Komşular Arasında Anlaşmazlık

5.1. Determinação da concentração de tiamina presente nas rações

Conforme mencionado anteriormente, a restrição maternal de tiamina foi induzida em ratas através do consumo de ração produzida no laboratório. Deste modo, para confirmar que a ração oferecida aos animais era de fato restrita em tiamina, quando comparada à ração padrão, o conteúdo desta vitamina foi determinado através de técnica cromatográfica, conforme detalhado abaixo. A quantidade de tiamina encontrada na ração comercial

“Nuvilab” foi utilizada como valor de referência.

5.1.1. Processamento das amostras de ração

As amostras foram processadas conforme anteriormente descrito por Tange e cols. (2006) com algumas modificações. As rações comercial e produzidas no laboratório (padrão e restrita) foram trituradas e homogeneizadas em 10 volumes de HCl 0,1 M. As amostras foram então colocadas sob agitação a 65°C durante 30 minutos e em seguida sonificadas em aparelho ultrassom pelo mesmo período de tempo. O homogenato resultante foi centrifugado a 7.800 x gpor 5 minutos (Sorvall RC-5B) e o sobrenadante depois de filtrado em membrana de 0,45 m foi armazenado a 4°C até o momento da derivatização.

Material e Métodos

27 5.1.2. Procedimento de Derivatização

A oxidação alcalina de tiamina que ocorre durante a reação de derivatização induz a formação de um composto altamente fluorescente e facilmente detectável por cromatografia líquida de alta eficiência - HPLC (Lynch & Young, 2000). Deste modo, diversos estudos cromatográficos utilizando derivatização pré-coluna com ferricianeto de potássio têm sido realizados com o intuito de avaliar o conteúdo de tiamina presente em alimentos (Valls et al, 1999; Tange et al, 2006; Batifoulier et al, 2006). A figura 6 mostra um esquema da reação de derivatização de tiamina com ferricianeto de potássio.

Neste trabalho, a derivatização foi realizada conforme descrito anteriormente por Losa e cols. (2005). A solução derivatizante constituída por 12,14 mM de ferricianeto de potássio e 3,35 M de hidróxido de sódio foi preparada no dia do ensaio e acrescentada à amostra (1:1 v/v). Após um minuto à temperatura ambiente, o produto da reação de derivatização foi neutralizado com 1,43 M de ácido fosfórico (1:1 v/v) e injetado no sistema cromatográfico.

5.1.3. Condições cromatográficas

O sistema cromatográfico utilizado consistiu de um cromatógrafo Shimadzu (LC-10AD, Tokyo, Japan) com válvula injetora de 200 L (Rheodyne 7725-I, California, USA) e detector fluorescente (FLD - Shimadzu spectrofluorometric detector RF-551, Tokyo, Japan) acoplado a uma bomba LC-10. Os comprimentos de onda de excitação e emissão utilizados foram de 365 e 435 nm, respectivamente. Uma coluna cromatográfica analítica de fase reversa C18 (150 mm×4,6 mm, ID) e pré-coluna (RT 250-4 E. Merck, Darmstadt E.R., Germany) foram utilizadas nas análises. A fase móvel isocrática consistiu de uma solução 0,2 M de fosfato de potássio monobásico, 0,72 mM de trietilamina e 25 % de metanol. Esta fase depois de filtrada em membrana de 0,45 m foi desgazeificada e injetada no sistema com um fluxo constante de 1,0 mL/min.

Um integrador (Shimadzu C-R7Ae plus) contendo um programa de análise de dados acoplado ao sistema cromatográfico forneceu a área dos picos dos cromatogramas a partir da intensidade de fluorescência. Em um tempo médio de 7,0 minutos a tiamina foi eluída de forma isocrática (Fig. 7). A concentração desta vitamina expressa em mg/Kg de ração foi calculada de acordo com a área do pico relativa à curva padrão. Os dados obtidos indicam que a ração padrão produzida no laboratório e utilizada no presente estudo, apresentou nível

Material e Métodos

semelhante de tiamina em relação à ração comercial e que a ração restrita apresentou cerca de 10% do conteúdo de tiamina em relação à ração padrão. (Tabela 6).

Reação de derivatização de tiamina

Cromatograma de tiamina

Tiamina Tiocromo

Tiamina Tiocromo

Figura 6: Representação esquemática da reação de derivatização de tiamina com

ferricianeto de potássio em condições alcalinas gerando tiocromo (composto fluorescente).

Figura 7: Cromatograma representativo do perfil obtido nas análises de tiamina presente

nas rações. A eluição de tiamina ocorreu em um tempo médio de 7,0 minutos.

2,0 4,0 6,0 8,0 10,0 T iam in a R es p o sta D ete cto r F lu o re sc en te ( mV )

Tempo de Retenção (min)

0,0 50,0 100,0 2,0 4,0 6,0 8,0 10,0 T iam in a R es p o sta D ete cto r F lu o re sc en te ( mV )

Tempo de Retenção (min)

0,0 50,0 100,0

Material e Métodos

29 Concentração de tiamina nas rações

Tipo de Ração Concentração de tiamina (mg/Kg ração ± dpa)

Comercial “Nuvilab” 0,95 ± 0,035

Padrão produzida no laboratório 1,19 ± 0,006

Restrita produzida no laboratório 0,11 ± 0,001

Tabela 6: Concentrações de tiamina (mg/kg) presente nas rações comercial “Nuvilab” e produzidas no laboratório (padrão e restrita). dpa: desvio padrão.

5.2. Estabelecimento do método cromatográfico para dosagem de glutamato

e GABA em amostras de tecido cerebral

As condições estabelecidas e os experimentos realizados para a validação do método cromatográfico utilizado nas dosagens de glutamato e GABA são parte dos objetivos do presente estudo e encontram-se compilados em um trabalho publicado em 2009 na revista científica Journal of Neuroscience Methods (vide Anexo).

5.2.1. Manuseio dos animais

Vinte ratos Wistar machos pesando entre 250-300 gramas foram utilizados para o estabelecimento do método cromatográfico de dosagem de glutamato e GABA. Os animais foram alocados em caixas plásticas em grupos de cinco e mantidos no biotério em ciclo de 12 horas claro/escuro, recebendo água e ração ad libitum. Após a decapitação dos ratos o cérebro foi dissecado conforme anteriormente descrito na seção 4 e as amostras de tálamo, hipocampo e córtex pré-frontal foram processadas (ver detalhes abaixo, item 5.2.2).

Material e Métodos

5.2.2. Processamento das amostras

As amostras de tálamo, hipocampo ou córtex pré-frontal foram pesadas e homogeneizadas em 15 volumes de solução metanol: água (85:15 v/v) em homogeneizador automático. Em seguida, o homogenato foi centrifugado, a 4ºC, durante 15 minutos em uma rotação de 7.800 x g (Sorvall RC-5B). O sobrenadante obtido após centrifugação foi coletado e mantido no gelo até ser submetido à derivatização.

5.2.3. Procedimento de Derivatização

Devido à ausência de características eletroativas ou fluorescentes intrínsecas nos aminoácidos GABA e glutamato, diversos trabalhos têm utilizado a técnica de derivatização pré-coluna para a separação e identificação cromatográfica desses compostos. Um dos agentes derivatizantes mais utilizados é o ortoftaldeído (OPA), que reage com aminas primárias na presença de tiol (Fig. 8) e gera derivados que são eletroativos e fluorescentes (Carlson et al., 2003; Zhang et al., 2005; Sheng et al., 2005; Devall et al., 2007).

No presente trabalho a derivatização pré-coluna foi realizada conforme descrito previamente por Mengerink e cols. (2002) e Kutlán & Molnár-Perl (2003). A reação de derivatização foi feita misturando-se 100 L de amostra, 20 L de OPA metanólico (5 mg/mL) preparado no dia do ensaio, 75 L de tampão borato (pH 9,9) e 5 L de ácido 3- mercaptopropiônico (MPA). A solução resultante foi levemente agitada e injetada no sistema cromatográfico após 1 minuto, à temperatura ambiente.

5.2.4. Condições cromatográficas

O sistema cromatográfico utilizado para as determinações de GABA e glutamato foi o mesmo descrito na seção 5.1.3. utilizado para dosagem de tiamina, porém, os comprimentos de onda de excitação e emissão utilizados foram de 337 e 454 nm, respectivamente. A fase móvel isocrática consistiu de uma solução 0,05 M de acetato de sódio, tetrahidrofurano e metanol (50:1:49 v/v), pH 4,0. GABA e glutamato foram eluídos em um tempo inferior a 9 minutos e as concentrações desses neurotramissores nas amostras de tecido cerebral foram calculadas de acordo com as áreas dos picos e respectivas curvas padrões.

Material e Métodos

31 Reação de derivatização utilizando OPA