Küreselleşme

A escolha dos isolados brasileiros, provenientes de surtos da BIG em granjas da avicultura industrial do estado de Minas

Gerais e abrangendo duas décadas

(período entre 1972 e 1989) desta importante atividade da pecuária nacional, visou atender a um antigo sonho no sentido de procurar entender melhor as situações que, hipoteticamente, estariam envolvidas em todo aquele processo saúde / doença. Assim, nada melhor do que estudar os isolados de VBIG que, seguramente,

tiveram importante papel naqueles

acontecimentos e têm muita história para contar, mas a linguagem informativa deles é diferente da humana e a idéia foi começar a interpretá-la com a metodologia molecular disponível atualmente para esta finalidade. Isto é uma das coisas importantes e positivas do futuro: poder resgatar o passado.

Os VBIGs de referência importados foram importantíssimos porque, além de ajudarem

no controle das atividades de

processamento do material nas diversas fases do desenvolvimento experimental, propiciaram sustentação científica ao trabalho realizado e, conseqüentemente, confiabilidade aos resultados encontrados. A utilização do banco de seqüências (GenBank) da parte de interesse do gene S2 dos VBIGs idênticos aos trabalhados (M- 41, A-5968 / C-46, Ark-99, JMK, SE-17 e UK/6-82) foi de fundamental importância neste trabalho por aumentar o grau de confiabilidade, inclusive na metodologia utilizada (funcionaram como controles,

praticamente, em todas as etapas

experimentais). Dos VBIGs vacinais atenuados utilizados na avicultura industrial brasileira, os quais poderiam ter sido adquiridos no comércio ou diretamente nos laboratórios que os produzem, optou-se apenas pelo H-52 em razão do fato de ser um vírus - semente original procedente de uma fonte confiável (Departamento de Agricultura dos Estados Unidos da América

-USDA/EUA). Os VBIGs vacinais,

principalmente quando são atenuados e,

quase sempre, são intensamente

manipulados nos laboratórios que os produzem, muitas vezes geram resultados diferentes dos esperados em função da seleção involuntária de mutantes e clones, situação que pode não interferir diretamente na eficiência vacinal mas seguramente prejudica a análise final em trabalhos com biologia molecular, conforme observado por outros autores (Dalton et al., 1998; Kim et al., 1998; Kusters et al., 1989a,b; Kusters et al., 1990; Song et al., 1998; Stirrups et al., 1998; Wang & Tsai, 1996). A metodologia utilizada permitiu detectar os VBIGs adquiridos com o propósito de serem referência (controles positivos) mas que, na verdade, estavam contaminados / trocados por outros, provavelmente no laboratório onde foram processados anteriormente (JMK, SE-17 e Iowa-97 – SPAFAS, EUA). Ao contrário do que pode parecer, esta situação aumentou ainda mais o grau de confiabilidade dos resultados encontrados por terem sido detectados tais problemas (contaminação entre VBIGs) no momento certo (RFLP comparada).

4.2. REPLICAÇÃO E CONCENTRAÇÃO VIRAL

Dentro da linha de pesquisa “Diagnóstico, epidemiologia e controle das doenças dos animais” do DMVP / EV / UFMG, os estudos já realizados pelo Grupo de Pesquisa em Saúde Avícola do Setor de Doenças das Aves, envolvendo alguns aspectos básicos e aplicados do VBIG, permitem afirmar que a metodologia utilizada (replicação e concentração viral objetivando a detecção deste vírus por RT-PCR) foi além da necessária para um teste desta natureza (bastariam poucos microlitros de LA - OEG/SPF contendo virions completos para que os resultados fossem os mesmos). A justificativa para a adoção de toda aquela metodologia laboriosa inicial deste trabalho foi que, até no momento de sua execução, o recomendado era concentrar o VBIG por ultracentrifugação em colchão ou gradiente de sacarose visando a purificação viral (Andreasen et al., 1991; Jia et al., 1995; Kwon et al., 1993a,b; Lin et al., 1991a; Sutou et al., 1988; Zwaagstra et al., 1992)

para extração do RNA viral puro, condição que era considerada vital para a realização de uma adequada RT-PCR livre de inibidores (Andreasen et al., 1991; Lin et al.,

1991a). A decisão de realizar a

concentração dos LAs de OEG/SPF

contendo VBIG por desidratação foi tomada mais pela praticidade, indisponibilidade de ultracentrífuga, intuição de que este obstáculo não poderia ser o principal entrave para um teste tão genial (jamais seria utilizado no diagnóstico rotineiro, caso dependesse de ultracentrífuga) do que pela confiabilidade prévia no sucesso da técnica. Felizmente, a escolha foi correta (Abreu, 2000; Resende et al., 1998) e daria certo de qualquer jeito (uso direto do LA com VBIG sem concentração ou, por exemplo, após concentração por precipitação com solução saturada de sulfato de amônio - ambas testadas e aprovadas, posteriormente, mas os resultados não são apresentados aqui), desde que a integridade viral fosse mantida até o momento da extração adequada do RNA viral, acompanhado de outros RNAs ou puro. Os passos posteriores, realmente, foram os mais importantes e exigiram maiores cuidados, principalmente aqueles previstos nos protocolos de execução, caso a caso.

4.3. EXTRAÇÃO E QUANTIFICAÇÃO DO RNA TOTAL (INCLUINDO O VIRAL)

O RNAtiv extraído com a metodologia utilizada neste trabalho permaneceu íntegro e o emprego do produto comercial denominado “Trizol LS” (BRL, EUA) foi de fundamental importância, principalmente por ser altamente eficiente e rápido (passo único), diferentemente das recomendações publicadas para extração de RNA de VBIG até aquele momento (Andreasen et al., 1991; Jackwood et al., 1992; Kwon et al., 1993a,b; Lin et al., 1991a). A manipulação do RNAtiv, durante a realização da espectrofotometria para dosagem de sua concentração final e diluição para uso na RT, recomendada por Jackwood et al. (1992) e Lin et al. (1991a), foi importante mas, dentro da filosofia original da RT-PCR (rapidez, simplicidade e amplificação a partir de um único RNA transcrito em cDNA, teoricamente), pareceu um contra-senso

naquele momento. Ocorreu uma grande variação nas concentrações (µg / mL) dos RNAtivs individuais dos VBIGs / isolados [M-

41 (196), A-5968 / C-46 (76), JMK (66), SE- 17 (54), UK/6-82 (40), Ark-99 (64), H-52 (138), Iowa-97 (40), 208 (98), 29-78 (118), 283 (138), 290 (60), 297 (46), 319 (126), 327 (134), 351 (40), PM1 (140), PM2 (148), PM3 (80), PM4 (62), G (80), TII (66), 200 (138) e, também, dos controles negativos VDN - La Sota (40) e o pool de LAs (14) - a percentagem de pureza do RNA variou de 74 a 87% nos RNAtivs, inclusive nos

controles negativos, conforme obtido com a utilização da metodologia descrita no item 3.7], o que era esperado com base nas informações da literatura consultada (Andreasen et al., 1991; Jackwood et al., 1992; Kwon et al., 1993a,b; Lin et al., 1991a). A implicação direta desta variabilidade natural nas concentrações dos RNAtiv foi a necessidade do uso de concentrações também variáveis dos RNAtiv individuais na RT [concentração mínima de 0,14 µg (pool de LAs) e máxima de 1,96 µg (M-41) por reação (20 µL), após diluição], sendo que o recomendado era o uso de 1 a 5 µg de RNAtiv por RT (BRL, 1993a; Lin et al., 1991a). Os resultados posteriores (RT-PCR, após otimização) mostraram que esta variação não interferiu nos resultados esperados, a julgar pela amplificação normal dos cDNAs de dois VBIGs de referência (controles positivos - M-41 e H-52) e quatro isolados brasileiros (283, 327, PM1 e PM2) com altas concentrações de RNAtiv, os quais, paralelamente ao trabalho normal, foram diluídos (água 18MΩ livre RNases/DNases) e submetidos à RT nas concentrações mínimas trabalhadas (0,14 µg / 10 µL / RT), visando comprovar a eficiência da metodologia utilizada mesmo quando o total de RNAtiv estava muito abaixo do recomendado. Certamente, nem todo o RNAtiv pertencia ao VBIG e, também, dificilmente estava 100% puro, além de nem todos estarem íntegros (degradação ocorre com relativa freqüência durante a remoção da nucleoproteína N protetora do RNA) (Adzhar et al., 1996; Newton, 1995; Resende et al., 1998).

4.4. SÍNTESE DE cDNA (DNA