3.5.1. Atividade sobre o crescimento dos trofozoítos
Para avaliar o efeito dos inibidores de proteases sobre o crescimento de G. duodenalis, trofozoítos obtidos como descrito no item 3.3 foram contados em câmara de Neubauer, e 105 parasitas/ml foram inoculados em tubos contendo meio TYI-S-33 (4,5 ml) e os inibidores diluídos em tampão fosfato 0,1 M (pH 7,2) e filtrados em membrana esterilizante 0,22 Pm.
Os trofozoítos expostos aos inibidores, nas referidas concentrações (Quadro 1), foram incubados a 37°C durante 24, 48 e 72 horas. Decorridos os períodos de incubação, os tubos foram mantidos em gelo por 10 minutos, centrifugados a 250g (10 minutos a 4°C) e os trofozoítos obtidos foram contados em câmara de Neubauer. Em todos os ensaios, culturas não tratadas (cultivos puros) e culturas tratadas com metronidazol (Flagyl®) a 40 Pg/ml foram incluídas como controles.
Os ensaios foram realizados em triplicata e a atividade dos inibidores sobre o crescimento de G. duodenalis foi avaliada, comparando-se as médias dos números de organismos recuperados nas culturas tratadas com as culturas controle. O efeito de cada inibidor nas suas respectivas concentrações foi expresso em porcentagem.
3.5.2. Atividade sobre a aderência dos trofozoítos
O efeito de inibidores de proteases sobre a aderência dos trofozoítos foi avaliado segundo a metodologia descrita por EDLIND et al.89, com modificações. Trofozoítos obtidos como descrito no item 3.3 foram contados em câmara de Neubauer e 105 parasitas/ml, inoculados em tubos contendo meio TYI-S-33, foram incubados durante quatro horas a 37°C. Em seguida, o meio puro (4,5 ml) foi substituído por meio acrescido dos inibidores nas referidas concentrações teste
(Quadro 1). Os trofozoítos expostos aos inibidores foram, então, incubados a 37°C durante 24 e 48 horas. Ao final da incubação, o meio de cada tubo foi substituído por 4,5 ml de tampão fosfato 0,1 M (pH 7,4), os tubos foram mantidos em gelo por 10 minutos e centrifugados a 250g (10 minutos a 4°C). O número de trofozoítos aderidos foi determinado em câmara de Neubauer. Em todos os ensaios, culturas não tratadas (cultivos puros) e culturas tratadas com metronidazol a 40 Pg/ml foram incluídas como controles.
Os ensaios foram realizados em triplicata e a atividade dos inibidores sobre a aderência dos trofozoítos de G. duodenalis foi avaliada, comparando-se as médias dos números de organismos aderidos recuperados nas culturas tratadas com as culturas controle. O efeito de cada inibidor nas suas respectivas concentrações foi expresso em porcentagem.
3.5.3. Atividade sobre a viabilidade dos trofozoítos
Para determinar a viabilidade dos trofozoítos expostos aos inibidores de proteases, empregou-se o método colorimétrico MTT, cujo princípio baseia-se na redução do sal de tetrazólio MTT a cristais de formazan pelas células viáveis, segundo metodologia descrita por PONCE-MACOTELA et al.90, com modificações. A viabilidade foi determinada tanto nos ensaios de crescimento quanto naqueles de aderência, após incubação dos trofozoítos apenas nos tempos de 48 e 72 horas e 48 horas respectivamente. Isso porque após 24 horas de exposição aos inibidores, a quantidade de células mostrou-se insuficiente para a determinação desse parâmetro.
Após contagem em câmara de Neubauer (itens 3.5.1 e 3.5.2), os trofozoítos incubados com os inibidores de proteases nas suas referidas concentrações (Quadro 1) durante 48 e 72 horas e os respectivos controles (culturas não tratadas e tratadas com metronidazol a 40 Pg/ml) foram transferidos para microtubos de 2 ml e lavados por uma vez (250g por 10 minutos a 4°C) em tampão fosfato 0,1 M (pH 7,4) para
remoção do meio de cultivo. Em seguida, os organismos recuperados foram incubados, na ausência de luz, durante uma hora a 37°C em 1 ml de tampão fosfato 0,1 M (pH 7,4) acrescido de 40 Pl de solução de MTT (Sigma) a 5 mg/ml e de 20 Pl de solução do catalisador PMS (Sigma) a 2,5 mg/ml. Após a incubação, os trofozoítos foram centrifugados (250g por 10 minutos a 4ºC) e o produto formado (cristais de formazan) foi dissolvido pela adição de 1 ml de isopropanol acidificado (HCl a 0,04 M). Do sobrenadante, 150 Pl foram transferidos para microplacas de polipropileno e a leitura das reações foi realizada determinando-se as unidades de densidade óptica (DO) a 540 nm.
Os ensaios foram realizados em triplicata e a atividade das diferentes concentrações dos inibidores sobre a viabilidade dos trofozoítos foi determinada, empregando-se a seguinte equação:
% viabilidade = DO (teste)
x 100 DO (controle)
Onde, “DO (teste)" representa a leitura da densidade óptica nas reações com os trofozoítos previamente expostos a uma determinada concentração do inibidor e "DO (controle)", a leitura da densidade óptica nas reações com os trofozoítos não tratados (culturas puras).
3.5.4. Análise ultraestrutural dos trofozoítos por microscopia eletrônica de transmissão
A análise ultraestrutural foi realizada no Centro de Microscopia Eletrônica do Instituto de Biociências/Unesp/Botucatu (CME) sob supervisão da Profa. Dra Daniela Carvalho dos Santos. Devido à similaridade enzimática com a leupeptina, não foi utilizada nesta análise o inibidor antipaina.
3.5.4.1. Preparo das amostras
Trofozoítos (105) obtidos como descrito no item 3.3 foram incubados a 37ºC durante 24, 48 e 72 horas com os inibidores de proteases nas concentrações de 10 e 100 µM. Após 10 minutos em banho de gelo, os tubos foram centrifugados a 250g por 10 minutos a 4°C. Após desprezar o sobrenadante, o sedimento contendo os trofozoítos foi transferido para microtubos de 1,5 ml e centrifugado (2000g, 10 minutos a 4°C) em tampão fosfato 0,1 M gelado (pH 7,4), a fim de se remover o meio de cultivo remanescente. Posteriormente, os trofozoítos foram fixados em glutaraldeído (Merck) a 2,5% diluído em tampão fosfato 0,1 M (pH 7,3) durante três horas a temperatura ambiente. Transcorrido esse período, os trofozoítos foram corados com azul tripan a 0,2% e permaneceram sob refrigeração por pelo menos 24 horas. Em seguida, os tubos foram novamente centrifugados (2000g, 10 minutos a 4°C), sendo acrescentada à massa celular, uma solução de gelatina (Merck) a 6% preparada em tampão fosfato 0,1 M (pH 7,3). Finalmente, essa suspensão foi armazenada a 4°C em tubos contendo glutaraldeído a 2,5%. Culturas controle (cultivos não tratados) foram processadas sem a adição dos inibidores de proteases.
3.5.4.2. Processamento das amostras
Os trofozoítos acrescidos de gelatina foram lavados por três vezes (cinco minutos) em tampão fosfato 0,1 M (pH 7,3). Em seguida, procedeu-se a pós-fixação durante duas horas em tetróxido de ósmio (Sigma) a 1% diluído em tampão fosfato 0,1 M (pH 7,3). Posteriormente, as células foram novamente lavadas (três vezes, cinco minutos) em água destilada e em seguida foram contrastadas em uma solução de acetato de uranila (Koch Electron Microscopy LTDA) a 0,5% durante duas horas. Logo após a contrastação, as células foram desidratadas em concentrações crescentes de acetona (Merck), como descrito a seguir: (1) acetona 50% (duas vezes, 10 minutos), (2) acetona 70% (duas vezes, 10 minutos), (3) acetona 90% (três vezes, 15 minutos) e
(4) acetona 100% (três vezes, 15 minutos). Em seguida, as células foram mantidas “overnight” em uma solução de resina de Araldite com acetona 100% (v/v). No dia seguinte, após mais uma hora de incubação em resina pura a 37ºC, o material foi incluído em moldes contendo uma nova solução de resina pura e incubado a 60°C durante 48 horas. Após a confecção dos blocos, o material foi trimado e submetido ao corte em secções ultrafinas (600 Ǻ) utilizando ultramicrótomo Ultracult UCT (Leica). Os cortes ultrafinos obtidos foram analisados em microscópio eletrônico de transmissão CM 100 (Philips) e Tecnai Spirit (FEI Company).