Ondokuz Mayıs Üniversitesi, Ziraat Fakültesi, Zootekni Bölümü, Samsun
Özet
Genel olarak in vitro embriyo üretiminde dondurulmuş sperma kullanılmaktadır. Çünkü dondurulmuş sperma düşük maliyette temin edilebilmekte ve sıvı nitrojende kolaylıkla depolanabilmektedir. Ancak spermanın sıvı nitrojen içerisinde depolanması patojen bulaşma riski, yüksek depolama ve taşıma maliyetlerinden dolayı giderek istenmeyen bir hale gelmektedir. Bu sebeple sperm hücresinin morfolojik yapısını bozmayan, in vitro fertilizasyonda kullanımına imkan veren, sıvı nitrojenden bağımsız ve düşük maliyetle uzun süreli depolama sağlayacak alternatif metotlara ihtiyaç duyulmaktadır. Başlangıçta liyofilizasyon çeşitli biyolojik ve kimyasal maddelerin uzun süre korunup saklanması için geliştirmiştir. Liyofilizasyon dondurulmuş materyal içersindeki buzun yüksek basınç altında süblimleştirilerek kurutulması işlemidir. Bu teknik sadece bir kurutma yöntemi değil aynı zamanda mükemmel bir koruma yöntemidir. Dolayısıyla liyofilizasyon hem spermanın uzun süre depolanması hem de düşük depolama maliyeti (oda sıcaklığında) nedeniyle alternatif bir kriyoprezervasyon metodu olarak ortaya çıkmaktadır. Liyofilizasyon sonrası sperm hücrelerinin morfolojik yapısı (DNA içeren baş kısmı ile kuyruk yapısı) bozulmasa da yeniden yapılandırıldıklarında motilitelerini tamamen kaybetmektedirler. Bu nedenle liyofilize sperm hücreleri sadece intra stoplazmik enjeksiyon (İSME) yoluyla oositlerin fertilizasyonunda kullanılabilmektedir. Yapılan çalışmalar, in vitro olgunlaştırılmış memeli oositlerinin İSME yoluyla yeniden yapılandırılmış liyofilize sperma hücresi tarafından fertilize edilebileceğini ve elde edilen zigotların normal blastosist gelişimi gösterebildiğini bildirmiştir.
Anahtar Kelimeler: Liyofilizasyon, Sperm hücresi, Kriyoprezervasyon, Embriyo
The use of lyophilized sperm for in vitro embryo production
Abstract
Generally frozen sperm has been used for embryo production in vitro. Because the frozen sperm can be obtained at a low cost and easily stored in liquid nitrogen. However, storage of frozen sperm in liquid nitrogen is becoming increasingly undesirable because of risk of pathogen contamination, and high storage and transport costs. There is need, therefore, alternative methods for does not disrupt the morphological structure of spermatozoa, allowing for the use of in vitro fertilization, independent of liquid nitrogen, to be provide long-term storage with low cost. Initially, lyophilization was developed to long-term preserve and store of various biological and chemical materials. Lyophilization is a process in which frozen material is dried through the sublimation of ice under high pressure. This procedure is not only a drying process is also a perfect protection method. Thus, lyophilization appears to be an alternative method for cryopreservation, because of both long term storage of sperm and low storage cost (in room temperature). After lyophilization morphology of spermatozoa was not altered (intact DNA containing heads and flagella), but reconstituted spermatozoa show no motility. Therefore, liyofilized spermatozoa can only be used by intracytoplasmic micro injection (ICMI) for oocytes fertilization. Studies demonstrate that in vitro matured mammalian oocytes can be fertilized with reconstituted lyophilized spermatozoa through ICMI and that resultant zygotes can develop into normal blastocysts.
167 Giriş
Sperma kriyoprezervasyonu (dondurma) çok düşlük sıcaklıkta (-196 oC) canlı sperm hücresinin minimum hasarla ve fonksiyon kaybı olmaksızın uzun süre saklanmasını sağlar. Spermanın dondurulmasında ve depolanmasında kullanılan mevcut metotların çoğu sıvı nitrojene bağımlılık göstermektedir (Mazur, 1990). Ancak sıvı nitrojene olan bu bağımlılık depolama ve taşıma maliyetlerini arttırmakla beraber (Tomlinson ve ark., 2000) patojenik bulaşma (Tedder ve ark., 1995) gibi problemleri de ortaya çıkarmaktadır. Dolayısıyla sıvı nitrojenden bağımsız, sperm hücrelerinin morfolojik yapısını bozmayan, in vitro fertilizasyonda kullanımına imkân veren, patojenik bulaşma riskini ortadan kaldıran, etkin bir maliyet yönetimine sahip, uzun süreli depolanma sağlayacak, güvenilir ve alternatif kriyoprezervasyon metotlarına ihtiyaç duyulmaktadır. Son zamanlarda liyofilizasyon (dondurarak kurutma) yöntemi alternatif bir kriyoprezervasyon metodu olarak ortaya çıkmaktadır (Abdalla ve ark., 2009). Bu yöntem temel olarak biyolojik materyallerin (DNA, enzimler ve hormonlar), ilaç yapımında kullanılan ham maddelerin ve aşıların uzun süreli depolanması ve korunması için tasarlanmış bir işlemdir (Abdalla ve ark., 2009). Liyofilizasyon işlemi dondurulmuş maddede bulunan buz zerreciklerini yüksek basınç altında süblimleştirerek madde içindeki su miktarını herhangi bir metabolik reaksiyonu desteklemeyecek seviyeye kadar azaltır. Dahası maddenin kurutulması, atmosferik basınç altında oda sıcaklığında herhangi bir patojenik bulaşma olmadan ve bozulmadan uzun süre depolanabilmesini sağlar. Bu yöntem kurutulmuş maddenin yapısını bozulmadığı için sadece bir kurutma yöntemi değil aynı zamanda mükemmel bir koruma yöntemidir (Przic ve ark., 2004). Bu sebeple liyofilizasyon işlemi hem depolamada sıvı nitrojene olan bağımlılığı ortadan kaldırdığı hemde düşük depolama maliyetine sahip olduğu için güvenilir ve alternatif bir sperma kriyoprezervasyon metodu olarak kullanılabilir. Bu derlemede liyofilizasyon işlemi, sperm hücrelerinin liyofilizasyonu ve liyofilize edilen sperm hücrelerinin embriyo üretimindeki kullanımı üzerinde durulmuştur.
Liyofilizasyon İşlemi
Genel hatlarıyla liyofilizasyon işlemi üç temel aşamadan meydana gelir: Dondurma, birincil kurutma (süblimasyon) ve ikincil kurutma (dezorpsiyon).
Aşamalar şu şekilde seyreder (Palepu, 2007);
1. Liyofilize edilecek madde çeşitli tampon bileşikler ile muamele edilerek veya edilmeden dondurulur (sıvı azot vb.) ve liyofilizatöre yerleştirilir.
2. Birincil kurutmada maddeye düşük oranda vakum uygulanır ve sıcaklık düştükçe yüksek enerjideki su molekülleri buharlaşır.
3. İkincil kurutma aşamasında vakum oranı en yüksek seviyeye çıkarılır ve maddeye tutunup kalmış (kristal) son su molekülleri de buharlaşır.
Yukarda açıklanan aşamalar maddenin özelliğine veya talebe göre değişiklik gösterebilmektedir. Dondurma aşamasının aygıt dışında yapılması hem liyofilizatör içersinde oldukça uzun süren bu aşamasının kısaltılmasına hem de aygıtın daha çok
vakum aşamalarında değerlendirilmesine imkan sağlar. İyi bir liyofilizasyon işlemi sonunda maddenin tamamen kuru olması mümkün olmamakla birlikte maddenin nihai nem değeri %1–2 düzeylerinde olmalıdır (Przic ve ark., 2004).
Liyofilizasyon işleminin avantajları şunlardır (Palepu, 2007);
1. Isıya duyarlı her çeşit malzemede en az hasar ve etkinlik kaybına yol açar. 2. Kimyasal oluşumların kararlılıklarını koruyarak ilaç, ilaç benzeri ve kimyasal
malzemelerin daha uzun dayanabilmelerini sağlar.
3. Liyofilize malzemenin etkin bir biçimde yeniden yapılandırılmasına imkan verir. 4. Malzemelerin kaplarında liyofilize edilebilmeleri dozajının kesin olarak
belirlenmesini kolaylaştırmaktadır (aşı vb.).
5. Bu yöntem mikroorganizmaları veya diğer biyolojik materyalleri korurken ortamdaki suyu almak suretiyle metabolik faaliyetler engellenmekte, böylece ilgili materyal uzun süre bozulmadan depolanabilmektedir.
Liyofilizasyon işleminin birçok avantajı olduğu kadar bazı dezavantajları da vardır. Bunlar;
1. Tesis donanım sermaye maliyeti yüksektir.
2. Maddeni durumuna bağlı olarak işlem süresi çok fazla uzayabilir.
Dezavantaj olarak tanımlanan özelliklerine rağmen liyofilizasyon, özellikle ilaç sanayinde olmak üzere, kimi sektörlerde olmazsa olmaz bir teknoloji haline gelmiştir (Przic ve ark., 2004). Liyofilizasyon işleminin yüksek gibi görünen maliyetleri, liyofilize ürüne kazandırdığı nitelikler ve sağladığı uzun süreli depolama imkanı bu işlemin maliyetini fazlasıyla karşılamaktadır (Przic ve ark., 2004). Bu teknolojiye birçok sektörden gösterilen artan ilgi bunun en büyük kanıtıdır.
Spermanın Liyofilizasyonu
Liyofilizasyon öncesinde taze veya dondurulmuş sperm hücreleri hem içersinde bulundukları ortamdan (seminal plazmadan veya kriyoprotektanlar) hem de ölü ve canlı sperm hücrelerini ayırmak için çeşitli seperasyon (ayrıştırma) yöntemlerine (percoll gradient veya swim up) tabi tutulmaktadır (Keskintepe ve ark., 2002). Bu işlemlerden sonra sperm hücreleri fetal sığır serumu, monosakkarit veya disakkaritler, L-glutamin, sodyum purivat, çeşitli nükleozitler (adenozin, guanozin, sitidin, timidin ve uridin), esansiyel ve esansiyel olmayan amino asitler ve antibiyotik gibi çeşitli tampon, besin ve koruyucu madde bileşiklerinin eklendiği ticari kültür medyumlarıyla (TCM-199 veya DMEM) sulandırılırlar (Keskintepe ve ark., 2002; Kaneko ve Nakagata, 2006; Martins ve ark., 2007; Kaneko ve ark., 2009). Sulandırma işleminden sonra sperma istenilen doza ayarlanır (10x106/ml gibi) ve 100 µl sperma 1–1,5 ml’lik tüplerin (soğuğa dayanıklı cam veya plastik tüpler) içersine yerleştirilir. Tüpler 20–30 saniye sıvı nitrojen içersine daldırılarak içersindeki sperma dondurulur. Daha sonra tüpler -47 oC sıcaklıktaki liyofilizatöre yerleştirilir ve yaklaşık 0,3–0,35 hektopaskal basınç altında 12–14 saat bekletilerek sperma liyofilizasyonu tamamlanmış olur. Liyofilize sperma talebe bağlı olarak oda sıcaklı dahil olmak üzere farklı sıcaklıklarda (15, 4, -20 oC) uzun
169
süre depolanabilir (Keskintepe ve ark., 2002; Kaneko ve ark., 2009). Liyofilize spermalar genel olarak embriyo transfer suyu (Keskintepe ve ark., 2002) milli-Q su (Kaneko ve ark., 2009) veya çeşitli polimer bileşikler eklenmiş tampon çözeltiler (Martins ve ark., 2007) kullanılarak yeniden yapılandırılabilmekte ve çeşitli teknikler aracılığı ile in vitro fertilizasyonda kullanılabilmektedir.
Yapılan Çalışmalar
Biyolojik materyaller liyofilizasyon işlemini ile uzun süreli ve düşük maliyetle depolanabilmektedir. Dolayısıyla bir biyolojik materyal olan spermanın teknik olarak liyofilize edilmesi depolama ve taşımada getireceği faydalar sebebiyle hayvancılık sektörüne büyük katkılar sağlayacağı düşünülmektedir. Memeli spermasının liyoflizasyonu üzerine yapılan in vitro çalışmalarda liyofilizasyon sonrasında sperm hücrelerinin motilitelerini (hareketlilik) tamamen kaybettikleri gözlemlenmiştir (Martins ve ark., 2007; Kaneko ve ark., 2009). Ancak, liyofilizasyon işleminin sperm hücresinin canlılığı, genetik materyali (DNA) içeren baş kısmının bütünlüğü ve morfolojik yapısı üzerine olan etkisinin çok düşük olduğu bildirilmiştir (Keskintepe ve ark., 2002). Bu nedenle, günümüzde liyofilize sperm hücreleri in vitro oosit fertilizasyonunda sadece intra stoplazmik mikro enjeksiyon (İSME) yoluyla kullanılabilmektedir.
Keskintepe ve ark. (2002)’nın yaptığı bir çalışmada aktive edilmiş sığır oositlerinin İSME yöntemi kullanılarak liyofilize sperm hücresi ile in vitro fertilizasyonu sonucunda elde edilen zigotların yaklaşık %29,6 kadarının blastosis aşamasına ulaşabildiğini bildirmiştir. Martins ve ark. (2007) çeşitli tampon solüsyonlar kullanılarak liyofilize edilmiş sığır spermalarından İSME sonrasında elde edilen zigotların % 19,4’e varan oranda blastosis aşamasına ulaştığını bildirmiştir. Kaneko ve ark. (2006, 2009) çeşitli tampon solüsyonlar ile liyofilize edilmiş kemirgen (rat ve fare) spermalarının yeniden yapılandırıldıktan sonra İSME metodu kullanılarak fertilize edilen oositlerden elde edilen zigotların yaklaşık %32 kadarının blastosisis aşamasına ulaşabildiğini bildirmiştir. Kusakabe ve ark. (2001) İSME yöntemi kullanılarak liyofilize sperma ile fertilize edilen fare oositlerinin %72’sinin blastosist aşamasına ulaştığını gözlemlemişlerdir. Liu ve ark. (2004) aktive edilmiş tavşan oositinin İSME yöntemi kullanılarak liyofilize sperma ile fertilizasyonu sonucunda elde edilen zigotların %24’ünün blastosist aşamasına ulaştığını rapor etmişlerdir.
Sonuç olarak liyofilize spermanın yeniden yapılandırılarak İSME tekniğiyle rat (Kaneko ve ark., 2009), fare (Kaneko ve Nakagata, 2006), tavşan (Liu ve ark., 2004) ve sığır (Keskintepe ve ark., 2002; Martins ve ark., 2007) gibi memeli oositlerinin in vitro fertilizasyonunda kullanılabileceği ve elde edilen embriyoların azımsanmayacak oranda blastosis aşamasına ulaştığı bildirilmiştir. Dahası elde edilen bu embriyoların, embriyo transferiyle gebelik elde edebilmek için kullanılabileceği de rapor edilmiştir (Kaneko ve ark., 2009). Ayrıca liyofilizasyon sonrası in vitro şartlarda sperm motilitesini geri kazandırmaya yönelik çalışmalarda yapılmaktadır.
Kaynaklar
Abdalla H, Hirabayashi M, Hochi S. 2009. The ability of freeze-dried bull spermatozoa to induce calcium oscillations and resumption of meiosis. Theriogenology, 71, 543–552.
Kaneko T, Kimura S, Nakagata N. 2009. Importance of primary culture conditions for the development of rat ICSI embryos and long-term preservation of freeze-dried sperm. Cryobiology, 58, 293–297.
Kaneko T, Nakagata N. 2006. Improvement in the long-term stability of freeze-dried Mouse spermatozoa by adding of a chelating agent. Cryobiology, 53, 279–282. Keskintepe L, Pacholczyk G, Machnicka A, Norris K, Curuk MA, Khan I, Brackett BG.
2002. Bovine Blastocyst Development from Oocytes Injected with Freeze-Dried Spermatozoa. Biol. Reprod., 67, 409–415.
Kusakabe H., Szczygiel MA, Whittingham DG, Yanagimachi R. 2001. Maintenance of genetic integrity in frozen and freeze-dried mouse spermatozoa. PNAS, 98, 13501–13506.
Liu JL, Kusakabe H, Chang CC, Suzuki H, Schmidt DW, Julian M, Pfeffer R, Bormann CL, Tian XC, Yanagimachi R, Yang X. 2004. Freeze-Dried Sperm Fertilization Leads to Full-Term Development in Rabbits. Biol. Reprod., 70, 1776–1781. Martins CF, Bao SN, Dode MN, Correa GA, Rumpf R. 2007. Effects of freze-drying on
cytology, ultrastructure, DNA fragmentation, and fertilizing ability of bovine sperm. Theriogenology, 67, 1307–1315.
Mazur P. 1990. Equilibrium, quasi-equilibrium, and nonequilibrium freezing of mammalian embryos. Cell Biophys,17: 53–92.
Palepu NR. 2007. Lyophilization Process and Products Obtained Thereby. http://www.freshpatents.com/Lyophilization-process-and-products-obtained- thereby-dt20070524ptan20070116729.php.
Przic DJ, Ruzic NLJ, Petrovic SD. 2004. Lyophilization – The Process and industrial use. Hemijska industrija, 58, 552–562.
Tedder RS, Zuckerman MA, Brink NS, Goldstone AH, Fielding A, Blair S, Patterson KG, Hawkins AE, Gormon AM, Heptonstall J, Irwin D. 1995. Hepatitis B transmission from contaminated cryopreservation tank. The Lancet, 346, 137–40. Tomlinson M, Sakkas D. 2000. Is a review of standard procedures for cryopreservation
needed? Safe and effective cryopreservation—should sperm banks and fertility centres move toward storage in nitrogen vapour? Hum. Reprod., 15, 2460–2463.
171