İmar Hakkı Aktarımı (Transfer Of Development Rights –TDR) Modeli

infestans

3.3.1 Cromatografia de afinidade em coluna quimotripsina-Sepharose: A quimotripsina tratada com o inibidor TLCK obtida comercialmente (Sigma Aldrich) foi acoplada à Sepharose 4B CNBr - ativada de acordo com instruções do fabricante (Amersham Biosciences). Foi feito um extrato de estômagos de

24 370 barbeiros T. infestans não alimentados em tampão Tris 50 mM pH 8,0 contendo NaCl 0,15 M. Após duas centrifugações a 15700 g por 30 min cada, o extrato foi filtrado e aplicado na coluna de quimotripsina-Sepharose. A coluna foi lavada com tampão Tris 50 mM pH 8,0 contendo NaCl 0,3 M, com sete volumes de coluna, em seguida foi realizada a eluição com solução de KCl 0,5 M pH 2,0. As frações eluídas foram neutralizadas com tampão Tris 1,0 M pH 8,0.

3.3.2 Determinação da atividade inibitória sobre diferentes serinoproteases: As atividades proteolíticas foram determinadas por meio da hidrólise de substratos cromogênicos monitoradas pela leitura de A405 utilizando-se leitora de placa modelo Synergy HT (Biotek) de acordo com Erlanger et al (1961). Nos experimentos de inibição, as enzimas foram pré- incubadas por 5 min com diferentes concentrações de inibidor (até 1,0 µM) antes da adição do substrato. Foram utilizados os seguintes substratos: S2484, Glu-Pro-Val-pNa, (Calbiochem) para elastase de neutrófilos humana (HNE), Boc-Gly-Gly-Leu-pNa (Calbiochem) para subtilisina A e N-Suc-Ala-Ala-Pro- Phe-pNa (Fluka) para quimotripsina, proteinase K e as proteases PR1 do fungo Metarhizium anisopliae, N-α-tosyl-Gly-Pro-Arg-pNa (Calbiochem) para tripsina e S2238, HD-Phe-Pip-Arg-pNa, (Chromogenix) para trombina.

3.3.3 Determinação da constante de dissociação aparente (Ki): As

constantes de dissociação aparente (Ki) foram obtidas por meio da atividade amidolítica residual das serinoproteases ensaiadas em presença do inibidor. As enzimas foram pré-incubadas a 37oC com quantidades crescentes de inibidor,

25 em seguida a atividade residual das enzimas obtida pela hidrólise de substratos cromogênicos específicos foi mensurada pela leitura de A405. Os valores de Ki foram então calculados utilizando-se a equação: Vi /Vo = 1 - {Et + It + Ki - [(Et + It + Ki)2 - 4EtIt]1/2} / 2Et (Morrison, 1969), onde Vi e Vo são as velocidades na presença e ausência de inibidor, respectivamente, Et corresponde à concentração total da enzima, e It corresponde à concentração total do inibidor.

3.3.4 Cromatografia de fase reversa em coluna Sephasil Peptide C8: A

cromatografia foi realizada em sistema ÄKTA (Amersham Biosciences) utilizando coluna Sephasil Peptide C8 equilibrada com solução aquosa de ácido trifluoracético (TFA) 0,1% (solução A). Após aplicação da amostra na coluna, as proteínas ligadas foram eluídas utilizando gradiente de acetonitrila (0 - 90%) (solução B) com fluxo constante de 1 mL/min. A cromatografia foi acompanhada por leitura de absorbância em 215 e 280 nm. As amostras coletadas foram liofilizadas e utilizadas para seqüenciamento automático de aminoácidos e espectrometria de massa.

3.3.5 Seqüênciamento N-terminal de proteínas: Após cromatografia de fase reversa, as proteínas nativas foram submetidas ao seqüenciamento da porção N-terminal pelo método da degradação de Edman (Edman & Begg, 1967) utilizando seqüenciador automático PPSQ-23 (Shimadzu). Este procedimento foi realizado pela Dra. Izaura Y. Hirata do Departamento de Biofísica da UNIFESP.

26 3.3.6 Espectrometria de massa MALDI–TOF: As massas moleculares das proteínas purificadas em cromatografia de fase reversa foram determinadas utilizando aparelho Micromass TofSpec-2 no modo de íon positivo usando como matriz o ácido α-ciano-4-hidroxicinamico. Este procedimento foi realizado pela Profa. Dra. Maria Aparecida Juliano do Departamento de Biofísica da UNIFESP.

3. 4 Expressão e purificação de rINF1R

3.4.1 Expressão de rINF1R em bactérias E. coli BL21 SI (Invitrogen): Um pré-inóculo de cultura de bactéria correspondendo a 10% do volume final da cultura de expressão foi preparado em meio TB (Sambrook et al., 1989) a 37ºC durante a noite. No dia seguinte, o pré-inóculo foi adicionado ao restante do volume (90%). Para a indução da proteína recombinante foi adicionada uma solução de NaCl em concentração final de 0,3 M, em cultura de bactérias com A600 entre 0,5 e 0,7. Após 12 h de incubação, as bactérias foram coletadas por centrifugação para extração das proteínas do periplasma.

3.4.2 Extração de proteínas recombinantes do periplasma de bactéria E.

coli: Protocolo segundo manual do sistema pET de expressão heteróloga

(Novagen). Bactérias obtidas após centrifugação (2,5 L de cultura) a 2000 g, por 20 min a 4°C, foram ressuspensas suavemente em tampão Tris 50 mM pH 8,0 contendo 20% sacarose, até volume final de 1 L. Em seguida, foi adicionado uma solução de EDTA para concentração final de 1 mM e, então, a suspensão de bactérias foi levemente agitada por 10 min. As bactérias foram novamente centrifugadas a 7000 g a 4ºC e o sobrenadante foi descartado. Em

27 seguida, as bactérias foram suavemente ressuspensas em solução gelada de Tris-HCl 5 mM, pH 8,0 até volume final de 1 L e permaneceram sob agitação por 10 min. Para obter a fração periplasmática, a suspensão de bactérias foi centrifugada a 10000 g por 30 min a 4ºC. O sobrenadante resultante foi filtrado com filtro 0,2 µm (Millipore) e mantido a - 20ºC.

3.4.3 Cromatografia de troca iônica em sistema ÄKTA (Amersham Biosciences): Foram usadas as colunas de troca catiônica HiTrap Q (5 mL) e Resource Q (1 mL) para purificação de rINF1R. As colunas foram equilibradas em tampão Tris-HCl 50 mM pH 8,0 (solução A) e a eluição das proteínas foi realizada utilizando gradiente linear de NaCl até concentração final de 1 M no tampão de equilíbrio (solução B). O material aplicado na coluna Resource Q foi previamente submetido a uma coluna HiTrap Desalting para a troca do tampão da amostra.

3.4.4 Cromatografia em gel filtração Superdex 75 em sistema ÄKTA (Amersham Biosciences): A fração ativa e concentrada da coluna Resource Q (1 mL) foi aplicada a coluna Superdex 75 (100 mL) previamente equilibrada em tampão Tris 50 mM pH 8,0, NaCl 0,2 M. A eluição da proteína foi feita em fluxo de 1,0 mL/min com o mesmo tampão de equilíbrio.

3.4.5 Eletroforese em gel de poliacrilamida com SDS (SDS-PAGE): As eletroforeses em gel de poliacrilamida foram realizadas segundo método descrito por Laemmli (1970). O gel de separação de proteínas (12,5%) foi preparado utilizando-se solução de acrilamida/bis acrilamida de 30:0,8 em

28 tampão Tris 0,4 M pH 8,8, contendo SDS 0,1%, TEMED 0,15% e persulfato de amônio 0,05%. O gel de concentração das amostras foi preparado com solução de acrilamida/bisacrilamida 30:0,8%, na concentração final de 5% em tampão Tris 0,1 M pH 6,8, contendo TEMED 0,05% e persulfato de amônio 0,05%. As amostras foram preparadas por diluição na proporção de 2:1 em tampão de amostra 3 vezes concentrado (condições não desnaturantes) e diluídas na proporção de 2:1 em tampão de amostra 3 vezes concentrado contendo DTT (200 mg/mL) e aquecidas a 95ºC por 5 min (condições desnaturantes).

3.5 Zimografia em SDS-PAGE: Foi utilizado gel de poliacrilamida 12%