Uğur Şen1, Mehmet Kuran2
1
Ondokuzmayıs Üniversitesi, Ziraat Fakültesi, Zootekni Bölümü, 55139, Samsun
2
Ondokuzmayıs Üniversitesi, Ziraat Fakültesi, Tarımsal Biyoteknıloji Bölümü, 55139, Samsun
Özet
Bu çalışmanın amacı, farklı inkübasyon sıcaklığının sığır oositlerinin in vitro olgunlaşması üzerine etkisini araştırmaktır. Sığır ovayumlarından elde edilen oositler sitoplazmik homojenliğe ve kumulus hücreleri ile kuşatılma derecesine göre iyi ve zayıf kaliteli olarak sınıflandırılmıştır. İyi ve zayıf kalitedeki oositler ayrı olarak %10 FCS eklenmiş doku kültür medyumunda (TCM–199) 36,5 veya 38,5°C sıcaklıkta ve % 5 CO2 içeren nemlendirilmiş ortamda 22 saat in vitro olgunlaştırılmaya
bırakılmışlardır. İn vitro olgunlaştırma süresi sonunda, kumulus ekspansiyonu ve nükleer boyama ile belirlenen metafaz II (MII; nükleer olgunlaşma) safhasına ulaşan oositlerin oranı bakımından farklı inkübasyon sıcaklıkları arasında önemli bir farklılık gözlemlenmemiştir. Ancak, inkübasyon sıcaklığı düşürüldüğünde zayıf kalitedeki oositlerin MII safhasına ulaşma oranı iyi kalitedeki oositler ile karşılaştırıldığında düştüğü gözlemlenmiştir (P<0,05). Bu çalışmanın sonuçları, düşük inkübasyon sıcaklığının (36,5 °C) iyi kalitedeki oositlerde kumulus ekspansiyonu ve nükleer olgunlaşmayı (MII) desteklediğini göstermiştir.
Anahtar Kelimeler: Kültür Sıcaklığı, İn vitro olgunlaştırma, Sığır, Oosit Kalitesi
Effect of different incubation temperatures on in vitro maturation of bovine oocytes Abstract
The aim of the study was to investigate the effect of different incubation temperatures on in vitro maturation of bovine oocytes. Oocytes obtained from bovine ovaries were classified as good and poor quality based on their homogeneity of the cytoplasm and cumulus investment. Good and poor quality oocytes were separately subjected to in vitro maturation in tissue culture medium (TCM–199) supplemented with 10% FCS for 22 hours filled with a humidified 5% CO2 in air at either 36.5 or 38.5
°C. At the end of in vitro maturation period, there were no significant differences between different incubation temperatures in terms of percentage of cumulus expansion and oocytes reached to metaphase II (M II; nuclear maturation) stage determined by nuclear staining. However, the percentage of oocytes reached to M II stage was decreased when the incubation temperature was decreased in poor quality oocytes compared to good quality oocytes (P<0.05). The results of present study show that low incubation temperature (36.5 °C) was support for cumulus expansion and nuclear maturation (M II) of good quality bovine oocytes.
Giriş
Uzun yıllar boyunca in vitro embriyo üretimi çeşitli şekillerde uygulanmakta ve sürekli yeni teknolojiler geliştirilmektedir (Akyol ve ark., 2007). Günümüzde, in vitro embriyo üretimine yönelik çalışmalarda önemli mesafe alınmış olmasına rağmen maksimum embriyo üretimini sağlayacak kültür şartları hala belirli bir standart altına alınamamıştır (Leese ve ark., 2008). Bu durumun pek çok nedeni olmakla birlikte istenilen aşamaya ulaşılamamasının en önemli nedeni, in vitro embriyo üretim tekniklerinin in vivo şartları yeterince taklit edememesi veya hala in vivo şartların tam olarak anlaşılamamasıdır (Akyol, 2006a, Leese ve ark., 2008).
İn vitro embriyo üretimindeki başarı oranının artırılması oosit olgunlaşmasının vücut içersindeki gerçekleşme sürecinin tam olarak bilinmesiyle doğrudan ilişkilidir (Akyol, 2006b). Yapılan bazı çalışmalar, sığır, tavşan ve domuz ovaryumlarındaki graaf folliküllerin vücut sıcaklığından yaklaşık 1,5–2 °C daha soğuk olduğunu (Hunter, 2005; Hunter ve ark 2006; Leese ve ark., 2008), dahası yumurta kanalı boyunca sıcaklığın kademeli olarak vücut sıcaklığına yükseldiğini bildirmiştir (Einer-Jensen ve Hunter, 2006; Ye ve ark., 2007). Ancak, geleneksel in vitro embriyo üretim tekniklerinde veya farklı in vitro çalışmaların neredeyse tamamında olgunlaştırma ve kültür aşamalarında sadece vücut sıcaklığı dikkate alınmakta, ovaryum folliküllerindeki veya yumurta kanalı boyunca ki sıcaklık farkı önemsenmemektedir (Leese ve ark., 2008). Bu sebeple, bu çalışmanın amacı farklı inkübasyon sıcaklıklarının in vitro sığır oosit olgunlaşması üzerine etkisini araştırmaktır.
Materyal ve Yöntem
Mezbahadan temin edilen ovaryumlar, 30–35 °C deki 0,1 μl/ml gentamisin sülfat ilave edilen % 0,9’luk serum fizyolojik (NaCl) içersinde kesimden en fazla 3 saat sonra laboratuara ulaştırılmıştır. Ovaryumlar üzerindeki 2–8 mm çapındaki foliküller 10 ml’lik şırınganın içerisine 18 g’lik iğne kullanılarak toplanmıştır. Toplanan oositler % 1 antibiyotik antimikotik solüsyon eklenmiş (Sigma, A5955; 10000 IU penisilin, 100 mg streptomisin ve 25 µg amfoterisin B / ml) hepes tamponlu doku kültür medyumunda (TCM–199; Sigma, M7528) 2 defa yıkandıktan sonra kalitelerinin saptanması amacıyla stereo mikroskop altında morfolojik değerlendirilmeye alınmışlardır. Etrafında 3–4 sıra kumulus hücre kitlesi bulunan homojen stoplazmaya sahip oositler iyi kalite, etrafında 1–2 sıra veya dağınık kumulus hücre kitlesi bulunan homojen stoplazmaya sahip oositler zayıf kalite olarak sınıflandırılmıştır.
Morfolojik değerlendirme işleminden sonra kalitesine göre sınıflandırılan oositler 2 defa olgunlaştırma medyumunda yıkanmış ve 4 kuyulu kültür kabına her bir kuyuda yaklaşık 30–40 adet oosit olacak şekilde üzeri mineral yağ ile kaplanmış olgunlaşma medyumuna (500 µl) aktarılmıştır. Daha sonra kültür kabı içersindeki oositler 36,5 veya 38,5 °C sıcaklıkta ve % 5 CO2 içeren nemlendirilmiş ortamda 22 saat
173
doku kültür medyumuna (TCM–199; Sigma, M4530) % 10 fötal kalf serum (FCS), 27,5 µg/ml sodyum pürüvat ve %1 antibiyotik antimikotik solüsyon ilave edilmesiyle hazırlanmıştır (Çevik ve ark., 2011).
Olgunlaşma süresi sonunda oositlerin kumulus ekspansiyonları (genişlemeleri) stereo mikroskop altında 10X büyütmede değerlendirilmiştir. Daha sonra kumulus hücrelerinin uzaklaştırılması için oositler 1,5 ml’lik ependorf tüplerin içersine alınarak 5 dakika vortekslenmiştir. Kumulus hücrelerinden ayrılan oositler 1/3 oranında asetik asit: etanol karışımı içersinde + 4 °C’de 24 saat bekletilerek nükleer safhaları sabitlenmiştir. Daha sonra oositler gliserol ile 1/9 oranında karıştırılmış flüoresan bis-benzimide (Hoechst 33342) DNA boyasında 15 dakika oda sıcaklığında inkübasyona bırakılmışlardır. Oositlerin nükleer safhaları 40X büyütmede flöresan mikroskop altında (UV filtreli) incelenip, mayozun germinal vezikül, germinal vezikül yılkılması, metafaz I, anafaz I, telofaz I ve metafaz II aşamaları değerlendirilmiştir. Elde edilen veriler Khikare yöntemiyle Minitab (1998) paket programı kullanılarak analiz edilmiştir.
Bulgular ve Tartışma
Sığırlarda sıcaklık stresinin veya vücut sıcaklığındaki artışın döl veriminde düşüşlere neden olduğu (Zeron ve ark., 2001), dahası yüksek çevre sıcaklığının spermatogenesisi ve oosit kalitesini olumsuz yönde etkileyerek fertiliteyi azalttığı bilinmektedir (Leese ve ark., 2008). Genel olarak sığır oositlerinin in vitro olgunlaştırılması sığır vücut sıcaklığında (38,5–39 °C) gerçekleştirilmektedir (Shi ve ark., 1998). Ancak, Hunter (2005) sığırlarda in vivo olgunlaşmış folliküllerin vücut sıcaklığından yaklaşık 1,5–2 °C daha soğuk olduğunu bildirmiştir. Bu bağlamda, in vitro oosit olgunlaştırmasında uygulanan vücut sıcaklığının oosit olgunlaşma sürecinde olabilecek olan etkilerinin belirlenmesi önem arz etmektedir. Bu sebeple, bu çalışma in vivo şartlarda vücut sıcaklığından daha düşük sıcaklığa sahip graaf follikülün iç sıcaklığı dikkate alınarak tasarlanmıştır.
Tablo 1. Farklı inkubasyon sıcaklığının sığır oositlerinin kumulus ekspansiyonu (genişlemesi) üzerine etkisi
Oosit kalitesi
İyi Zayıf Ortalama
Kültür sıcaklığı (C°) Oosit (n) KE (%) Oosit (n) KE (%) Oosit (n) KE (%) 36,5 91 96,3 88 89,7 179 93,1 38,5 97 94,1 101 90,3 198 92,0
KE = kumulus ekspansiyonu (genişlemesi)
Kaliteli oosit seçimi in vitro embriyo üretiminde başarının temel unsurudur. Genel olarak oosit kalitesinde kumulus hücreleri ve oosit sitoplazması birlikte değerlendirmeye alınmaktadır. Homojen görünümlü bir sitoplazma ve oositi çevreleyen bozulmamış, kompakt yapıdaki kumulus hücreleri, oositin olgunlaşması ve ileri
dönemdeki embriyonik gelişim yeteneği için en önemli işaretlerdendir (Akyol, 2006b). Oosit olgunlaşması, kumulus hücrelerinin genişlemesi, oositin birinci metafaz safhasına girerek, germinal vezikülün yıkılmasını takiben, ilk polar cisimciğin çıkısı ve oositin metafaz II safhasına geçmesi olarak tanımlanır (McDowall ve ark., 2004). Genel olarak in vitro oosit olgunlaşmasının değerlendirilmesi, kumulus hücrelerinin genişlemesine ve ilk polar cisimciğinin varlığına bakılarak yapılmaktadır (Lucianove ark., 2004, Akyol, 2006b).
Tablo 2. Farklı inkübasyon sıcaklığının sığır oositlerinin nükleer olgunlaşması üzerine etkisi
Nükleer Safha (%)
Kültür sıcaklığı (C°)
Oosit
kalitesi Oosit (n) GV GVY M I M II
36.5 İyi 82 0 (0) 5 (6,1) 10 (12,2) 67 (81,7)a Zayıf 72 3 (4,2) 9 (12,5) 18 (25,0) 42 (58,3)b Ortalama 154 3 (2,0) 14 (9,1) 28 (18,2) 109 (70,8)ab 38.5 İyi 88 1 (1,1) 3 (3,4) 18 (20,5) 66 (75,0)ab Zayıf 85 5 (5,9) 8 (9,4) 19 (22,4) 53 (62,4)ab Ortalama 173 6 (3,5) 11 (6,4) 37 (21,4) 119 (68,8)ab
a,b Aynı sütunda farklı harfler ile gösterilen ortalamalar arasındaki farklılık önemlidir (P<0.05).
GV = germinal vezikül; GVY = germinal vezikül yıkılması; M I = metafaz I (anafaz I ve telofaz I dahil); M II = metafaz II.
Mevcut çalışmada düşük inkübasyon sıcaklığı ve oosit kalitesinin sığır oositlerinin in vitro olgunlaşması üzerine olabilecek etkileri incelenmiştir. Çalışmanın sonuçları in vitro sığır oosit olgunlaştırılmasında uygulanan düşük (36,5 °C) ve geleneksel (38,5 °C) inkübasyon sıcaklığının ve oosit kalitesinin, olgunlaştırma periyodunun sonunda kumulus genişlemesi üzerinde aynı etkiye sahip olduğunu göstermiştir gözlemlenmiştir (Tablo 1). Benzer olarak nükleer boyama ile belirlenen metafaz II (MII; nükleer olgunlaşma) safhasına ulaşan oositlerin oranı bakımından farklı inkübasyon sıcaklıkları arasında önemli bir farklılık gözlemlenmemiştir (Tablo 2). Ancak in vitro olgunlaştırmada inkübasyon sıcaklığı düşürüldüğünde zayıf kalitedeki oositlerin MII safhasına ulaşma oranı iyi kalitedeki oositler ile karşılaştırıldığında düştüğü gözlemlenmiştir (P<0,05). Sığır oositlerinin düşük inkibasyon sıcaklığında (graaf follikül içi sıcaklık) in vitro olgunlaşabilmesi düşük sıcaklığın oositlerin in vitro
175
olgunlaşması için gerekli olan enzimatik veya metabolik aktiviteleri desteklemesinden (Abeydeera ve ark., 2001) kaynaklanmış olabilir.
Sonuç olarak in vitro sığır oosit olgunlaştırılmasında, iyi kalitede oositler kullanıldığında, düşük inkübasyon sıcaklığının uygulanması hem kumulus genişlemesi hemde nükleer olgunlaşmanın tamamlanması için iyi bir termal çevre oluşturulmasına yardımcı olabilir. Dahası oositlerin düşük inkübasyon sıcaklığında olgunlaştırılması ileriki embriyonik gelişiminde katkı sağlayabilir. Bu sebeple, düşük inkübasyon sıcaklığında olgunlaştırılan oositlerin blastosist aşamasına ulaşmasındaki yeterliliğini belirlemek üzere in vitro çalışmaların yapılması gerekmektedir.
Kaynakça
Akyol, N. 2006a. Sığırlarda in vivo oosit maturasyonu. Lalahan Hay. Ara. Enst. Derg. 46(2): 47–51. Akyol, N. 2006b. Sığırlarda in vitro oosit maturasyonu. Lalahan Hay. Ara. Enst. Derg. 46(1): 59–69. Akyol, N., Kızıl, S.H., Karaşahin, T. 2007. İn vitro sığır embriyosu üretim ve transferi. Lalahan Hay. Ara.
Enst. Derg. 47(1): 1–8.
Çevik M., Şen U., Koçyiğit A., Soydan E., Kuran, M. 2011. Effects of serum, gonadotropins, epidermal growth factor and estradiol 17-beta on cumulus expansion and nuclear maturation of bovine oocytes. Kafkas Univ. Vet. Fak. Derg. 17: 1009–1014.
Einer-Jensen, N., Hunter, R. H. 2006. Reproductive health in domestic animals. J Fam. Plann. Reprod. Health Care 32: 245–248.
Hunter R.H.F. 2005. The Fallopian tubes in domestic mammals: how vital is their physiological activity? Reprod. Nutr. Dev. 45: 281–290.
Hunter R.H.F., Einer-Jensen N., Greve T. 2006 Presence and significance of temperature gradients among different ovarian tissues. Microsc. Res. Tech. 69: 501–507.
Leese, H.J., Baumann, C.G., Brison, D.R., McEvoy, T.G., Sturmey, R.G. 2008. Metabolism of the viable mammalian embryo: quietness revisited. Molec. Human Reprod. 14: 667–672.
Luciano A.M., Modina S., Vassena R., Milanesi E., Lauria A., Gandolfi F. 2004 Role of intracellular cyclic adenosine 3, 5- monophosphate concentration and oocyte–cumulus cells communications on the acquisition of the developmental competence during in vitro maturation of bovine oocyte. Biol. Reprod. 70: 465–472.
Minitab for Windows (version 12.11) [Computer Program], 1998. Available Distributor: Minitab Inc. 3081 Enterprise Drive State College, PA 16801-3008 U.S.A.
McDowall M.L.S., Gilchrist R.B., Thompson J.G. 2004. Cumulus expansion and glucose utilisation by bovine cumulus–oocyte complexes during in vitro maturation: the influence of glucosamine and follicle-stimulating hormone. Reprod. 28: 313–319.
Shi D.S., Avery B., Greve T. 1998. Effects of temperature gradients on in vitro maturation of bovine oocytes. Theriogenology 50: 667–674.
Ye, J., Coleman, J., Hunter, M.G., Craigon, J., Campbell, K.H., Luck, M.R. 2007. Physiological temperature variants and culture media modify meiotic progression and developmental potential of pig oocytes in vitro. Reprod. 133: 877–886.
Zeron, Y., Ocheretny, A., Kedar, O., Borochov, A., Sklan, D., Arav, A. 2001. Seasonal changes in bovine fertility: relation to developmental competence of oocytes, membrane properties and fatty acid composition of follicles. Reprod. 12: 447–454.