Koruma-Kullanma Dengesi

2.7.1 Sorologia para HHV-6

Os testes sorológicos para o diagnóstico de infecção por HHV-6 foram realizados no Laboratório de Virologia do Instituto de Medicina Tropical de São Paulo (IMTSP-USP).

Para a detecção de anticorpos IgG e IgM anti-HHV-6 foi utilizado a metodologia ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay) que é um teste imunoenzimático que permite a detecção de anticorpos específicos no plasma sanguíneo, através do “kit” Panbio (E-HV601G e E-HV601M) de acordo com as instruções do fabricante.

Para a detecção de anticorpos IgG, primeiramente foi adicionado 1000 ul de diluente de soro [solução tampão salina de Tris (pH 7,2-7,6) com conservante (0,1% Proclin)] a 10 ul da amostra de soro de cada paciente, foram pipetadas 100 ul desta amostra nos respectivos micropoços e incubado durante 30 minutos a 37ºC ± 1ºC. A placa foi lavada seis vezes com solução tampão diluída. Foram aplicados 100 ul de anti-IgG humana de ovino conjugada com peroxidase em cada micropoço e a placa foi incubada durante 30 minutos a 37ºC ± 1ºC. Posteriormente a placa foi lavada novamente seis vezes com solução tampão diluída e após foi adicionado 100 ul de TMB (tetrametilbenzidina) para cada poço, incubados durante 30 minutos em temperatura ambiente (20-25ºC) formando-se uma coloração azul. Seguindo a mesma seqüência e contagem de tempo da adição da TMB, foram adicionados 100 ul de

solução de paragem (1M de ácido fosfórico) para todos os poços, mudando a cor para amarela. Dentro de 30 minutos foi realizada a leitura em microscópio de fluorescência.

Para a detecção de anticorpos IgM, foram realizadas as mesmas etapas do procedimento, entretanto com adição de anti-IgM humana de ovino conjugada com peroxidase.

2.7.2 PCR “nested” para HHV-6

As amostras foram processadas no Laboratório de Virologia do Instituto de Medicina Tropical de São Paulo (IMTSP-USP).

Primeiramente, o DNA viral foi extraído a partir de 200 ul de soro com o kit de extração QIAamp® DNA Mini Kit (QIAGEN , Valencia, CA, USA) conforme protocolo do fabricante.

Para a detecção do HHV-6 foi amplificada parte da região conservada do genoma que codifica a proteína principal do capsídeo viral (MCP/major capsid protein gene) utilizando os iniciadores HV1 e HV2 na primeira amplificação e HV3 e HV4 na segunda reação (“nested”). Após a preparação do mix da primeira amplificação, 5,00 ul do DNA extraído foi adicionado e amplificado em termociclador automatizado (Mastercycler® gradient – Eppendorf (Hamburg-Germany) utilizando um ciclo inicial de 95ºC por 5 minutos seguidos de 35 ciclos de 95ºC por 30 segundos, 55ºC por 45 segundos e 72ºC por 1 minuto e extensão final de 72ºC por 10 minutos. Ao mix da segunda amplificação foi adicionado 5,00 ul do produto da primeira reação e amplificado em termociclador automático utilizando um ciclo inicial de 95ºC por 5 minutos seguidos de 35 ciclos de 95ºC por 30 segundos, 55ºC por 45 segundos e 72ºC por 1 minuto e extensão final de 72ºC por 10 minutos.

1. Mix da primeira amplificação: água MiliQ 35,20 ul; buffer 10X (s/ MgCL 2 )

Gibco 5,00 ul; dNTPs 10 mM Pharmacia 1,00 ul; MgCL 2 50 mM Gibco 1,50 ul; primer

HV1 (10 pmoles/ul) 1,00 ul; primer HV2 (10 pmoles/ul) 1,00 ul; Taq polimerase (5;00 U/uL) Pharmacia ou Gibco 0,30 ul; amostra DNA extraído 5,00 ul.

2. Mix da segunda amplificação: água MiliQ 35,20 ul; buffer 10X (s/ MgCL 2 )

HV3 (10 pmoles/ul) 1,00 ul; primer HV4 (10 pmoles/ul) 1,00 ul; Taq polimerase (5,00 U/uL) Pharmacia ou Gibco 0,30 ul; amostra da primeira amplificação 5,00 ul.

Para cada reação foi utilizado controle negativo (5,00 ul de agua) e controle positivo.

Tabela1: Sequência de primers (Pares de primers para PCR (HV1/HV2) e “nested” PCR (HV3/HV4) de acordo com o estudo de Huang et al, 1992).

Seqüência de primers*: Tamanho:

HV1 (outer) 5’-CAATGCTTTTCTAGCCGCCTCTTC-3’ 480pb

HV2 (outer) 5’-ACATCTATAATTTTAGACGATCCC-3’ 480pb

HV3 (inner) 5’-TTGTGCGGGTCCGTTCCCATCATA-3’ 214pb

HV4 (inner) 5’-TCGGGATAGAAAAACCTAATCCCT-3’ 214pb

Os produtos de amplificação foram analisados por eletroforese em gel de agarose e visualizados sob luz ultravioleta após coloração com brometo de etídio. Para isso, 5,00 ul dos produtos de amplificação foram adicionados a 2,00 ul do tampão de corrida (azul de bromoferol; Sigma) e aplicados em gel de agarose a 1,5% (ultrapura/GIBCO BRL) previamente corado com brometo de etídio. A corrida eletroforética foi feita em voltagem de 80V e tampão TAE (tris-acetato-EDTA) 0,5 X (ácido bórico 5,5%, Tris-Cl 10,8% e EDTA 0,9%).

2.7.3 PCR em tempo real para HHV-6

As amostras foram processadas no Laboratório de Virologia do Instituto de Medicina Tropical de São Paulo (IMTSP-USP).

O DNA viral foi extraído a partir de 200 ul de soro com o kit de extração

QIAamp® DNA Mini Kit (QIAGEN , Valencia, CA, USA) conforme protocolo do

fabricante.

Para a detecção do vírus, somente os iniciadores HHV3 e HHV4 foram utilizados. Após a preparação do mix da primeira amplificação, 5,00 ul do DNA extraído

foram adicionados e amplificados em termociclador automatizado (Mastercycler®

gradient – Eppendorf (Hamburg-Germany)) utilizando o seguinte protocolo de amplificação: um ciclo de 50ºC por 2 minutos, um ciclo de 95ºC por 10 minutos, seguidos de 40 ciclos de 95ºC por 15 segundos, 60ºC por 1 minuto e um ciclo de 95ºC por 15 segundos e 60 ºC por 30 segundos e 95ºC por 15 segundos para a etapa de dissociação da PCR em tempo real (ABI 7300 Real Time PCR Systems Applied Biosystems- Foster City, USA).

O limite de detecção foi determinado pelas diluições seriadas do plasmídio contendo um fragmento de HHV-6, sendo de 4.800cópias/mL de plasma para o ensaio com “Sybr Green” (PCR em tempo real) e de 480 cópias/mL de plasma para a PCR “nested”. (Canto et al., 2008)

Os resultados referentes ao HHV-6 (sorologia e PCR “nested” e em tempo real) não estavam disponíveis para o clínico (transplantador), sendo assim estes dados não foram utilizados para orientação clínica a respeito de profilaxia, tratamento e alteração da imunossupressão.

2.7.4 Antigenemia para CMV

As amostras foram processadas no Laboratório de Virologia da Disciplina de Doenças Infecciosas e Parasitárias da Escola Paulista de Medicina-UNIFESP.

Após separação de neutrófilos com uso de dextran 5%, cada amostra foi citocentrifugada obtendo-se um concentrado com 3 x 106 células/ml. Este procedimento

foi realizado no mesmo dia da chegada de cada amostra. Após 24 horas, a reação foi processada com a utilização de um “pool” de anticorpos monoclonais que identificam o antígeno da matriz viral pp-65. Utilizou-se em seguida um conjugado anti-IgG ligado a peroxidase, revelando-se a reação com a adição de H2O2 e aminoetilcarbazol (AEC).

Após avaliação da lâmina ao microscópio óptico comum, os resultados foram expressos por número de núcleos de neutrófilos corados em relação a 3,00 x 106 células.

O resultado da antigenemia era reportado ao clínico (transplantador) imediatamente, sendo este o responsável pela decisão clínica em relação à instituição do tratamento, profilaxia e alteração da imunossupressão.