleri belirlenmiştir. Tasarım deneylerinin sonuçlarına bakıldığında; en yüksek derişimde (200 g/L) beslenen glikozun mikroorganizma çoğalması üzerindeki inhibe edici etkisi tam olarak gözlenmemiştir. En yüksek beta glukan verimi ise en yüksek oksijen derişimi (50 mL oksijen) ve en yüksek glikoz derişiminde (200 g/L glikoz) belirlenmiştir.
Çalışmanın son adımında deney tasarım matrisindeki merkez nokta koşuluna karşılık gelen oksijen (hava) ve glikoz derişimleri 5 L’lik çelik biyoreaktörde sağlanarak 1500 mL’lik çalışma hacminde maya çoğaltılarak mikroorganizma derişimi, substrat derişimi ve beta glukan verimi incelenmiştir.
Mayanın hücre duvarından alkali-asidik ekstraksiyon yöntemi ile elde edilen beta glukanın FTIR analizleri gerçekleştirilmiştir. Bu analizlerde ticari olarak piyasada bulunan beta glukan standardı ile deneysel çalışmalarda elde edilen beta glukanın FTIR spektrumları karşılaştırılarak, ekstraksiyonla elde edilen ürünün beta glukan olduğu teyit edilmiştir.
Bu yüksek lisans tez çalışmasında, Ankara Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Koordinasyon Birimi tarafından onaylanan 17H0443006 numaralı Hızlandırılmış Destek Projesi kapsamında alınan soğutmalı santrifüj cihazı ile deneyler gerçekleştirilmiştir.
4 2. KAYNAK ARAŞTIRMASI
Mager vd. (2002), Saccharomyces cerevisiae mayasının ozmotik stres koşulları altındaki davranışlarını incelemişlerdir. Mayalar yüksek yoğunluklu bir besi ortamında çoğaltılmıştır. Ozmotik stres altında protein üretim yollarındaki değişiklikler incelenmiştir. S. cerevisiae’ nin hiperosmolariteye yanıtları üç farklı aşamada gözlemlenmiştir. Bu yanıtlardan birincisi; fiziko-mekanik kuvvetlerin doğrudan değişiminin gözlemlenmesi. İkincisi; hareketi koruma, onarma ve hücreyi kurtarma için birincil koruma işlemleri. Üçüncüsü ise; yeni koşullar altında homeostasinin sağlanmasına izin verecek şekilde adaptif olayların gerçekleşmesi şeklindedir.
Freimund vd. (2003), sıcak alkali ve asit muameleleri ile yapılan izolasyon metotlarının beta glukan verimini azaltmasının yanında, yararlı etkilerin azalacağı yönde bir polimerik zincir bozunmasına sebep olduğunu düşünmüşlerdir. Beta glukan yapısındaki glikoz zincirlerinde herhangi bir bozunmaya yol açmayan, aşırı asidik ya da bazik olmayan pH’larda yeni bir ekstraksiyon yöntemi geliştirmişlerdir. Bu yeni ekstraksiyon yönteminde sağlığa yararlı bir yan ürün olan mannoprotein de kolaylıkla elde edilebilmektedir. Kullanılan maya hücre duvarının kalitesine bağlı olarak; yaklaşık olarak %92 saflıkta ve % 87’lik bir verimde 1,3-β-D glukan elde edilmiştir. İzledikleri ekstraksiyon yöntemi adımları;
Sulu çözelti hazırlama ve 125 °C sıcaklıkta 5 saat bekletme
Santrifüjleme işlemi ile süpernatant kısmın ayrılması (mannoprotein eldesi için ayrılan süpernatant kısmın %70’lik etanol ile muamelesi)
Proteaz enzimi ile kalan çözünür proteinlerin ayrıştırılması
Asetonla yıkama
Püskürtmeli kurutma yöntemi ile kurutma şeklindedir.
Elde edilen beta glukanların yapı analizleri NMR spektroskopisinde gerçekleştirilmiştir.
Ayrı kaynaklardan alınmış olan Saccharomyces cerevisiae hücre duvarının farklı beta glukan içeriğine sahip oldukları görülmüştür. Bu farklılığın mikroorganizmanın çoğalma koşullarının farklı olmasından kaynaklı olduğunu belirtmişlerdir.
5
Uscanga ve François (2003), Saccharomyces cerevisiae mayasının çoğalma ortamında farklı sıcaklık, pH, havalandırma koşulu, farklı karbon kaynağı gibi koşulların hücre duvarı bileşimine etkisini incelemişlerdir. Kesikli olarak işletilen 2 L’lik biyoreaktörde 1.5 L’lik çalışma hacminde çoğalma işlemleri gerçekleştirilmiştir. Karbon kaynağı olarak glikoz, mannoz ve sukroz kullanılmıştır. Analizlerden önce üstel çoğalma fazının başlarında santrifüjle mikroorganizmalar ayrılmıştır. Beta glukan, glikoz ve mannan içerikleri HPAEC yöntemi ile belirlenmiştir. pH’ın 4 olduğu, karbon kaynağının glikoz olduğu, sıcaklığın 37 °C olduğu durumda beta glukan üretimi maksimuma ulaşmıştır.
En yüksek beta glukan içeriğine; oksijen doygunluk değerinin %50’den yüksek olduğu (0.5 L/dk) DO değerinde ulaşılmıştır.
Crognale vd. (2006), yapmış oldukları çalışmada Botryosphaeria rhodina mikroorganizması ile çalışmış; kültür ortamı reolojisi ve oksijen transferi, beta glukan üretiminin karakterizasyonunu aydınlatmayı amaçlamışlardır. 3 L’lik biyoreaktörde, 28 C’de, 1.9 vvm havalandırma oranında ve % 5 (v/v) aktarım oranında çoğaltma işlemi 98 saat boyunca gerçekleştirilmiştir. Glukan hidrolitik enzimlerinin besi ortamı reolojik özellikleri etkilediği gözlemlenmiştir. En yüksek beta glukan verimini 0.15 g/L’den düşük azot konsantrasyonunda ve doygunluk derişiminin %25’i çözünmüş oksijen konsantrasyonunda elde edilmiştir. Çözünmüş oksijen ve azot derişimlerinin beta glukan üretimi ile ilişkili olduğu bulunmuştur.
Kim ve Yun (2006), Saccharomyces cerevisiae mayası farklı biyoreaktör işletim türlerinde çoğaltılmış ve işletim türünün beta glukan verimine, hücre duvarı bileşimine etkisini incelemişlerdir. Bunun için, 5 L’lik hacme sahip biyoreaktörde 2.5 L’lik çalışma hacminde, 30 °C sıcaklıkta ve 3.5 pH’ta kontrollü olarak mayalar çoğaltılmıştır.
Sıcak alkali ekstraksiyon yöntemiyle beta glukan izolasyonu sağlanmış ve beta glukan miktarı HPLC ile belirlenmiştir. Beta glukan içeriğinin en yüksek olduğu fazın durağan fazın başlangıç evrelerinde olduğunu görmüşlerdir. En yüksek beta glukan verimine ise yarı-kesikli işletim türünde ulaşılmıştır.
6
Gibson vd. (2007), bira üretim proseslerinde Saccharomyces cerevisiae mayasının hangi stres koşullarına, nasıl cevaplar verdiğini incelemişlerdir. Mayalarda oluşan genel stres cevaplarını; çözünmüş oksijen konsantrasyonu, pH, sıcaklık, ozmolarite, etanol derişimi, besin kaynağı değişimi gibi şartların aktive ettiği görülmüştür. Maya suşlarının fermantasyon performansı, bu değişimlere adapte olma yeteneklerine bağlıdır.
Adaptasyon yetenekleri sadece fermantasyon işleminde değil, ön çoğalma ve depolama aşamalarında da önemlidir. Ön çoğalma gerçekleşirken; ozmotik strese verilen cevap azalırken, fermantasyon işlemi başlangıcında ozmotik strese verilen cevap ani artış gösterir, üstel çoğalma fazında azalarak biter. Oksidatif stres ise ön çoğalma adımında önemli olurken, üstel faza geçilirken azalır. Üstel fazdan durağan faza geçişte etanol stresi oluşmaya ve mikroorganizmadan yanıt gelmeye başlar. Depolama esnasında etanol ve soğuk şoku cevapları en yüksek seviyede olmaktadır.
Navarrete vd. (2009), Debaryomyces hansenii mayasının oksidatif stres koşulları altında nasıl bir davranış gösterdiğini incelemişlerdir. Kadmiyum klorür, hidrojen peroksit ve DTT kullanılarak oksidatif stres koşulları yaratılmıştır. Saccharomyces cerevisiae (W303.1A) mayası referans olarak kullanılmıştır. Debaryomyces hansenii mayasının bu koşullara daha dayanıklı olduğu gözlemlenmiştir.
Shokri vd. (2009), yapmış oldukları çalışmada Saccharomyces cerevisiae’den elde edilen beta glukanın ekstraksiyonu ve saflaştırılması için optimum bir prosedür geliştirmişlerdir. İlk olarak SDA ortamında ön çoğaltma adımı gerçekleştirilmiş ve YPG ortamında da inkübe edilmiştir. Çoğaltılmış olan maya hücrelerini besi ortamından ayırdıktan sonra sonikasyon yöntemi ile parçalamışlardır. Daha sonra da alkali ekstraksiyon işlemiyle çözünür beta glukanı elde etmişlerdir. Alkali-asit ektraksiyonunda %2’lik sodyum hidroksit ve %3’lük asetik asit çözeltileri ile ekstraksiyon işlemi gerçekleştirilmiştir. Kromatografik yöntemlerle protein ve mannan uzaklaştırılmıştır. Bütün bu işlemler sonucunda, maya hücresinden elde edilen beta glukanın düşük verimde elde edilmesinin, hücre parçalama yöntemine ve kullanılan maya suşuna bağlı olduğunu tespit etmişlerdir.
7
Ren vd. (2010), 1.5 L’lik biyoreaktörde yarı kesikli fermantasyon ile Schizochytrium sp.
mikroorganizmalarından elde edilen DHA’nın üretim performansı üzerinde havalandırmanın etkisi incelenmiştir. Havalandırma ve fermantasyon özelliklerini anlayabilmek adına, spesifik büyüme hızı, glikoz tüketim oranı, lipit verim katsayısı gibi parametrelerle havalandırma koşulları ve fermantasyon karakteristikleri arasındaki ilişkiyi anlamaya çalışmışlardır. Tüm kullanılan parametrelerden elde edilen bilgilere dayanarak, kademeli havalandırma kontrol yöntemi önerilmiştir. Havalandırma miktarı, ilk 24 saat için 0.4 vvm, sonraki 96 saat için 0.6 vvm ve fermantasyon sonuna kadar tekrar 0.4 vvm ile kontrol edilmiştir. Bu havalandırma profilinde en yüksek hücre yoğunluğu (71 g/L), en yüksek lipit içeriği (35.75 g/L) ve en yüksek DHA yüzdesine (%48.95) ulaşılmıştır. Bu sayede, DHA verimliliği de 119 mg/L.h’e ulaşmıştır.
Yılmaz (2010), atık ekmek mayasında farklı koşullarda uygulanan beta glukan ekstraksiyonu ve saflaştırılmasının beta glukan verimine etkisi üzerine araştırma yapmıştır. Çeşitli NaOH derişimleri, ekstraksiyon sıcaklıkları, süreleri ve yıkama sayılarında çalışmalar yaparak beta glukan saflığının değiştiğini tespit etmiştir. Beta glukan saflığının; alkali ekstraksiyonda kullanılan NAOH derişimine, ekstraksiyon şartlarına (sıcaklık ve süre) bağlı olarak değişebileceğini ifade etmiştir.
Kang vd. (2012), Saccharomyces cerevisiae mayasını farklı stres koşulları altında çoğaltmışlardır. Normal (stressiz) koşullarda çoğaltılan maya ile stresli koşullarda çoğaltılan mayalardaki metabolitlerin iki boyutlu NMR spektroskopi ile analizleri yapılmış ve karşılaştırılmıştır. Protein profilleri ile uyarlanmış stres koşulları arasındaki ilişkiyi kanıtlamışlardır.
Borchani vd. (2014), S.cerevisiae’den elde edilen beta glukanın izolasyonunda alkali, asit ya da her ikisi de kullanılarak yapılan ekstraksiyon işlemlerinde polimerik zincirlerin bozunduğunu belirtmişlerdir. Yapmış oldukları bu çalışmada beta glukanın izolasyonu için enzimatik bir proses uygulamışlardır. Proteaz ve lipaz enzimlerinin kullanıldığı bu işlem sonucu elde ettikleri beta glukanın analizini enzimatik kit (Megazyme) kullanarak gerçekleştirmişlerdir. Beta glukanı %79 saflıkta elde
8
etmişlerdir ve verim hücre duvarı oranı üzerinden %18 olarak belirlenmiştir. Bu yöntem sonucunda elde edilen beta glukanın diğer kimyasal yöntemlere oranla daha yüksek verimde ve saflıkta olması sebebiyle, enzimatik yöntemin avantajlı olduğunu savunmuşlardır. Ayrıca ortaya çıkan sonuçlar her ekstraksiyon adımının beta glukanın kimyasal özellikleri üzerine önemli bir etkisi olduğunu göstermiştir.
Pengkumsri vd. (2016), Saccharomyces cerevisiae’nin 9 ayrı suşuyla ve farklı ekstraksiyon yöntemleriyle çalışarak beta glukan üretim verimini arttırmayı hedeflemişlerdir. NaOH/HCl ekstraksiyonu, NaOH/CH3COOH ekstraksiyonu, NaOH/NaClO ekstraksiyonu ve NaOH-NaClO/DMSO ekstraksiyonu olmak üzere dört
ayrı şekilde ekstraksiyon işlemi gerçekleştirilmiştir. Daha sonra beta glukan yapıları FTIR spektroskopi cihazıyla analizlenmiştir. Beta glukan miktarının ve kalitesinin en
yüksek olduğu ekstraksiyon yönteminin NaOH/CH3COOH yöntemi olduğu belirtilmiştir.
9 3. KURAMSAL TEMELLER
3.1 Maya Yapısı ve Çoğalması
Mayalar tarihte ilk olarak MÖ. 6000-2000’li yıllarda Sümerler, Babiller, Mısırlılar ve Gürcüler tarafından kullanılmıştır. Sümerler ve Babiller alkol fermantasyonu (bira yapımında), Mısırlılar ekmek yapımında ve Gürcüler ise şarap yapımında kullanmışlardır. 1680 yılında van Leeuwenhoek tarafından yapılan çalışmalar sonucu maya hücre yapısının mikroskobik olarak incelenmesi ve 1837 yılında Meyen’in ilk olarak malt mayasına Sacharomyces cerevisiae adını kullanması üzerine çalışmalar daha da genişletilmiş olup; günümüzde biyoteknolojik çalışmalar yapılarak mayanın genetik özelliklerinin değiştirilmesine çalışılmaktadır (Walker 1999).
İnsanoğlu her yıl fungus alemine ait yeni bir mikroorganizma türü bulmasının yanında maya türünün biyoçeşitliliğinin sadece bir kısmı belirlenebilmiştir. Günümüze değin yaklaşık 700 kadar maya türü bulunmakla beraber, bu lisansüstü çalışmasındaki deneyler Saccharomyces cerevisiae mayası ile gerçekleştirilmiştir. Çizelge 3.1’de Saccharomyces cerevisiae mayasının taksonomik hiyerarşisi görülmektedir (Walker 1999).
Çizelge 3.1 Saccharomyces cerevisiae’nin taksonomik hiyerarşisi
Alem Fungi
Şube Ascomycotina
Familya Saccharomycetaceae Alt familya Saccharomycetoideae
Cins Saccharomyces
Tür Saccharomyces cerevisiae
Maya hücre yapısı karmaşık ve küresel, hücre büyüklüğü yaklaşık 5-8 µm olan ökaryotik bir canlıdır. Hücre büyüklüğü mayanın çoğaldığı kültür bileşenlerine, çevresel koşullara direkt olarak bağlıdır (Pamir 1985). Dahil olduğu fungi alemi; küf mantarları,
10
mayalar ve şapkalı mantarlar olmak üzere üç ana grupta incelenmektedir (Pekin 1979).
Maya hücreleri de bitki hücreleri gibi hücre çeperi (duvarı), çekirdek ve sitoplazmadan oluşmaktadır.
Polisakkarit yapıda (beta glukan, kitin vb.) hücrelerine sağlamlık ve bütünlük sağlayan hücre çeperleri (hücre duvarı) bulunmaktadır. Örneğin; ekmek mayasının hücre duvarı mikroorganizmanın en önemli organeli olmasının yanında, araştırmacılar tarafından en çok inceleme yapılan organelidir. Hücre duvarının %80-90’ı proteinlerle bütünleşik durumda olan karbonhidratlardan oluşmaktadır. Gelişmiş bir maya hücresinde, mayanın kuru hücre ağırlığının % 15-25’i hücre duvarını oluşturmaktadır.
Şekil 3.1 Maya hücre duvarındaki bileşikler ve dizilişleri (Boulton ve Quain 2001)
100 g ekmek mayasının elementel analizi sonucu ampirik formülü
“C47H6.3O33N8P1.2Tuzlar4.5” şeklindedir. Fakat bu formül her zaman geçerli değildir. Bu oranlar maya suşuna, maya yaşına ve çoğalma koşullarına bağlıdır. Maya hücresinin başlıca yapı taşı karbon, hidrojen, oksijen, azot, fosfor ve kükürttür. Ayrıca inorganik iyonlar, çeşitli tuzlar ve hücrede fonksiyonel görevleri olan eser miktarda çeşitli elementleri de içermektedir (Walker 1999).
11
Maya türleri eşeyli ve/veya eşeysiz olarak çoğalabilmektedir. Eşeysiz olarak;
tomurcuklanma, sporla, bölünme ile çoğalmaktadırlar (Pamir 1985). Saccharomyces cerevisiae tomurcuklanma ile kolaylıkla çoğalmaktadır. Çoğalma yöntemi ise uç verme ya da hücre bölünmesi halinde gerçekleşir. Deneysel çalışmada S. cerevisiae mayasının kullanılmasının bir diğer sebebi ise mikroorganizmanın laboratuvar ortamında kolaylıkla çoğalabilmesidir.
3.2 Mayaların Endüstriyel Uygulamaları
Bölüm 3.1.’de de bahsedildiği üzere, insanoğlu milattan önceki dönemlerde de mayaları; alkol yapımı ve ekmek yapımında kullanmışlardır. Zamanla süt sığırcılığı yapılan bölgelerde de ekşitilmiş mamüller, peynircilik (küflü peynirler vb.) de gelişmiştir. 2003 yılında dünya üzerinde üretilen maya miktarı 2.5 milyon tonu geçmiştir (Borchani 2014). Maya biyoteknolojisi geliştikçe aşağıdaki endüstrilerde çalışmalar giderek hız kazanmaktadır (Walker 1999).
Fermantasyon Endüstrileri (mayalama, biyoetanol üretimi, yeni geliştirilen fermantasyon ürünleri)
Gıda/Kimyasal Endüstriler (lezzetlendiriciler, asitlik düzenleyiciler, iştah açıcılar, kimyasal indirgeyiciler)
Çevresel Teknolojiler (biyoremediasyon, atıkları değerlendirme, bitki koruma, metallerin biyosorpsiyonu)
Biyomedikal Araştırmalar (Kanser ve AIDS gibi hastalıklar, ilaç
metabolizmaları, genotoksisite görüntülenmesi, insan kalıtsal hastalıkları)
Sağlık Hizmetleri Endüstrisi (İlaçlar, aşılar, probiyotikler, hormonlar, kan faktörleri)
Temel Biyolojik Araştırmalar (hücre biyolojisi, genetik, biyokimya, moleküler biyoloji)
12 3.3 Beta Glukanın Yapısı ve Kaynakları
Beta glukan D-glikoz monomerlerinin beta glikozidik bağlarla birbirine bağlı olduğu doğal bir polisakkarittir. Genel formülü (C6H10O5)n olmakla beraber, beta glukanın OH- grubunun pozisyonu farklı beta glukan türlerini oluşturmaktadır. Doğada beta glukan doğrusal, zincirli ya da dallanmış yapılarda bulunmaktadır. Bazı beta glukan türleri;
β-(1,2) glukan, β-(1,3) glukan, β-(1,3)-(1,6) glukan, β-(1,2)-(1,3) glukan, β-(1,3)-(1,4) glukan vb. şekillerde bulunabilmektedir (Rahar vd. 2011).
Bu polisakkaritler; yulaf, arpa, buğday, çavdar gibi tahıllar ve deniz yosunu gibi çeşitli bitkiler tarafından üretilebildiği gibi mikroorganizmalar tarafından da üretilebilmektedir (Bacic vd. 2009). Beta glukan içeriği açısından mayalar diğer kaynaklara göre daha zengin olduğundan ticari beta glukan üretiminde tercih edilirler. Örneğin beta glukan içeriği yulaf ve arpada kuru ağırlık üzerinden % 2-7, diğer tahıllarda % 0.1-3.8 aralığında değişmektedir (Vatandoust 2012). Mayalar ise hücre kuru kütlesinin % 11- 18’i kadar beta glukan içerebilmektedir (Manners 1975, Kim ve Yun 2006).
Beta glukanlar bazı patojenik bakterilerin (Pneumocystis carinii, Cryptococcus neoformans, Aspergillus fumigatus, Histoplasma capsulatum, Candida albicans vb.) ve fungi alemi canlılarının (Saccharomyces cerevisiae vb.) hücre duvarı bileşenidir. Fungi hücre duvarının ana bileşenleri polisakkaritler ve glikoproteinlerdir. Örneğin;
Saccharomyces cerevisiae hücre duvarı üç tabakadan oluşmaktadır. İç tabakanın % 30- 35’i suda çözünemeyen beta glukandan, orta tabakanın %20-22’si suda çözünebilen beta glukandan ve dış tabakasının %30’u ise glikoproteinden oluşmaktadır (Akramienê vd. 2007). Hücre duvarı dış katmanı, glikozile edilmiş mannoproteinlerden oluşmaktadır. Bu yapı; periplazmik proteinleri korur ve yabancı enzimlerin hücreye erişebilirliğini sınırlamaktadır. İç katman; beta glukan ve kitinden meydana gelmektedir. β-(1,3) glukan ve kitin plazma membranına bağlı olan enzim kompleksleri ile β-(1,6) glukan ise endoplazmik retikulumda sentezlenir ve hücre dışında işlenir.
Durağan faza geçmiş bir mayanın beta glukan yapısı yaklaşık olarak 1500 glikoz monomerinden oluşmaktadır (Yiğit ve Benli 2005).
13 a.
b.
c.
Şekil 3.2 Çeşitli beta glukan yapıları
a. β-(1,3)-(1,6) glukan yapısı, b. Halkalı β-(1,3)-(1,6) glukan yapısı (13 tane glikoz molekülü ile), c.
Halkalı β-(1,2) glukan yapısı (noktalı çizgiler hidrojen bağlarını göstermektedir).
14
Şekil 3.3 S.cerevisiae hücre duvarı materyalleri, beta glukan çeşitleri ve dizilişleri (Zechner-Krpan vd. 2009)
S. cerevisiae’da bulunan glukanın yaklaşık olarak %85’i β-(1,3) glukan, %3’ü β-(1,6) glukandan oluşmaktadır (Kim ve Yun 2006). Beta glukanın yan dalları hücre duvarının ara katmanında bulunur (Şekil 3.3) ve hücrenin rijitliğini ve şeklini korumasını sağlar (François vd. 2003).
Beta glukanların çözünürlüğü polimerizasyon derecesi ile alakalıdır. Beta glukanın polimerizasyon derecesi 100 DP’den büyük olduğunda suda çözünmemektedir (Ali 2009).
Farklı kaynaklardan elde edilen beta glukanın fiziksel, kimyasal ve sağlık üzerine etkilerinin farklı olması, temelde beta glukanın bu kaynaklarda farklı molekül yapısı ve dallanma şekillerinde bulunmasındandır. Agrobacterium sp., Bacillus sp., Euglena gracilis gibi türlerin yapısında lineer β-(1,3) glukan; Saccharomyces cerevisae, Candida albicans gibi türlerde bulunan beta glukan dallanmış β-(1,3)-(1,6) glukan; Hordeum vulgare, Avena sativagibi türlerde lineer β-(1,3)-(1,4) glukan; Laminaria sp., Schizophyllum commune gibi türlerde de lineer β-(1,3)-(1,6) glikozil glukan
15
bulunmaktadır (Bacic vd. 2009, Zechner-Krpan vd. 2009). Saccharomyces cerevisiae kaynağından elde edilen β-(1,3)-(1,6) glukan; parazit oluşumunu engelleyici, bakteri oluşumunu önleyici, virüs çoğalmasını inhibe edici, antifungal, antimutajenik, tümör oluşumunu engelleyici, hematopoetik uyarıcı özelliklere sahiptir. Candida albicans kaynağından elde edilen β-(1,3)-(1,6) glukanın immün sistemi uyarıcı aktivite gösterdiği belirlenmiştir. Poria cocus kaynağından elde edilen β-(1,3)-(1,6) glukanın antitümoral etkisi olduğu görülmüştür. Yulaftan ekstrakte edilen β-(1,3)-(1,4) glukanın antimikrobiyal, antiparazitik; arpadan elde edilenin ise antimutajenik olduğu görülmüştür (Mantovani 2008). Beta glukanların klinik araştırma çalışmaları günümüzde de yoğun şekilde devam etmektedir. Bugüne kadar yapılan çalışmalarda dallanmış yapıda olan β-(1,3)-(1,6) glukanın insan sağlığı üzerine etkisinin çok kapsamlı olduğu görülmüştür. Bu bağlamda; sağlığa olan etkileri ve düşük üretim maliyetleri açısından Saccharomyces cerevisiae mayası bu yüksek lisans çalışmasında beta glukan kaynağı olarak seçilmiştir.
3.4 Beta Glukanın Kullanım Alanları
Beta glukanlar; sağlık, ilaç, gıda, kozmetik, kimyasal endüstrilerinde, hayvancılık, besicilik ve veterinerlik gibi sektörlerde çok ciddi bir potansiyele sahiptir (Zhu vd.
2016).
Sağlık sektöründe her alanda beta glukanla ilgili çalışmalar sürmektedir. Beta glukan;
bağışıklık arttırıcı, antikarsinojenik, antimikrobiyal, antienfektif, yara iyileştirici, kan şekeri düzenleyici, kolesterol ve trigliserit düşürücü, radyoaktif koruyucu, sindirimi düzenleyici, kalp hastalıkları riskini azaltıcı, alerjik rinit standart tedavisine ek olarak destekleyici, tüberküloz enfeksiyonunu tedavi edici, menopoz semptomlarının azaltıcı ve osteoporoz önleyici bir gıda takviyesidir (Coşkun 2005, Kırmaz vd. 2005, Akramienê vd. 2007, Mantovani vd. 2008). Çin ve Japonya’daki kliniklerde immün sistem için beta glukan aktif olarak kullanılmaktadır (Ali 2009). Amerika Birleşik Devletleri’nde FDA tarafından hiperkolesterol tedavisi amacıyla yapılan beta glukan patentleri desteklenmektedir.
16
Gıda sektöründe de sağlıkla paralel olarak dünyadaki obezite problemleri için çeşitli otoriteler ve kurumlardan insanları beta glukana teşvik edici açıklamalar yapılmıştır.
FDA, EFSA, IDF gibi kuruluşlar; lif desteği olarak, yüksek kolesterolü düşürdüğü, sindirim sistemini düzenlediği, kan şekerini dengelediği dolayısıyla da kardiyovasküler hastalık riskini azalttığı için beta glukan tüketimini desteklemektedir. Sağlık açısından faydalı olması için; EFSA tarafından önerilen günlük tüketilmesi gereken minimum beta glukan miktarı 3 g’dır (Cloetens vd. 2012). Ayrıca; bisküvilerde, kurabiyelerde, süt ve süt ürünlerinde, mayonezlerde, sirkelerde kullanılmaktadır (Zechner-Krpan vd.
2009).
Kozmetik sektöründe özellikle hücre yenileyici özelliğinden dolayı beta glukan içerikli kremler bulunmaktadır. Yapılan çalışmalarda; epidermis hücrelerini yenilediği, yaşlılık etkilerini geciktirdiği, cilde esneklik kattığı görülmüştür (Yılmaz 2010). Birçok marka beta glukan içerikli serumlar, saç kremleri, vücut losyonları, cilt maskeleri gibi ürünleri piyasaya sürmüşlerdir.
Antibiyotiklerin hayvanlar ve dolayısıyla insanlar üzerindeki kötü etkileri sebebiyle hayvancılık sektöründe de beta glukan kullanılmaya başlanmıştır. Yapılan çalışmalarda hayvanlarda bağışıklık sistemi ve performans iyileştirmede etkili olduğu düşünülmektedir (Keser ve Bilal 2008).
3.5 Mayadan Beta Glukan Üretim Prosesi
Beta glukanın maya hücre duvarında kitin ve manoproteinlerle kovalent bağlarla bağlı olmasından dolayı izolasyonu için birtakım işlemler uygulanması ve analizlenmesi gerekmektedir. Bu aşama ile ilgili yapılan literatür çalışmalarında çeşitli ekstraksiyon yöntemleri kullanıldığı görülmüştür. Ekstraksiyon yöntemleri, sıcak alkali/asit veya her ikisinin birlikte uygulamalarını içermektedir (Fleet and Manners 1976, Jamas vd. 1986, Liu vd. 2006). Bu yüksek lisans çalışmasında, mikroorganizma hücre duvarından suda çözünemeyen beta glukan izolasyonu; Donsis’in 1993 yılına ait patenti uygulanarak gerçekleştirilmiştir.
17
Mayadan beta glukan üretim proses adımları; Saccharomyces cerevisiae mayası üretimi, maya hücre duvarının parçalanması, ekstraksiyon işlemleri, çeşitli yöntemlerle ayırma ve saflaştırma işlemleri ve en son olarak da kurutma işlemidir.
Biyoreaktörde Saccharomyces cerevisiae üretimi
Tüm canlı organizmalar gibi mikroorganizmalar da yaşantılarını devam ettirebilmek için besin ve dolayısıyla enerjiye ihtiyaç duymaktadır. Besi ortamında bulunan karbon kaynağı, azotlu bileşikler ve çeşitli mineraller mikroorganizmaların yaşam döngülerini sürdürebilmeleri için gerekli olan faktörlerdir. Mayaların solunum yapabilmeleri için oksijene de ihtiyaçları vardır. Eğer çoğalma ortamında yeterli oksijen yoksa maya etanol üreterek çoğalmaya devam eder. Ortamdaki etanol derişimi % 5’ in üzerine çıkarsa, etanol oluşumu maya gelişimi açısından toksik etki yaratır.
Maya çoğaltılacak olan biyoreaktöre beslenen oksijen miktarı, besi ortamındaki bileşenler (derişimleri, pH’ı vb.) önem arz etmektedir. Üretilecek mikrooganizmanın uygun şartlarda çoğaltılması, beta glukan üretim verimi açısından da önemli olduğu için yukarıda bahsedilen parametreler dikkatle belirlenip, o şartlarda çoğaltma işlemi gerçekleştirilmelidir.
Hücre duvarı parçalanması ve ekstraksiyon işlemi
Üretimi sağlanan maya hücrelerinin hücre duvarından beta glukan elde edilebilmesi için ekstraksiyon işlemi gereklidir. Ekstraksiyon işlemine başlamadan önce, ekstraksiyon işleminde kullanılacak olan kimyasalların hücreye nüfuz edebilmesi için mayaların hücre duvarlarının parçalanması gerekmektedir. Bu amaçla; ultrasonikasyon, katalitik otoliz (katalitik enzimlerle parçalama) ve homojenizasyon teknikleri kullanılmaktadır.
Ultrasonikasyonda şiddet ve süre önemlidir, homojenizasyon işleminde ise uygulama basıncı ve darbe sayısı önemlidir. Bu işlemler bittikten sonra hücreler artık mekanik olarak parçalanmış olup ekstraksiyon işlemine hazır hale getirilmiştir. Ekstraksiyon aşaması yapılan literatür araştırmaları sonucunda; ekstraksiyon amaçlı kimyasal, fiziksel
18
ve enzimatik metodlar yer aldığı görülmüştür. Yapılan çalışmalarda kullanılan ekstraksiyon yöntemleri aşağıda sıralanmıştır (Zhu vd. 2016).
Sıcak su ekstraksiyonu
Kızgın buhar ektraksiyonu
Sıcak alkali (NaOH, KOH) ekstraksiyonu
Sıcak asidik (HCl, HCOOH, H3PO4, CH3COOH) ekstraksiyonu
Sıcak alkali ve asidik ekstraksiyon
Enzim ekstraksiyonu
Reflüks ekstraksiyonu
Mikrodalga destekli ekstraksiyon (MAE)
Ultrasonik destekli ekstraksiyon (UAE)
Hızlandırılmış çözücü ekstraksiyonu (ASE)
Du ve arkadaşlarının 2014 yılında yapmış olduğu çalışmalarda MAE, UAE, ASE ve geri-akımlı ekstraksiyon yöntemleri karşılaştırılmıştır. Beta glukan ekstraksiyon veriminin en yüksek olduğu yöntem ASE yöntemi olarak görülmüştür.
Kimyasal uygulamaların çoğu yüksek sıcaklıklarda gerçekleştirilmektedir. Asidik ekstraksiyonda yapılan çalışmalarda önceden HCl çözeltisi kullanılmıştır. Ancak toksik etkisinden dolayı tıbbi uygulamalarda yararlanılan beta glukanın ekstraksiyonunda kullanılmasının sakıncalı olduğu görülmüştür.
Fiziksel izolasyonda; katalitik otoliz, plazmoliz, homojenizasyon gibi yöntemler kullanılmaktadır. Enzimatik olarak ise, doğal enzimler yoluyla yüksek verim ve saflıkta beta glukan elde edilebildiği görülmüştür (Freimund vd. 2006, Tangüler ve Erten 2006).
Enzimatik hidroliz işleminde %99 saflık oranına ulaşılabildiği de eklenmiştir (Zhu vd.
2016).
Günümüzde; hücre içi materyali uzaklaştırmak ve ekstraksiyonu sağlamak amacıyla süperkritik ekstraksiyon yönteminin yanında yaygın olarak PEF (Pulsed Electric Fields) yöntemi kullanılmaktadır.
19
Ayırma ve saflaştırma
Hücre duvarında yer alan protein, kitin ve yağın uzaklaştırılarak, beta glukanın daha saf eldesi amaçlanmaktadır. Bu amaçla süzme, santrifüj, diyaliz, ultrafiltrasyon, izoelektrikle çöktürme, enzim uygulamaları ve kromatografik yöntemler uygulanmaktadır. Literatürdeki çalışmalarda uygulanmış olan bazı kromatografik yöntemler; afinite, iyon değiştirme, kolon (Sephadex kolonu), jel filtrasyon kromatografisidir (Zhu vd. 2016).
Kurutma aşaması
Beta glukanların kullanılabilir forma gelebilmeleri, taşınabilmeleri ve depolanabilmeleri için kurutulmaları gerekmektedir. Bu amaçla uygulanan kurutma yöntemleri; açık havada kurutma, liyofilizasyon (dondurarak kurutma) ve püskürtmeli kurutmadır (Zechner-Krpan vd. 2009). Liyofilizasyon yönteminde ilk olarak numunenin içerisinde bulunan su dondurulur. Daha sonra buz haline gelmiş su, düşük basınçlı bir ortamda, sıcaklık artışı oldukça yüksek enerjide oldukları için doğrudan buharlaşır. Püskürtmeli kurutmada ise kurutulacak numune çok küçük damlacıklar halinde sıcak hava akımı içerisine gönderilerek çözeltinin buharlaşması sağlanır.
3.6 Beta Glukan Üretim Verimini Etkileyen Faktörler
Mikroorganizmanın aktif bir şekilde çoğalmasının sağlanması ve ekstraksiyon işlemlerinin belirli şartlarda uygulanması sonucunda en saf beta glukan elde edilebilir.
Literatürdeki çalışmalarda beta glukan verimleri elde ediliş yöntemlerine göre farklı şekillerde ifade edilmektedir. Bunlar; g beta glukan/g hücre, µg/mg, µg/mL, % (w/w) olarak verilebilir. Bu tez çalışması kapsamında beta glukan verimi; g kuru maya kütlesi başına, g yaş beta glukan kütlesi olarak hesaplanmış ve Eşitlik 3.1’de verilmiştir.
( )
( ) (3.1)
20
Beta glukan üretim verimi aşağıda detaylı olarak açıklanan maya çoğalması ve beta glukan ekstraksiyonunu etkileyen faktörlere bağlıdır.
3.6.1 Maya çoğalmasını etkileyen faktörler
Çoğalma koşulları aşağıda verilen parametrelere bağlı olarak maya gelişimini ve beta glukan yapısını (dallanma derecesi, bağlı olan glikoz monomer sayısı vb.) etkilemektedir.
Sıcaklık Etkisi: Mikroorganizma büyümesini en çok etkileyen, en önemli fiziksel parametrelerden biri sıcaklıktır. Hücre gelişimini, çoğalmalarını, çeşitli metabolik aktivite yol izlerini belirleyen önemli bir etkendir (Walker 1999). Mikroorganizma çoğaltılacak olan bir biyoreaktörde uygun bir sıcaklık söz konusu değilse;
mikroorganizmalar normal büyüme, gelişme ve çoğalma gibi yaşamsal faaliyetlerini gerçekleştiremeyebilirler. Laboratuvar şartlarında üretilen ya da endüstriyel olarak üretilen mayaların genel olarak optimum çoğalma sıcaklıkları 20-30 °C aralığında değişmektedir. Her mikroorganizmanın kendine özgü bir Tmin, Tmax ve Toptimum
sıcaklık değerleri vardır. Tmax değerleri maya türlerinde 20-50 °C arasında değişiklik göstermektedir. Örneğin; Saccharomyces cerevisiae mayasının Tmax değerleri 35-43
°C aralığındadır. Tmax değerleri türlere göre değişiklik gösterdiği gibi mayanın çoğalma ortamı faktörlerine (karbon kaynağı, oksijen derişimi, su ve etanol derişimleri) göre de değişiklik gösterebilmektedir. Yüksek sıcaklıklar mayalarda çeşitli enzimlerin salgılanmasına engel olabilir, hatta enzim yapılarının bozulmasına sebep olabilir. Yüksek sıcaklıklar mayaların hücre gelişimi olmadan çoğalmalarına sebep olmaktadır. Ayrıca besi ortamında ise çoğalma esnasında yüksek oranlarda alkol oluşmaktadır ve besi ortamında yüksek derişimlerde bulunan alkol miktarının maya çoğalmasını inhibe edici bir etkisi vardır (Uscanga ve François 2003).
pH: Mayaların çoğaldığı besi ortamı pH’ı hücre büyümesi ve hayatlarını sürdürebilmeleri için önemli bir faktördür. Mayalar genel olarak en iyi büyüme evrelerini 4.5-6.5 pH’ta göstermektedir (Lopez vd. 2009). Bazı maya türleri 3-8
21
pH’ta da çoğalabilmektedir (Walker 1999). Çoğalma esnasında ortamda oluşan karbondioksit ve ikincil metabolitler ortam pH’ını düşürmektedir. Besi ortamındaki pH düşüşünden mikroorganizmalar negatif yönde etkilenir ve çeşitli ürünlerin verimini etkiler (Morata ve Loira 2017). Besi ortamını asidik hale getirmek için organik asitler (asetik asit, laktik asit gibi) yerine asitler (hidroklorik asit, fosforik asit gibi) tercih edilmelidir. Çünkü organik asitlerin mikroorganizma büyümesini inhibe edici özellikleri, inorganik asitlere göre daha yüksektir (Walker 1999).
O2 derişimi: Mayalar fakültatif olarak adlandırılan; hem oksijenli hem de oksijensiz solunum yaparak çoğalan mikroorganizmalardır. Besi ortamında yeterli miktarda oksijen varsa, uygun havalandırma koşulları söz konusu ise; mikroorganizma çoğalması sonucu ortamda su ve karbondioksit oluşur. Besi ortamında oksijen bulunmadığı takdirde ise etil alkol ve karbondioksit artışı olmaktadır.
Havalı ortamda (mikroorganizma oksijenli solunum yapıyorsa);
C6H12O6 + 6O2 6CO2 + 6 H2O + 688 kcal (3.2)
Havasız ortamda (mikroorganizma oksijensiz solunum yapıyorsa);
C6H12O6 2C2H5OH+6CO2 + 6 H2O + 56 kcal (3.3)
Maya çoğaltılan biyoreaktöre beslenen hava ile ortama verilen oksijen, sıvı besi ortamında çözünerek mikroorganizmalar tarafından enerji üretmek için kullanılır.
Maya üretimi yapılırken uygun amaca yönelik bir yöntem seçilmelidir. Örneğin bira üretiminde oksijensiz solunum şartları sağlanmalı, maya üretiminde ise oksijenli solunum koşulları sağlanmalıdır (Yılmazer 2009).
Çözünmüş oksijen; aerobik fermantasyonlarda mikroorganizmaların besinleri kullanabilmeleri ve metabolik faaliyetlerini devam ettirebilmeleri için gerekli olan temel ve önemli bir substrattır. Oksijen suda kısmen çözündüğünden (oksijenin sudaki çözünürlüğü: 30 °C’ de 8 mg/L) sınırlayıcı substrat olabilir (Shuler ve Kargi
22
1992). Yüksek hücre derişimlerinde; oksijen tüketim hızı, oksijen sağlama hızından büyük olduğunda oksijen kısıtlaması ortaya çıkmaktadır.
Besi ortamındaki çözünmüş oksijen derişimi (DO), kritik değerin altına (doygunluk değerinin %5-10’u) düştüğünde, S. cerevisiae mikroorganizması
oksijensiz solunum yapmaya yani etanol üretmeye başlar. Ortamdaki etanol konsantrasyonu eğer % 5’in üzerindeyse, etanol mayalar için inhibe edici özelliktedir (Shuler ve Kargi 1992). Hacimsel olarak % 25 etanol içeren ortamda yaşayabilen bazı maya türleri de mevcuttur (Soyuduru 2007).
Çözünmüş oksijen derişimi ya da oksijen kısmi basıncı glikoliz (glikoz yıkılması) hızını düzenleyici bir etkiye sahiptir. Mikroorganizmanın anaerobik solunumdaki glikoz tüketim hızı, aerobik solunumdaki glikoz tüketim hızından daha fazladır.
Fermantatif şeker metabolizmasının, oksijen tarafından inhibe edilmesine “Pasteur Etkisi” adı verilmektedir. Çözünmüş oksijen derişiminin düşük olduğu durumlarda substrat tüketimi ve karbondioksit oluşum hızı azalır. Düşen glikoz tüketim hızı enzim yarışması teorisi ile açıklanmaktadır. Fermantasyon prosesinde glikoz eğer çok fazla ise Pasteur etkisi S. cerevisiae’de geçerliliğini yitirir (Walker 1999).
Ayrıca oksijenin mikroorganizma hücre duvarı ve hücre zarı oluşumunda önemli bir etkisi bulunmaktadır. Oksijen derişim farklılıkları mikroorganizma üzerinde strese sebep olmakta ve hücrelerde bu stres unsuruna karşı çeşitli adaptasyonlar görülmektedir (Gibson 2007). Oksijen stresine karşı göstermiş olduğu cevap yöntemleri hücre duvarı bileşenlerinin üretiminde de etkilidir. Örneğin; bira mayasında hücre zarı biyosentezini sağlamak için fermantasyondan önce oksijen gereksinimi vardır. Yeterli moleküler oksijenin sağlanamaması, hücre zarlarını etanol toksisitesine daha duyarlı hale getirecek ve bu da maya büyümesini ve mayanın fermantasyon kabiliyetini kısıtlayacaktır (Walker 1999).
23
Bu tez çalışması kapsamında istatistiksel deneysel tasarım deneylerinde yanıt olarak oksijen tüketimine bağlı beta glukan verimi de tanımlanmış, Eşitlik 3.4’te verilmiştir.
( )
(3.4)
Karbon kaynağı ve derişimi: Besi ortamında mikroorganizma gelişimine en büyük etkide bulunan, enerji kaynağı olarak da kabul edilen karbon kaynaklarıdır.
Genellikle maya üretiminde glikoz karbon kaynağı olarak kullanılmaktadır.
Mayaların kullanabildiği karbon kaynaklarının bazıları; fruktoz, galaktoz, maltodekstrinler, nişasta, metanol, etanol, gliserol, asetat, sitrat, oleatlar, fenoller, ürik asit, pentilamindir (Walker 1999). Mayadan hangi ürün elde edilmek isteniyorsa, substrat seçimi de o yönde olmalıdır. Örneğin; Saccharomyces cerevisiae mayasını verimli bir şekilde çoğaltmak ve iyi bir fermantasyon sağlamak amacıyla; glikoz, fruktoz, mannoz, galaktoz, sükroz ve maltoz şekerleri kullanılmalıdır. Eğer mayanın solunum yapması amaçlanıyorsa; etanol, asetat gibi karbon kaynakları kullanılmalıdır. Çeşitli çalışmalarda karbon kaynağı türünün maya çoğalmasına ve çeşitli hücre materyallerine etkisinin çok ciddi boyutlarda olduğu belirtilmiştir (Uscanga ve François 2003).
Karbon kaynağı derişiminin fazla olması mikroorganizmalarda inhibisyona sebep olmaktadır. Mikroorganizma çoğaltılan bir biyoreaktörde substrat derişiminin fazla olması, diğer bir deyişle mayaların aşırı şekere maruz kalması; ortamda oksijen olsa dahi mayaların oksijensiz solunum yapmasına ve etanol üretilmesine sebep olur. Bu etkiye “Crabtree Etkisi” adı verilmiştir (Walker 1999). Mikroorganizma üretmek amacıyla çalışılıyorsa, bu duruma dikkat edilmelidir. Bu etki Pasteur Etkisi’nin tersi olarak da adlandırılmaktadır. İnhibisyon sınırları maya türünden, substrat türüne değişiklik göstermektedir. Maya üretiminde, havalı koşullarda glikoz derişimi üst sınırının 200 g/L olduğu belirtilmektedir (Shuler and Kargi 1992).
