Bölüm Sonucu

3.12.1 Caso 1

RS, sexo masculino, IRC de etiologia indeterminada, submetido a transplante renal doador vivo, HLA II. Apresentava IgG negativo e IgM positivo para HHV-6, IgG positivo para CMV. O doador apresentava IgG positivo e IgM negativo para HHV-6, IgG positivo para CMV.

No dia do transplante foi detectado DNA viral através da PCR “nested” e PCR em tempo real no BC, amostras coletadas com 14 dias após o transplante

demonstraram DNA viral no plasma e no BC através da PCR “nested” e no plasma (4,7. 104 cópias/mL) e no BC através da PCR em tempo real.

Este paciente foi acompanhado durante quatro meses e no total foram coletadas nove amostras para análise. Todas as amostras foram positivas no BC através da PCR “nested”, 5/9 (55,5%) amostras foram positivas no plasma através da PCR “nested”, 5/9 (55,5%) amostras positivas na PCR em tempo real no BC e 3/9 (33,3%) amostras positivas na PCR em tempo real no plasma com carga viral média de 4,8.104 cópias/mL de plasma.

Paciente evoluiu bem clinicamente. Apresentou um episódio de infecção ativa assintomática pelo CMV, 39 dias após o transplante, com antigenemia positiva de 1 célula/3x105 células. Paciente não apresentou rejeição aguda celular e não apresentou alteração de função renal.

Portanto este paciente foi submetido a transplante renal durante episódio de infecção aguda ou recente pelo HHV-6, evoluiu assintomático e sem disfunção do enxerto.

3.12.2 Caso 2

ASL, sexo feminino, 32 anos, IRC por nefrite lúpica, submetido a transplante renal doador vivo, HLA II. Apresentava IgG positivo e IgM positivo para HHV-6, IgG positivo para CMV. O doador apresentava IgG positivo e IgM negativo para HHV-6, IgG positivo para CMV.

No dia anterior ao transplante foi detectado DNA viral através da PCR “nested” e PCR em tempo real no BC e no plasma (carga viral de 2,1. 1010 cópias/mL de plasma).

Este paciente foi acompanhado durante quatro meses e no total foram coletadas 11 amostras para análise. Todas as amostras foram positivas na BC através da PCR “nested”, 7/11 (63,6%) amostras foram positivas no plasma através da PCR “nested”, 5/11 (45,5%) amostras positivas na PCR em tempo real no BC e 6/11 (54,5%) amostras positivas na PCR em tempo real no plasma com carga viral média de 9,2. 108 cópias/mL (variação de 2,6. 104- 4,5. 109 cópias/mL).

Paciente evolui bem clinicamente, assintomática, não apresentou infecção pelo CMV, rejeição aguda celular e alteração de função renal.

Portanto, consideramos que este paciente foi submetido a transplante renal em vigência de infecção aguda ou recente pelo HHV-6, entretanto evoluiu assintomático e sem disfunção do enxerto.

4 DISCUSSÃO

As infecções virais são consideradas umas das principais causas de infecções oportunistas após o transplante renal. (Kotton, Fishman, 2005). Recentemente o HHV-6 vem sendo estudado como um patógeno com potencial significativo em receptores de órgãos sólidos, entretanto a interpretação dos dados da literatura é dificultada pelo fato de esta ser uma infecção ubíqua, pela diversidade de síndromes clínicas associadas descritas e pela variedade de metodologias diagnósticas utilizadas. O presente estudo avaliou prospectivamente a infecção pelo HHV-6 em receptores de transplante renal através de técnica diagnóstica sensível baseada no ensaio de PCR “nested” (qualitativo) e em tempo real (quantitativa).

Os dados deste estudo demonstraram alta soroprevalência para HHV-6 tanto em doadores (100% IgG positivo), quanto nos receptores, 96,6% (IgG positivos). A soroprevalência de IgM foi de 13,7% (4/29 pacientes) nos receptores de transplante renal, sendo que três destes pacientes apresentam IgG e IgM positivos, o que poderia estar relacionado com primoinfecção ou infecção aguda. Entretanto, em pacientes imunossuprimidos, a resposta IgM pode resultar de reação sorológica cruzada com outros herpesvírus como o HHV-7 e o CMV (Irving et al., 1998), sendo que aproximadamente 5% dos adultos saudáveis permanecem com IgM positivo por tempo indeterminado e não foram coletadas amostras seriadas para avaliação de aumento dos títulos de IgG (Locatelli et al., 2000). Portanto esses dados sorológicos têm valor limitado na avaliação de infecção aguda podendo estes resultados traduzir apenas infecção pregressa. Esta hipótese é reforçada pelo fato de que todos os pacientes, receptores e doadores, apresentavam-se assintomáticos no momento da coleta da sorologia, ou seja, no pré-transplante.

Entretanto, dois destes pacientes apresentavam DNA viral detectável no momento do transplante. Um dos quatro pacientes, caso 1 descrito acima, apresentou IgM positivo e IgG negativo, com carga viral positiva no BC no dia do transplante, sendo considerado como provável infecção aguda. O paciente do caso 2 apresentava IgG e IgM positivos, entretanto apresentava carga viral no plasma altíssima no pré-

transplante, sendo também considerado infecção aguda. Os dois pacientes apresentaram ótima evolução sem intercorrências no seguimento de quatro meses.

Estudo de Herbein et al. (1996) em pacientes receptores de transplante renal, fígado e rim-pâncreas acompanhados por três meses pós-transplante, demonstrou que a sorologia para o HHV-6 pré-transplante foi positiva em 28 dos 32 receptores (87,5%) e somente quatro foram negativas (12,5%). Após o transplante, infecção por HHV-6 ocorreu em 10 dos 32 pacientes (31%), sendo o diagnóstico realizado através do isolamento do vírus em seis dos 32 pacientes e através da sorologia em quatro pacientes.

Esses dados estão de acordo com a literatura que relata soroprevalência para HHV-6 em adultos maior que 90% (Okuno et al., 1989; Straus, 2005; Zerr et al., 2005). A infecção primária ocorre geralmente na infância, com o passar do tempo os títulos sorológicos diminuem gradualmente, mas persistem positivos por toda a vida.

Sendo assim podemos considerar que praticamente todos os candidatos adultos receptores de transplante de órgãos sólidos são infectados pelo HHV-6 e que as reativações virais no período de imunossupressão pós-transplante estão diretamente relacionadas com a patogênese da doença no paciente imunossuprimido.

A incidência de infecção por HHV-6 após o transplante varia de acordo com o método diagnóstico utilizado. Dados da literatura demonstram que 38-55% dos transplantados renais desenvolvem infecção ativa (Okuno et al., 1990; Yoshikawa et al., 1992; Herbein et al., 1996), entretanto nestes estudos foram utilizados diferentes metodologias diagnósticas (aumento dos títulos sorológicos, isolamento viral, determinação da carga viral através da PCR em células sanguíneas mononucleares periféricas ou em fluídos corpóreos presumidamente livre de células como plasma ou soro).

No presente estudo comparamos a detecção de DNA viral através da PCR em amostras de BC (29/30 pacientes 96,6%) com amostras de plasma (21/30 pacientes 70%), sendo que quando analisamos as amostras coletadas de doadores saudáveis e assintomáticos observamos que 88,2% dos doadores apresentavam DNA detectável no BC e 22,2% no plasma.

Esses dados estão de acordo com dados da literatura que demonstram que a detecção de DNA viral através da PCR em células sanguíneas tem valor diagnóstico

limitado, pois é incapaz de diferenciar a manutenção do genoma viral em células com infecção latente, da presença de células que estão ativamente produzindo HHV-6 (infecção ativa). Já a detecção e ou quantificação do DNA viral através da PCR em fluídos corpóreos presumidamente livres de células, como o plasma ou soro é considerado um marcador relevante de infecção ativa (Huang et al., 1992; Secchiero et al., 1995; Osiowy et al., 1998; Nitsche et al., 2001; Ogata et al., 2006). Este fato fundamenta-se na hipótese de que quando ocorre replicação viral massiva no tecido linfóide, são liberadas partículas de vírus maduras na corrente sanguínea (Achour et al., 2007).

Além disso, estudos recentes de Ward et al, 2006 demonstram que altos níveis de DNA do HHV-6 detectados em sangue total ou soro podem ser encontrados em indivíduos com integração viral no cromossomo. Estes indivíduos são facilmente identificados visto que inevitavelmente cada leucócito contém seqüencia de DNA viral, sendo assim caracteristicamente estes indivíduos apresentam carga viral alta persistente. No presente estudo não foi verificado integração cromossômica.

Sendo assim, detecção viral em amostras de BC está provavelmente relacionada à latência do vírus e a alta taxa encontrada neste estudo está de acordo com a história natural do HHV-6 que é um vírus onipresente e permanece em estado de latência por período indeterminado, portanto deve ser considerado com muita cautela como método diagnóstico de infecção ativa pelo HHV-6 em pacientes transplantados, sendo preferível a detecção em outros materiais como plasma, por exemplo.

Com estes dados concluímos que replicação viral ativa corresponde à detecção de DNA em amostras de plasma, sendo evidenciada neste estudo alta incidência (21 dos 30 pacientes (70%) através da PCR “nested”), o que ainda pode estar relacionado com a detecção de DNA latente.

Apesar da maior relação entre a detecção de DNA viral no plasma e infecção ativa pelo HHV-6, o ensaio qualitativo (PCR “nested”) apresenta limitações, pois pode não estabelecer se o DNA viral detectado é realmente derivado de “virions” circulantes ou de DNA viral latente de células danificadas in vivo ou ex vivo durante a manipulação

das amostras (Locatelli et al., 2000). Esta hipótese é reforçada nos dados do presente estudo em relação à detecção de DNA viral no pré transplante em doadores sadios e receptores assintomáticos, sendo observado que nos doadores sadios que 4/18 (22%)

apresentavam detecção de DNA viral na PCR “nested” e nenhum doador apresentou detecção viral através da PCR em tempo real. Enquanto nos receptores assintomáticos 6/16 (37,5%) apresentaram detecção viral através da PCR “nested” e 4/16 (25%) apresentaram detecção viral através da PCR em tempo real.

A PCR em tempo real que é um ensaio quantitativo pode auxiliar na diferenciação entre os diferentes estágios da infecção: latência, reativação ou infecção ativa. Além disto, a PCR em tempo real é uma técnica padronizável, que apresenta menor risco de contaminação e menor tempo de processamento em relação às técnicas convencionais. Entretanto deve-se levar em consideração que o ensaio quantitativo de detecção da carga viral do HHV-6 através da PCR em tempo real não apresenta padronização internacional e que os laboratórios utilizam diferentes tipos de amostras (sangue total, células sanguíneas mononucleares periféricas, plasma), sendo assim não é possível comparar os níveis de carga viral absolutos entre os diferentes estudos (de Pagter et al., 2008).

Em nosso estudo a PCR em tempo real em plasma apresentou menor sensibilidade [26/60 (43%) amostras ou 11/30 pacientes (36,66%)] em relação ao PCR “nested” [58/60 (96%) amostras ou 21/30 pacientes (70%)], que se apresentou uma técnica extremamente sensível, o que pode ser explicado pelo menor limite de detecção da mesma que foi de 480 cópias/mL em comparação com 4.800 cópias/mL para PCR em tempo real. Nas 347 amostras de plasma onde foi realizado PCR “nested” e PCR em tempo real, foi observado que em 24 (7%) o DNA viral foi detectado em ambos os ensaios, em 34 (9,7%) o DNA viral foi detectado apenas na PCR “nested” e em duas amostras (0,5%) DNA viral foi detectado apenas na PCR em tempo real. Portanto podemos considerar que provavelmente as 34 amostras que apresentaram DNA detectável apenas na PCR “nested” provavelmente apresentavam baixa carga viral, ou seja, menor que 4.800 cópias, entretanto ainda podem estar acima do limite de 1.000 cópias/mL de plasma considerado por alguns autores como carga viral alta e sugestiva de replicação relacionada à morbidade e mortalidade em pacientes receptores de células hematopoiéticas (de Pagter et al., 2008). As duas amostras

positivas somente na PCR em tempo real apresentavam carga viral de: 1,1. 104

cópias/mL e 3,8. 107 cópias/mL e provavelmente a PCR “nested” das mesmas

Um aspecto importante que deve ser ressaltado em relação a PCR em tempo real, que é o método de escolha atualmente utilizado para detecção de replicação viral, é que os resultados apresentados (menor sensibilidade da PCR em tempo real) aplicam-se às características inerentes a metodologia utilizada neste estudo onde o limite de detecção para o ensaio foi de 4.800 cópias. Possivelmente poderia ser observado um desempenho melhor da PCR em tempo real com ensaio mais sensível em relação ao limite de detecção.

Destacamos que embora os ensaios realizados tenham apresentado diferente sensibilidade, quando analisamos o impacto da detecção da replicação viral do HHV-6 na evolução clínica dos pacientes receptores de transplante renal as duas técnicas, PCR “nested” e PCR em tempo real são concordantes.

Estudo de Ihira et al. (2002) através da monitorização de 26 pacientes após transplante de medula óssea, detectou que 12 (46%) apresentaram viremia por HHV-6 através do isolamento viral que foi considerado o ensaio padrão para detecção de replicação ativa. Utilizando a PCR “nested” em plasma para monitorização da replicação ativa, observou que este ensaio apresentou sensibilidade de 92%, especificidade de 97%, valor preditivo positivo (VPP) de 85%, e valor preditivo negativo (VPN) de 99%. Foi realizada uma análise para avaliação da PCR em tempo real em PBMCs como preditor de infecção viral ativa, sendo evidenciados sensibilidade de 100%, especificidade de 74%, valor preditivo positivo (VPP) de 35% e valor preditivo negativo (VPN) de 100%.

Neste estudo foi observada alta incidência (70%) de infecção ativa pelo HHV-6 quando utilizado o ensaio de PCR “nested”, técnica que apresentou maior sensibilidade e incidência alta comparada com a literatura. Entretanto quando avaliamos o perfil de replicação do vírus HHV-6 nestes pacientes observamos que 13/21 (62%) apresentaram replicações pontuais e que somente 8/21 (38%) apresentaram replicação sustentada.

Estudo de Zerr et al. (2005) em receptores de transplante de células hematopoiéticas, avaliou a incidência da reativação pelo HHV-6 através da PCR em tempo real em amostras de plasma, sendo que reativação viral foi definida como a detecção de 25 cópias/mL de plasma. A incidência de reativação foi de 47% (52/110 pacientes), entretanto dos 52 pacientes com detecção de DNA viral, 21 apresentaram mais de uma amostra positiva, e destes, nove apresentaram resultados positivos

intermitentes e 12 apresentaram detecção consecutiva. Sendo assim apenas 12/52 (23%) pacientes apresentaram sustentação da replicação viral (taxa muito semelhante aos resultados encontrados em nosso estudo. Alta carga viral de HHV-6, definida como carga maior que o limite do valor médio (ou maior que 138 cópias/mL) ou maior que o percentil 75 (ou > 881 cópias/mL) foi fator preditor estatisticamente significativo para disfunção subseqüente do sistema nervoso central.

Estudo recente de Pagter et al. (2008) em crianças receptoras de transplante de células hematopoiéticas, avaliou a incidência da reativação pelo HHV-6 e a morbidade e mortalidade associados. Trata-se de uma coorte prospectiva com acompanhamento e coleta de plasma semanal, por período de quatro meses e realização da PCR em tempo real para o diagnóstico. Episódio de reativação do HHV-6 foi definido como a detecção de mais de uma amostra consecutiva positiva, sendo os pacientes divididos em três grupos de acordo com a reativação pelo HHV-6: pacientes sem reativação, pacientes com carga viral entre 250 e 1.000 cópias/mL e pacientes com carga viral maior do que 1.000 cópias/mL. A incidência de reativação do HHV-6 neste estudo foi alta, representada por 67% dos pacientes, entretanto a incidência foi de 45% quando considerados os pacientes que apresentaram alta carga viral (maior do que 1.000 cópias/mL). Alta carga viral do HHV-6 foi fator preditivo independente para doença do enxerto versus hospedeiro aguda e crônica e menor taxa de sobrevida.

Sendo assim, em virtude da alta sensibilidade da PCR “nested” e da alta

incidência de replicações pontuais provavelmente relacionadas à detecção de DNA latente, sugerimos que a real incidência de infecção ativa corresponde aos 8/30 (26%) dos pacientes que sustentaram a replicação viral e que para o diagnóstico clínico de infecção ativa pelo HHV-6 são necessárias coletas de amostras consecutivas ao invés de amostra única. Destacamos, entretanto, que não houve qualquer diferença na evolução clínica destes pacientes em comparação com o grupo de pacientes que apresentaram replicações pontuais pelo HHV-6.

No presente estudo observamos através da PCR em tempo real que a carga viral média foi maior (1,3. 108 cópias/mL plasma) nos pacientes que sustentaram a replicação viral, definida pela detecção do DNA viral no plasma por período maior do que uma semana, em comparação com os pacientes que apresentaram replicações pontuais (média da carga viral de 9,9. 106 cópias/mL plasma). Esses dados estão de acordo com estudos recentes da literatura que associam a reativação do HHV-6 em

pacientes imunossuprimidos com a detecção de altas cargas virais em amostras de plasma.

Existem poucos estudos na literatura que associam fatores de risco para reativação do HHV-6 em pacientes imunossuprimidos, alguns sugerem o tratamento anti-rejeição com anticorpo antilinfocitário, entretanto esses estudos compreendem relatos de caso (Rossi et al., 2001; Nash et al., 2004). Estudo com receptores de transplante de células hematopoiéticas demonstraram que terapia com corticóide, discordância de sexo entre o receptor e o doador, outra doença de base hematológica que não seja primeira remissão e pacientes mais jovens são todos fatores preditores independente de reativação viral (Zerr et al., 2005). O presente estudo não foi desenhado para avaliar fatores de risco para reativação viral, entretanto, apesar das limitações, foi observado que receptores com carga viral maior do que 104 cópias/mL plasma no pré-transplante apresentavam maior risco de reativação do HHV-6 (quando o ensaio utilizado para o diagnóstico foi a PCR em tempo real). Também foi observado que além da carga viral alta nos receptores pré-transplante (maior do que104 cópias/mL plasma) a sorologia do receptor pré-transplante com IgM positivo foram fator de risco para sustentação da replicação viral.

Neste estudo não foi observado maior frequência de reativação viral do HHV-6 em pacientes que realizaram terapia de indução, como sugerido na literatura. Possivelmente pode-se justificar esta menor freqüência pelo fato de que o uso de anticorpos antilinfocitários gera uma depleção importante no número de linfócitos, local onde o HHV-6 replica.

Neste estudo a média de tempo para detecção de DNA viral no plasma pós- transplante foi de 31,6 dias (2–114 dias) com mediana de 15 dias o que está de acordo com dados da literatura que demonstram que a infecção por HHV-6 em pacientes transplantados resulta da reativação de vírus latente, ocorrendo geralmente nos primeiros dois meses após o transplante, com maior freqüência entre a segunda e a quarta semana (Singh, Carrigan, 1996).

Em nosso estudo 80% dos episódios de infecção ativa foram assintomáticos, e apresentaram pequena relação com outros eventos infecciosos.

Apesar de geralmente assintomática, a infecção pelo HHV-6 em pacientes transplantados tem sido associada com algumas manifestações clínicas incluindo

doença febril (Yoshikawa et al., 2000), “rash” cutâneo inespecífico, pneumonite intersticial (Cone et al., 1993; Hentrich et al., 2005), hepatite (Appleton et al., 1995; Lautenschlager et al., 1998; Hentrich et al., 2005), encefalite (Paterson et al., 1999; Rogers et al., 2000; Singh, Paterson, 2000; Bollen et al., 2001) e supressão da medula óssea (Singh et al., 1997). Entretanto ainda são necessárias associações consistentes entre a infecção pelo HHV-6 e estas manifestações, em parte devido ao pequeno número de casos relatados assim como a variação nas metodologias diagnósticas utilizadas na detecção viral (Zerr et al., 2005).

Sendo assim, apesar do pequeno número de pacientes avaliados podemos considerar que este é um vírus que não está associado a repercussões clínicas importantes em pacientes transplantados renais, na grande maioria das vezes resultando em infecções assintomáticas, entretanto devem ser considerados seus efeitos imunomodulatórios podendo causar supressão importante da imunidade celular e predispor a infecções oportunistas, principalmente pelo CMV.

“Screnning” sorológico para HHV-6 pré-transplante apresenta pouco benefício, em virtude de esta ser uma infecção ubíqua, com mais de 95% dos pacientes apresentando sorologia positiva e não estar associada a manifestações clínicas importantes como foi demonstrado neste estudo. Da mesma forma detecção de infecção prévia ou recente por HHV-6 não deve ser utilizada como critério para contra- indicação de transplante renal.

Estudo com pacientes transplantados de órgãos sólidos concluiu que a infecção pelo HHV-6 (diagnosticada através de sorologia ou cultura viral) é comum, entretanto somente foi associada a manifestações clínicas graves quando acompanhada da infecção pelo CMV (Herbein et al., 1996). Estudo similar de Ratnamohan et al. (1998) concluíram que a detecção dos dois vírus concomitantemente (detecção do HHV-6 através da PCR em amostras de soro e urina) foi o fator preditor mais importante para doença “viral” sintomática.

Neste estudo, 52,3% dos pacientes que evoluíram com infecção ativa pelo HHV- 6 (DNA viral detectado no plasma através da PCR “nested”) apresentaram co-infecção pelo CMV (antigenemia positiva), sendo 64% episódios assintomáticos, 18% síndrome relacionada ao CMV e 18% doença invasiva pelo CMV. Entretanto apenas 33% dos pacientes com ausência de detecção de DNA viral no plasma apresentaram co- infecção pelo CMV e nestes 100% dos casos tratava-se de infecção assintomática. Nos

casos de co-infecção HHV-6/CMV foi observado primeiramente a detecção HHV-6 em 4/11 (36%) com média de positivação do PCR para HHV-6 de 30 dias antes, em 4/11 (36%) foi observado primeiramente a detecção do CMV com posterior detecção do HHV-6 com média de positivação da antigenemia 21,5 dias antes e em 3/11 (27%) apresentaram detecção do HHV-6 e do CMV concomitantemente.

Vários estudos na literatura têm demonstrado que a infecção ativa pelo HHV-6 após transplante de órgãos sólidos aumenta o risco da infecção pelo CMV e altera a sua história natural (Dockrell et al., 1997; Griffiths et al., 1999), e embora a maioria dos estudos utilize técnicas diferentes para o diagnóstico do HHV-6 (aumento dos títulos