Utilizou-se tampão fosfato de sódio 0,05 mol/l pH 6,8 como solvente e selecionou-se λ 250 nm para a análise espectrofotométrica. O teor do princípio ativo foi expresso em relação à quantidade declarada de MPA.
5.3.10.1 Seletividade
A seletividade do método foi avaliada de maneira análoga ao descrito na seção
Tabela 19 - Formulação simulada para comprimidos de micofenolato de sódio. Componente % Micofenolato de sódio 55,0 Amido de milho 3,0 Povidona K-90 2,0 Crospovidona 2,2 Lactose 20,0
Dióxido de silício coloidal 0,5
Estearato de magnésio 1,0
Hidroxipropilmetilcelulose 15,0
Dióxido de titânio 1,0
Indigotina 0,1
Óxido de ferro vermelho 0,1
Óxido de ferro amarelo 0,1
Cerca de 18 mg do placebo foram transferidos para balão volumétrico de 50 ml com auxílio de 30 ml de tampão fosfato de sódio 0,05 mol/l pH 6,8. Deixou-se em ultrassom durante 5 minutos e completou-se o volume com o mesmo solvente. Após filtração, transferiram-se 2,5 ml para balão volumétrico de 50 ml e completou-se o volume com o tampão.
Preparou-se solução de MSD padrão de trabalho equivalente a 18 µg/ml de MPA nas mesmas condições. O espectro da solução do placebo na faixa λ 200 a 400 nm foi sobreposto ao espectro obtido para solução de MSD.
5.3.10.2 Linearidade
Preparou-se uma solução estoque de MSD padrão de trabalho equivalente a 1 mg/ml de MPA em água. Transferiram-se alíquotas adequadas da solução estoque
para balões volumétricos de 25 ml, de modo a obter concentrações de 33% a 189% da concentração de trabalho (MPA 18 µg/ml), conforme apresentado na Tabela 20. O procedimento foi realizado em triplicata para cada nível de concentração.
Tabela 20 - Preparo das soluções de ácido micofenólico para avaliação da linearidade do método por
espectrofotometria no ultravioleta.
Nível (%) Volume da SPE (ml) Tampão q.s.p. (ml) Concentração (µg/ml) 33 0,15 25 6 56 0,25 25 10 78 0,35 25 14 100 0,45 25 18 122 0,55 25 22 144 0,65 25 26 167 0,75 25 30 189 0,85 25 34
Os resultados foram avaliados utilizando o método dos mínimos quadrados ordinários. Verificaram-se os parâmetros de normalidade, independência e homoscedasticidade dos resíduos, o coeficiente de correlação, o intercepto da curva e o ajuste dos dados ao modelo de regressão linear, conforme seção 5.1.5.3.
5.3.10.3 Exatidão
A exatidão foi avaliada pelo método de contaminação do placebo em um dia de análise e determinada em triplicata em três níveis de concentração, conforme
5.3.5.3. Quantidades conhecidas de MPA foram incorporadas ao placebo, de modo a
obter soluções com concentrações equivalentes a 70%, 100% e 130% da concentração de trabalho.
Preparou-se uma solução estoque de MSD em água equivalente a 2,25 mg/ml de MPA. Transferiram-se alíquotas da solução estoque para balões volumétricos de 25 ml contendo cerca de 15 mg de placebo, conforme apresentado na Tabela 21. Adicionaram-se 15 ml de tampão fosfato de sódio 0,05 mol/l pH 6,8 e deixou-se em ultrassom por 5 minutos. Completou-se o volume com o mesmo solvente. Após filtração, transferiram-se 2,0 ml para balão volumétrico de 25 ml e completou-se o volume com o tampão. Preparou-se solução padrão de MSD equivalente a 18 g/ml de MPA nas mesmas condições.
Tabela 21 - Preparo das soluções de placebo contaminado para avaliação da exatidão do método de
doseamento de micofenolato de sódio em comprimidos por espectrofotometria no ultravioleta.
Nível (%) Quantidade de placebo (mg) Volume da solução estoque (ml) Concentração MPA após diluição (µg/ml) 70 15 1,75 12,6 100 15 2,50 18,0 130 15 3,25 23,4 5.3.10.4 Precisão
Realizaram-se seis determinações do teor de MSD em Myfortic® a 100% da concentração de trabalho (18 µg/ml de MPA) em três dias de análises com analistas diferentes (n = 18). A repetitividade e a precisão intermediária foram avaliadas de acordo com 5.1.4.1.
Não foi possível obter uma amostra homogênea a partir da pulverização dos comprimidos de Myfortic®, uma vez que eles apresentam revestimento gastrorresistente polimérico não triturável. Sendo assim, as réplicas da precisão foram preparadas a partir de uma solução estoque contendo cinco unidades do produto, conforme descrito a seguir.
Solução amostra estoque: transferiram-se cinco comprimidos para balão volumétrico
de 500 ml. Adicionaram-se 250 ml de tampão fosfato de sódio 0,05 mol/l pH 6,8 e agitou-se mecanicamente durante 15 minutos para a solubilização do revestimento. Posteriormente, deixou-se em ultrassom por 15 minutos para a desintegração de todos os núcleos. Completou-se o volume com o tampão e filtrou-se.
Solução amostra: transferiram-se 2,5 ml da solução estoque para balão volumétrico
de 50 ml e completou-se o volume com tampão fosfato de sódio 0,05 mol/l pH 6,8. Em seguida, transferiram-se 2,5 ml para balão volumétrico de 25 ml e completou-se o volume com o tampão.
Solução padrão: transferiram-se, exatamente, cerca de 11,25 mg do padrão de MPA
para balão volumétrico de 50 ml e dissolveu-se em metanol. Em seguida, transferiram-se 2,0 ml para balão volumétrico de 25 ml e completou-se o volume com tampão fosfato de sódio 0,05 mol/l pH 6,8.
5.3.10.5 Robustez
A robustez foi avaliada pelo doseamento de Myfortic® em equipamentos distintos. Realizaram-se seis determinações a 100% da concentração de trabalho, conforme descrito na seção 5.3.10.4. Os resultados foram comparados utilizando a estatística t para dados pareados (α = 0,05).
5.3.10.6 Limites de detecção e quantificação
Os limites de detecção e quantificação foram estimados com base na inclinação e no desvio padrão do intercepto da curva analítica, de acordo com as equações (5) e (6), respectivamente (seção 5.1.5.7).
5.3.11 Determinação do teor de micofenolato de sódio por cromatografia líquida de alta eficiência
O doseamento de micofenolato de sódio em Myfortic® foi realizado utilizando o método cromatográfico desenvolvido para matéria-prima (seção 5.1.5). O teor do princípio ativo foi expresso em relação à quantidade declarada de MPA.
5.3.11.1 Seletividade
A seletividade foi demonstrada frente aos produtos de degradação de MSD obtidos pela hidrólise em meio ácido, neutro e alcalino e pela exposição da matéria-prima à temperatura, luz e umidade do ambiente durante um período de 120 dias (seção
6.1.5.2). Adicionalmente, verificou-se a interferência dos componentes da
formulação simulada (Tabela 19).
A solução placebo foi obtida pela transferência de 18,0 mg do placebo para balão volumétrico de 50 ml com auxílio de 30 ml do diluente (metanol e água, 55:45). Deixou-se em ultrassom durante 5 minutos e completou-se o volume com o mesmo solvente. Após filtração, transferiu-se 1,0 ml para balão volumétrico de 10 ml e completou-se o volume com o diluente. Preparou-se uma solução de MSD padrão de trabalho equivalente a 36 µg/ml de MPA nas mesmas condições. O cromatograma do placebo foi sobreposto ao da solução de MSD para verificar a existência de interferência dos excipientes.
5.3.11.2 Linearidade
Procedeu-se conforme descrito na seção 5.1.5.3. A curva analítica foi construída em função da concentração de MPA.
5.3.11.3 Exatidão
A exatidão do método foi avaliada pelo método de contaminação do placebo em um dia de análise e determinada em triplicata em três níveis de concentração. Quantidades conhecidas de MPA foram incorporadas ao placebo, de modo a obter soluções com concentrações equivalentes a 70%, 100% e 130% da concentração de trabalho. As porcentagens de recuperação foram determinadas de acordo com o especificado em 5.3.5.3.
Preparou-se uma solução estoque de MSD em água equivalente a 2,25 mg/ml de MPA. Transferiram-se alíquotas da solução estoque para balões volumétricos de 25 ml contendo cerca de 25 mg do placebo, conforme apresentado na Tabela 22. Adicionaram-se 15 ml do diluente e deixou-se em ultrassom por 5 minutos. Completou-se o volume com o mesmo solvente. Após filtração, transferiram-se 2,0 ml para balão volumétrico de 25 ml e completou-se o volume com o diluente. Preparou-se solução padrão de MPA 36 g/ml nas mesmas condições.
Tabela 22 - Preparo das soluções de placebo contaminado para avaliação da exatidão do método de
doseamento de micofenolato de sódio em comprimidos por cromatografia líquida de alta eficiência.
Nível (%) Quantidade de placebo (mg) Volume da solução estoque (ml) Concentração MPA após diluição (µg/ml) 70 25 3,5 25,2 100 25 5,0 36,0 130 25 6,5 46,8 5.3.11.4 Precisão
A precisão foi avaliada por seis determinações a 100% da concentração de trabalho (36 µg/ml de MPA) em três dias de análises com analistas diferentes (n = 18). A repetitividade e a precisão intermediária foram avaliadas conforme seção 5.1.4.1. O preparo das soluções amostra e padrão estão descritos a seguir.
Solução amostra estoque: transferiram-se cinco comprimidos para balão volumétrico
de 500 ml. Adicionaram-se 275 ml de metanol e deixou-se em ultrassom durante 15 minutos. Completou-se o volume com água e filtrou-se.
Solução amostra: transferiram-se 2,5 ml da solução estoque para balão volumétrico
de 25 ml e completou-se o volume com o diluente. Em seguida, transferiram-se 2,5 ml para balão volumétrico de 25 ml e completou-se o volume com o mesmo solvente.
Solução padrão: transferiram-se, exatamente, cerca de 11,25 mg do padrão de MPA
para balão volumétrico de 50 ml e dissolveu-se em metanol. Em seguida, transferiram-se 4,0 ml para balão volumétrico de 25 ml e completou-se o volume com o diluente.
5.3.11.5 Robustez
A robustez foi verificada de acordo com o procedimento da seção 5.1.5.6. As soluções amostra e padrão foram preparadas conforme descrito em 5.3.11.4.
5.3.11.6 Limites de detecção e quantificação
Procedeu-se conforme descrito na seção 5.1.5.7. Os limites obtidos foram expressos em relação à concentração de MPA.
5.3.12 Comparação entre os métodos de determinação de micofenolato de