Okratoksin A doğada temel olarak Aspergillus ochraceus, A. carbonarius ve P.
verrucosum tarafından üretilmektedir. A. niger ve A. ochraceus ile ilişkili pek çok
türün de okratoksin A üretimine az da olsa katkısı bulunmaktadır (Iamanaka ve diğ., 2006). Tablo 3.1’de okratoksin A üreticisi olarak tanımlanan küfler, Tablo 3.2’de okratoksin A üreticisi bazı küflerin izole edildiği substratlar ve okratoksin A oluşturma potansiyelleri gösterilmiştir. Gıda maddelerinde ve yemlerde okratoksin A varlığı ürünlerin yetiştirildiği bölgenin iklim koşulları, konumu, mikotoksijenik küflerin varlığı ve bunların gelişme / toksin oluşturma koşullarına göre farklılık göstermektedir.
Tablo 3.1: Okratoksin A üreticisi küfler (Abarca ve diğ., 1994; Moss, 2000; FAO,
2001; Frisvad ve Thrane, 2002; Esteban ve diğ., 2004)
Aspergillus spp Penicillium spp. Aspergillus alliaceus Aspergillus awamori Aspergillus carbonarius Aspergillus foetidus Aspergillus melleus Aspergillus niger Aspergillus ostianus Aspergillus ochraceus Aspergillus petrakii Aspergillus sclerotiorum Aspergillus sulphureus Aspergillus terreus Penicillium chrysogenum Penicillium commune Penicillium cyclopium Penicillium nordicum Penicillium pallitans Penicillium purpurescens Penicillium varriabile Penicillium verrucosum
P. verrucosum, 0-31 °C arasında (optimum 21°C) ve minimum 0,80 su aktivitesinde
gelişirken toksin üretimi optimum 20°C’de ve minimum 0,86 su aktivitesinde gerçekleşmektedir (Pitt ve Hocking, 1997). P.verrucosum, Kuzey Avrupa ve Kanada gibi serin ve ılıman bölgelerde tahıl ürünlerinde hakim florayı oluşturmaktadır. Ancak ılıman ve tropik bölgelerde yetiştirilen ürünlerde yaygın değildir (Bucheli ve Taniwaki, 2002). Buğday ve arpada % 7’den fazla P. verrucosum kontaminasyonunun okratoksin A varlığıyla ilişkili olduğu belirtilmiştir (Lund ve Frisvad, 2003).
A. ochraceus, dumanlanmış ve tuzlanmış balık, soya fasulyesi, nohut, sert kabuklu
meyveler, biber ve kuru meyveler gibi kurutulmuş ve depolanmış gıdalarda yaygın olarak bulunmaktadır. A. ochraceus`un varlığının muhtemel OTA kontaminasyonunu
(optimum 24-31°C) arasında, minimum 0,77 (optimum 0,95 - 0,99 su aktivitesinde gelişme gösterir. Okratoksin A üretimi ise 12-37°C (optimum 31°C) arasında ve minimum 0,85 su aktivitesinde gerçekleşir (Pitt ve Hocking, 1997).
Tablo 3.2: Okratoksin A üreticisi bazı küflerin izole edildiği ürünler ve okratoksin A
oluşturma potansiyelleri
İzole edilen küf Ürünler P/T1 OTA üreten suş
sayısı (%) Kaynak
Siyah Aspergillus Siyah sultani üzüm */24 16/264 (6,1) Iamanaka ve diğ., 2006
Hurma */22 (68,4) Iamanaka ve diğ., 2006
Erik */21 28/84 (33,3) Iamanaka ve diğ., 2006 İncir */19 11/43 (25,6) Iamanaka ve diğ., 2006
A. alliaceus Üzüm (İspanya) 5/5600 5/5(100) Bau ve diğ., 2006 Üzüm (Portekiz) 1/1 (100) Serra ve diğ., 2005 Kuru incir tanesi 30/50000 6/6 (100) Bayman ve diğ., 2002
A. carbonarius Kuru üzüm 29/50 88/91 (96,7) Abarca ve diğ., 2003 Üzüm (İspanya) 144/5600 144/144(100) Bau ve diğ., 2006
Üzüm (Portekiz) 68/68 (100) Serra ve diğ., 2005 Üzüm (Brezilya) */50 8/32 (25) Da Rocha Rosa ve diğ., 2002
A. niger Taze çekirdek kahve */25 10/87(11,5) Urbano ve diğ. 2001 Üzüm (Arjantin) */50 8/48(17) Da Rocha Rosa ve diğ., 2002 Üzüm (Brezilya) */50 16/53(30) Da Rocha Rosa ve diğ., 2002
A.niger aggregate Kuru üzüm 29/50 1/167 (0,6) Abarca ve diğ., 2003 Üzüm (Portekiz) 23/571(4) Serra ve diğ., 2005 Üzüm (İspanya) 797/5600 8/797 (1,0) Bau ve diğ., 2006
A. melleus Üzüm (İspanya) 4/5600 2/4(50) Bau ve diğ., 2006 Kuru incir tanesi */50000 0/7(0) Bayman ve diğ., 2002
A. ochraceus Siyah sultani üzüm */24 8/10 (80,0) Iamanaka ve diğ., 2006
Üzüm (İspanya) 8/5600 4/8 (50) Bau ve diğ., 2006
Üzüm (Brezilya) */50 2/5 (40) Da Rocha Rosa ve diğ., 2002
Üzüm (Portekiz) 0/1 Serra ve diğ., 2005
Hurma */22 1/12(8,3) Iamanaka ve diğ., 2006 Erik */21 5/5 (100) Iamanaka ve diğ., 2006 Kuru incir tanesi 50/50000 0/7(0) Bayman ve diğ., 2002 Taze kahve çekirdeği */25 37/42(88,1) Urbano ve diğ., 2001
A. ostianus Üzüm (İspanya) 3/5600 3/3(100) Bau ve diğ., 2006
A. terreus Üzüm (Brezilya) */50 0/4 (0) Da Rocha Rosa ve diğ., 2002 *: Değer belirtilmemiş
1 :Pozitif örnek sayısı/Toplam örnek sayısı
Siyah renkli Aspergillus türleri, güneş ışığına dayanıklı olmalarından dolayı güneşte kurutulan üzüm, incir ve kahvede hakim florayı oluşturmaktadırlar. Kuru meyvelerin yüksek şeker konsantrasyonu ve düşük su aktivitesine sahip olmaları kserofilik olan
bu küflerin gelişimini desteklemektedir (Heenan ve diğ., 1998; Bucheli ve Taniwaki, 2002).
A. niger, ılıman bölgelerde tarlalarda ve depolarda yaygın olarak bulunmaktadır.
Küfün siyah sporları güneş ve UV ışığına karşı koruma sağladığından bu bölgelerde hakim florayı oluşturmaktadır. A. niger, tropik ve sıcak bölgelerde yaygın olmasına rağmen genellikle toksik değildir. A. niger, 6-47°C arasında optimum 35-37°C’de gelişebilir. Kserofilik bir küf olan A. niger’in 0,77 su aktivitesi ve 35°C’de geliştiği belirtilmiştir (Pitt ve Hocking, 1997). A. niger ’le ilişkili bir küf olan A. carbonarius tropik bölgelerdeki önemli okratoksin A üreticilerindendir. A. carbonarius’un 8- 41°C arasında optimum 32-35°C’de ve 0,90 su aktivitesinde gelişme gösterdiği ifade edilmiştir (Heenan ve diğ., 1998; Bucheli ve Taniwaki, 2002).
Ancak yapılan diğer çalışmalarda toksin oluşumu ve küf gelişimi için farklı optimum koşullar belirlenmiştir. Esteban ve diğ. (2004), Yeast Ekstrakt Sucrose Agar (YES) ve Czapek Yeast Ekstrakt Agar (CYA) besiyerinde Aspergillus niger var niger izolatlarının 10-45°C, A. carbonarius’un 10-40°C’de, A. foetidus’un 25-30°C arasında geliştiğini ifade etmiştir. A. niger var niger, A. awamori, A. foetidus ve A.
carbonarius tarafından okratoksin A üretimi sırasıyla 10-35°C, 15-30°C, 25-30°C ve
15-35°C ‘de gözlenmiştir. A. niger aggregate izolatlarının besiyerinde okratoksin A üretimi 15°C’de en yüksektir. A. carbonarius’un optimum 15-20°C’de okratoksin A oluşturduğu belirtilmiştir. 15°C’de maksimum okratoksin A oluşumu suşa bağlı olarak 10-30 gün inkübasyonda gerçekleşmektedir. Ancak daha yüksek sıcaklıklarda (20-35°C) 5. günde de yüksek miktarda okratoksin A varlığı tespit edilmiştir.
Su aktivitesinin etkisinin incelendiği çalışmalarda A. carbonarius suşlarının 15°C’de 0,94-0,99; 30 °C’de 0,86-0,99 su aktivitesinde CYA’da okratoksin A oluşturduğu belirlenmiştir (Esteban ve diğ., 2006a). A. niger aggregate izolatlarının ise 25°C’de 0,90-0,99 su aktivitesinde okratoksin A oluşturduğu saptanmıştır (Esteban ve diğ., 2006b).
Üzümden izole edilen A. carbonarius izolatlarının okratoksin A oluşturma özellikleri 0,96 su aktivitesinde 7-42°C arasında inkübasyonun 2, 4, 6, 8 ve 10. gününde sentetik üzüm suyu besiyerinde incelenmiştir. 10 gün inkübasyon sonunda 7 ve 42°C’de küf gelişimi gözlenmemiştir. Okratoksin A üretimi en fazla 20°C’de, daha sonra sırasıyla 25, 15, 30 ve 35°C’de gerçekleşmiştir. Yüksek sıcaklıklarda
belirtilmiştir. Okratoksin A üretimi 30°C’de 4. günde, 25°C’de 6. günde ve 15°C’de 10. günde maksimum seviyeye ulaşmıştır. 35°C’de okratoksin A oluşumu nadir olarak belirlenmiştir (Marin ve diğ., 2006).
Kahve çekirdeklerinde okratoksin A oluşumunun incelendiği çalışmada OTA’nın 0,99 su aktivitesinde 20-30°C’de oluştuğu, en yüksek birikimin 25°C’de olduğu tespit edilmiştir. Aynı çalışmada A. carbonarius’un kahvede 0,90 su aktivitesinin altında okratoksin A oluşturmadığı, 35°C’de ise çok düşük miktarda toksin ürettiği ifade edilmiştir (Joosten ve diğ., 2001).
İki ayrı çalışmada A. niger aggregate ve A. carbonarius tarafından okratoksin A üretimine pH’ın etkisi besiyeri ortamında 5-10 gün inkübasyon sonrasında incelenmiştir. Küf gelişiminin ve okratoksin A üretiminin pH 2-10 gibi geniş bir aralıkta gerçekleştiği belirtilmiştir. Ayrıca A. niger grubundaki küflerin 5. günde önemli miktarda okratoksin A ürettikleri ifade edilmiştir (Esteban ve diğ., 2005; Esteban ve diğ., 2006c).
A. carbonarius' un esas ortamı (major habitat) kuru üzümlerdir. Kuru üzümler
üzerine yapılan çalışmalar bu ürünlerin genellikle A. carbonarius, A. niger ve ilişkili türleri içeren siyah Aspergillus spp. ile kontamine olduğunu göstermiştir. Bununla beraber A. niger izolatlarının sadece % 1-2’sinin OTA üreticisi olduğu belirtilmiştir (King ve diğ., 1981; Heenan ve diğ., 1998; Abarca ve diğ., 2003).
Leong ve diğ. (2006a) yaptıkları çalışmada üzüm ve şarapta okratoksin A oluşumunda Aspergillus carbonarius’un esas etmen olduğunu belirlemişlerdir. A.
niger izolatlarının ise daha az sıklıkta toksin oluşturduklarını saptamışlardır. Ancak
Da Rocha Rosa ve diğ. (2002) Arjantin ve Brezilya’daki üzümlerde A. niger’in daha yüksek oranda okratoksin A üreticisi olduğunu belirlemiştir.
Abarca ve diğ. (2003) İspanya’da piyasadan topladıkları 50 adet kuru asma meyvesinin (kuş üzümü, kuru üzüm ve sultani kuru üzüm) % 98’inden siyah
Aspergillus spp. izole etmişlerdir. A. niger var. niger kontamine örneklerin
tamamından izole edilirken A. carbonarius ise 29 (% 58) örnekten izole edilmiştir. Çalışmada A. carbonarius izolatlarının 10 gün süreyle 30ºC ve 35 ºC’de inkübasyonu sonrasında 25ºC’den daha yüksek miktarda okratoksin A oluşturduğunu saptamışlardır.
İspanya’daki üzüm bağlarından 2000 ve 2001 yıllarında Mayıs ve Ekim ayları arasında dört farklı aşamada toplanan 5600 adet üzüm tanesinde direkt ekim
yöntemiyle gerçekleştirilen çalışmada A.niger aggregate örneklerin % 14,23 (797)’ünde , A. carbonarius ise % 2,57 (144)’sinde tespit edilmiştir. Örneklerden izole edilen küf sayıları hasat aşamasında belirgin bir oranda artmıştır. Çalışmada örneklerden besiyerinde yüksek miktarda OTA üreten A. melleus, A. alliaceus ve A.
ostianus’ da izole edilmiştir. Ancak bu küflerin az sayıda örnekte tespit edilmesi
nedeniyle üzümlerde okratoksin A riski açısından önemli olmadığı düşünülmektedir (Bau ve diğ., 2006).
Iamanaka ve diğ. (2006), Türkiye, İspanya, Meksika, Tunus, Şili, A.B.D. ve Arjantin’den ithal edilen siyah sultani, beyaz sultani, hurma, erik, kayısı ve incirden oluşan 119 adet kuru meyve örneğinden direkt ekim yöntemiyle 518 adet potansiyel okratoksijenik suş izole etmiştir. Suşların mikotoksin oluşturma potansiyelleri ince tabaka kromatografisi ile saptanmıştır. Bu suşların 491 adedi siyah Aspergillus (A.
niger ve A.carbonarius) ve 27 adedi A. ochraceus’tur. Siyah Aspergillus türlerinden
5 adedi A. carbonarius olarak tanımlanmış ve yalnızca 3 adedinin okratoksin A üreticisi olduğu belirlenmiştir. Bu çalışmada diğer çalışmaların aksine A.niger’ lerin daha yüksek oranda (%25) OTA üreticisi olduğu bulunmuştur. A. ochraceus izolatları siyah sultani, hurma ve erik örneklerinden izole edilmiş ve izolatların % 52’sinin okratoksin A üretme potansiyeline sahip olduğu tespit edilmiştir. Kuru meyvelerden siyah sultani üzüm, kayısı ve incirlerde siyah Aspergillus türlerinin görülme sıklığının daha fazla olduğu kaydedilmiştir. Çalışmada kayısıların okratoksijenik küf ve okratoksin A içermediği saptanmış bunun da kükürt dioksit muamelesiyle ilişkili olduğu bildirilmiştir.
İtalya’da farklı tipteki şaraplarda yapılan çalışmada okratoksin A miktarı ve üretimin yapıldığı alanın konumu arasında korelasyon tespit edilmiştir. Güney İtalya’da Kuzey İtalya’ya göre daha yüksek miktarda ve sıklıkta okratoksin A varlığı saptanmıştır (Brera ve diğ., 2006). Serra ve diğ. (2005) tarafından Portekiz’de gerçekleştirilen çalışmada Akdeniz ikliminin hakim olduğu bölgelerden alınan örneklerde A. carbonarius ve A. niger aggregate sıklığının daha yüksek olduğu belirtilmiştir.
Haziran 2001-Eylül 2003 döneminde, olgunlaşma aşamalarında ve hasat sırasında temin edilen şaraplık üzüm örneklerinde yürütülen çalışmada hakim florayı
Nigri’ye aittir. A. carbonarius ve A. niger aggregate ile kontaminasyon sıklığı hasat
örneklerinde daha fazladır (Serra ve diğ., 2005).
Pestisit uygulaması ve şarap üretiminde farklı üzüm çeşitlerinin kullanımı, hasat ve depolama koşulları, üretim şekli (fermantasyon süresi ve sıcaklığı vb.) üründe mikotoksin miktarını etkilemektedir (Zimmerli ve Dick, 1996).