Kuru İncir Örneklerinde Mikotoksin Tayini 1 Örneklerin hazırlanması

Mikotoksin analizlerini gerçekleştirmek amacıyla incir örnekleri su ile birlikte homojenize edilmiştir. Bu amaçla örnekler et kıyma makinesinden geçirilmiştir. Daha sonra yaklaşık 250 g incir ezmesi, 5 kısım meyve ve 4 kısım musluk suyu (AG) olacak şekilde homojenizatörde (Stomacher 400, Seward Medical) 5 dak. karıştırılarak homojenizasyon sağlanmıştır.

5.4.2 Okratoksin A tayini

5.4.2.1 OTA standartların hazırlanması

Toz haldeki OTA (Sigma Aldrich O1877, ≥ % 98 saflıkta) standardına toluen: asetik asit (99:1, HA) ilave edilerek yaklaşık 20-30 µg/mL konsantrasyonunda OTA stok çözeltisi (1. aşama standart) hazırlanmıştır. Stok çözeltinin konsantrasyonu spektrofotometrik yöntemle tespit edilmiştir.

Spektrofotometrenin kalibrasyonu, AOAC tarafından önerilen aflatoksin standardının hazırlanması için önerilen yönteme göre yapılmıştır. Potasyum dikromatın 0,009 M H2SO4 içinde farklı konsantrasyonlardaki çözeltilerinin (0,25 mM, 0,125 mM,

0,0625 mM) absorbans değerleri 333 nm dalga boyunda ölçülmüştür. Elde edilen absorbans değerlerinden her konsantrasyon için molar absorbtivite (ε) değerleri denklem 5.1’e göre hesaplanmıştır. Hesaplanan 3 ε değerinin ortalaması kullanılarak spektrofotometre (Perkin Elmer Lamda 25) için düzeltme faktörü denklem 5.2’ye göre bulunmuştur. Düzeltme faktörü (CF), 0.95<CF<1.05 olmalıdır. Bu faktörün 0,95’ten küçük ve 1,05’ten büyük olması durumunda kullanılan teknik veya cihazlar kontrol edilmelidir. Çalışmada CF değeri 1,01 olarak belirlenmiştir (AOAC, 2000b)

) ( 1000 mM yon Konsantras Ax = ε (5.1) ε 3160 = CF (5.2)

Spektrofotometrenin kalibrasyon işlemi tamamlandıktan sonra hazırlanan stok çözeltinin absorbans değeri 333 nm dalga boyunda saptanmıştır. Stok çözeltinin

konsantrasyonu (denklem 5.3) 29,25 µg/mL´dir. Stok çözelti karanlıkta ve -18°C´de 4 yıl kullanılabilmektedir. δ ε µ x AxMWx mL gOTA/ = 1000 (5.3)

A= 333 nm dalga boyunda okratoksin A çözeltisinin absorbansı MW: OTA’nın molekül ağırlığı, 403.8

ε: OTA’nın molar absorbtivitesi, 544

δ: Küvette ışık yolu, 1 cm

Stok çözeltiden 2,5 µg/mL konsantrasyonunda toluen: asetik asitte (99:1, HA) 2. aşama standart çözeltisi hazırlanmıştır. Çalışma standardını (3. aşama standart) hazırlamak için 0,5 mL 2. aşama standart çözelti temiz bir tüpe alınarak azot altında kurutulmuştur. 1-2 mL enjeksiyon çözücüsünde (asetonitril: su: asetik asit, 20:80:2, HA) çözülmüştür. Daha sonra balonjojede 5 mL’ye tamamlanarak 0,25 µg/mL konsantrasyonunda çalışma çözeltisi elde edilmiştir. Çalışmada 1-10 ng/mL konsantrasyonlarında kalibrasyon çözeltileri kullanılmıştır. Kalibrasyon çözeltileri çalışma standardından gerekli miktarın balonjojede enjeksiyon çözgeninde seyreltilmesiyle hazırlanmıştır (Tablo 5.4).

Tablo 5.4: Kalibrasyon çözeltilerinin hazırlanması

Kalibrasyon çözeltisinin konsantrasyonu (ng/mL) Çalışma standardından alınan miktar (µL) Enjeksiyon çözgeni miktarı (µL) 1.0 20 4980 2.0 40 4960 5.0 100 4900 8.0 160 4840 10.0 200 4800

5.4.2.2 Geri kazanım değerlerinin belirlenmesi

Okratoksin A geri kazanım oranının belirlenmesi için 2,5 µg/mL OTA standardından örnekte OTA düzeyi 2 µg/mL, 5 µg/mL ve 10 µg/mL olacak şekilde toksin varlığı belirlenmeyen kuru incir örneğine ilave yapılmıştır. Örnekler alüminyum folyo ile sarılıp üzerinde delikler açılarak toluen:asetik asit çözgen karışımının buharlaşması için çeker ocakta 24 saat bekletilmiştir.

5.4.2.3 İmmunoaffinite kolonla saflaştırma ile OTA ekstraksiyonu

Kuru incirde okratoksin A analizi, MacDonald ve diğ. (2003) tarafından önerilen metoda göre asidik ortamda ekstraksiyon sonrası immunoafinity kolonda saflaştırma yöntemi kullanılarak gerçekleştirilmiştir.

Çalışmada analitik veya HPLC saflığında kimyasal maddeler kullanılmıştır. Immunoaffinite kolonları Vicam firmasından temin edilmiştir. % 0,01 tween 20 içeren fosfat tampon çözeltisi (PBS - % 0,01 Tween 20) hazırlamak için 8 g sodyum klorür, 1,2 g susuz disodyum hidrojen fosfat, 0,2 g susuz potasyum dihidrojen fosfat ve 0,2 g potasyum klorür 900 mL distile suda çözülmüştür. Çözeltinin pH’ı, HCl veya NaOH kullanılarak 7,4’e ayarlanmıştır. 0,1 mL Tween 20 ilavesinden sonra hacim 1 L’ye tamamlanmıştır.

45 g ± 0,2 g örnek 50 mL metanol ve 0,1 M ortofosforik asit ilavesiyle karıştırıcıda (Waring Blender) 3 dak. süreyle yüksek hızda ekstrakte edilmiştir. Karışım Whatman No: 4 filtre kağıdı kullanılarak filtre edildikten sonra 12 mL filtrat alınarak % 0,01 Tween 20 içeren fosfat tamponunda (PBS) 100 mL’ye seyreltilmiştir. 50 mL seyreltilmiş ekstrakt saflaştırma işlemi için Ochratest (Vicam) immunoaffinity kolondan 1-2 damla/sn hızla geçirilmiştir. Kolon daha sonra sırasıyla 10 mL PBS - % 0,01 Tween 20 çözeltisi ve 10 mL distile su ile yıkanmıştır. Kolon hava geçirilerek kurutulduktan sonra OTA, 0,5 mL x 2 metanol ile yıkanarak kolondan alınmıştır. Eluat 30°C’de su banyosunda azot altında kuruluğa kadar buharlaştırılmıştır. Kalıntı 1 mL enjeksiyon çözgeni ile çözüldükten sonra HPLC ile analizlenmiştir.

5.4.2.3 Okratoksin A analizi için HPLC koşulları

Sıvı kromotografisi, dörtlü çözgen dağıtım sistemi, 100 µL’lik döngü içeren Rheodyne enjeksiyon sistemi, fluoresans dedektör, degasser ünitesi içeren Agilent 1100 HPLC sistemi kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Veriler Chemstation 3D yazılım programı yardımıyla değerlendirilmiştir. OTA ayrımı, oda sıcaklığında ODS- Hypersil C18 (250 mm x 4,6 mm, 5 µm partikül çaplı) ters faz kolonda hareketli faz olarak asetonitril: su: asetik asit (99:99:2, HA) çözgen sistemi kullanılarak 1 mL/dak. akış hızında gerçekleştirilmiştir. Hareketli faz ve enjeksiyon çözgeni kullanılmadan önce Sartolon 25006-47-N (0,45 µm) filtre ile süzülmüştür.

5.4.2.4 Okratoksin A varlığının doğrulanması

Okratoksin A varlığının doğrulanması Iamanaka ve diğ. (2006) tarafından önerilen BF3-metanol kompleksi kullanılarak OTA metil esterinin oluşturulması ve HPLC ile

tekrar analizlenmesiyle gerçekleştirilmiştir.

Örnek ve standart çözeltisinden 200 µL alınarak azot altında kuruluğa kadar buharlaştırıldıktan sonra 300 µL BF3-metanol kompleksinde çözülmüştür. 80ºC’de

10 dak. ısıtmadan sonra çözgen buharlaştırılmıştır. Kalıntı 1 mL OTA enjeksiyon çözgeninde çözüldükten sonra yukarıda belirtilen koşullarda HPLC’ye enjekte edilmiştir. Örnekte OTA varlığı, türevlendirme sonrası 10 ± 0,2 dak. gözlenenen OTA piki kaybolması ve yaklaşık 23 ± 0,2 dak. OTA standart türeviyle benzer alıkonma zamanında yeni bir pikin ortaya çıkmasıyla doğrulanmıştır.

5.4.3 Fumonisin tayini

5.4.3.1 Fumonisin B1 standartlarının hazırlanması

Toz haldeki 1 mg fumonisin B1 (Sigma Aldrich F1147, % 98 saflıkta) standardına 4

mL asetonitril:su (50:50, HA) çözeltisi eklenerek 250 µg/mL konsantrasyonunda fumonisin B1 stok çözeltisi (1. aşama standart) hazırlanmıştır. Elde edilen stok

çözeltiden seyreltme yöntemiyle 10, 25 ve 50 µg/mL konsantrasyonunda kalibrasyon çözeltileri hazırlanmıştır (Tablo 5.5).

Tablo 5.5: Fumonisin kalibrasyon çözeltilerinin hazırlanması

Kalibrasyon çözeltisinin konsantrasyonu (µg/mL) 1. Aşama Standarddan alınan miktar (µL) Çözgen miktarı (µL) 10 200 4800 25 500 4500 50 1000 4000

5.4.3.2 Geri kazanım değerlerinin belirlenmesi

Fumonisin B1 geri kazanım oranının belirlenmesi için 50 µg/mL FB1 standardından

örnekte 1 µg/mL FB1 olacak şekilde toksin varlığı belirlenmeyen kuru incir örneğine

aşılama yapılarak karıştırıldıktan sonra çözgenin buharlaşması için 30 dak. beklenmiş ve analizler gerçekleştirilmiştir.

5.4.3.3 Katı faz ekstraksiyon kolonla saflaştırma ile fumonisin ekstraksiyonu

Kuru incirde fumonisin B1 analizi mısır için geliştirilmiş olan Romer Labs. (Anon.,

2004b) ve AOAC 995.15 (AOAC, 2000a); TS EN 13585 (TSE, 2002) yöntemlerinin uyarlanması ile gerçekleştirilmiştir. Çalışmada analitik veya HPLC saflığında kimyasal maddeler kullanılmıştır. Katı faz ekstraksiyon kolonları Romer Labs firmasından temin edilmiştir. 45 g ± 0,2 g örnek 100 mL metanol:su (3:1; HA) ilavesiyle karıştırıcıda (Waring Blender) 5 dak. süreyle ekstrakte edilmiştir. Karışım Whatman No: 4 filtre kağıdı kullanılarak filtre edildikten sonra pH’ı 0,1 M NaOH ile 6-9’a ayarlanmıştır. 10 mL filtrat alınarak 10 mL metanol:su karışımıyla seyreltilmiştir. Katı faz ekstraksiyon kolonu önce 5 mL metanol ve arkasından 5 mL metanol:su karışımı geçirilek koşullandırılmıştır. Koşullandırılan kolondan seyreltilmiş ekstrakt ≤ 2 mL/sn hızında geçirilmiştir. Kolon safsızlıkların uzaklaştırılması amacıyla 8 mL metanol-su ve 3 mL metanolle yıkanmıştır. Fumonisin, 10 mL metanol:asetik asit (99:1; HA) ile kolondan alınmıştır. Elde edilen ekstrakt HPLC ve ELISA analizlerinde kullanılmak üzere ikiye bölünerek azot altında yaklaşık 60ºC’de kurutulmuştur. Kalıntı 200µL metanol karışımında çözülerek türevlendirme sonrası HPLC, 1 mL metanol-su ile çözülerek ELISA yöntemi ile analizlenmiştir.

5.4.3.4 Fumonisin B1 analizi HPLC koşulları

HPLC ile fumonisin analizi OPA reaktifi ile türevlendirmeyle gerçekleştirilmiştir. OPA reaktifinin hazırlanması için, 40 mg ortofital aldehit 1 mL metanolde çözüldükten sonra 0,1 M Na2B4O7·10H2O ile 5 mL’ye tamamlanmıştır. Karışıma 50

µL 2-merkaptoetanol ilave edilerek amber renkli şişede saklanmıştır. OPA reaktifi oda koşullarında bir hafta süreyle kullanılabilmektedir. Metanolde çözülmüş kalıntıdan 25 µL alınarak 225 µL OPA reaktifi ilave edilerek vorteksde karıştırılmış ve 1-2 dak. içinde HPLC’ye enjekte edilmiştir. OPA türevinin fluoresans şiddeti 2 dak. sonra azalmaya başladığından tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için örnekler içinde enjeksiyon zamanı sabit tutulmaya çalışılmıştır.

HPLC ile fumonisin analizi dörtlü çözgen dağıtım sistemi, 20 µL’lik döngü içeren Rheodyne enjeksiyon sistemi, fluoresans dedektör (λex: 335 nm; λem: 440nm), degasser ünitesi içeren Agilent 1100 HPLC sistemi kullanılarak gerçekleştirilmiştir.

ayrımı, oda sıcaklığında ODS-Hypersil C18 (250 mm x 4.6 mm, 5 µm partikül çaplı) ters faz kolonda 1 mL/dak. akış hızında gerçekleştirilmiştir. Hareketli faz olarak o- fosforik asitle pH’ı 3,35’e ayarlanmış metanol: 0,1 M NaH2PO4·H2O (77:23; HA)

çözgen sistemi kullanılmıştır. Hareketli faz kullanılmadan önce Sartolon 25006-47- N (0,45 µm) filtre ile süzülmüştür.

5.4.3.5 ELISA yöntemi ile fumonisin tayini

Romer Lab. AgraQuant®1-5 Fumonisin direkt yarışmalı ELISA test kiti kullanılarak analizler gerçekleştirilmiştir. ELISA yöntemiyle analizler dağıtıcı firmanın önerisiyle katı faz ekstraksiyon kolonuyla saflaştırılmış örneklerin metanol:su (3:1) ile çözülmesiyle elde edilen ekstraktlara uygulanmıştır. Analiz firmanın verdiği prosedür takip edilerek yapılmıştır (5.3.2’de açıklanmıştır).