İş Doyumu Kavramı ve Önemi

IV.1.1. Répartition globale

Afin de mieux comprendre la répartition des microorganismes et de certains types d’EPS au sein des granules, nous avons effectué des observations au microscope confocal de coupes de granules de 40 µm d’épaisseur ayant subi différents marquages fluorescents. Les protéines ont été marquées par le FITC (émission dans le vert), ciblant les amines primaires alors que les polysaccharides portant des résidus glucose ou mannose ont été détectés par la concanavaline A couplée à de la rhodamine (émission dans le rouge). Ces marquages ont été combinés à ceux ciblant les microorganismes réalisés soit par FISH avec des sondes spécifiques des bactéries AOB et NOB, soit par coloration de l’ADN au DAPI pour détecter l’ensemble des bactéries.

La mise au point des outils de marquage a été effectuée sur les granules du réacteur R1 qui présentent des activités microbiennes diversifiées (autotrophes et hétérotrophes) et des caractéristiques physiques intéressantes en matière de densité et cohésion.

La figure 62 représente les marquages par la concanavaline A, combinés aux marquages au DAPI et aux marquages FISH des bactéries AOB et NOB (figure 62 A et B respectivement) réalisés sur les granules natifs et la figure 63 représente les marquages par le FITC combinés aux marquages au DAPI et aux marquages FISH des bactéries AOB et NOB (figure 63 A et B respectivement) réalisés sur les granules natifs.

Ces observations nous permettent de mieux comprendre l’organisation interne des agrégats étudiés, cependant, il est important de rappeler que la localisation des différents polymères de la matrice d’EPS ainsi que des différentes espèces microbiennes présentes dans les granules dépend des paramètres de culture des granules. Le lien direct entre ces paramètres et la structure interne des granules étant difficile à expliquer, les résultats que nous observons ici ne sont pas facilement applicables aux agrégats cultivés dans des conditions différentes. En outre, l’organisation interne d’un agrégat dépend dépendant également de son âge, de sa taille et des épisodes successifs de sa formation, il est difficile, d’affirmer la répétabilité des observations effectuées sur un granule unique d’un réacteur en contenant des millions.

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Cependant, selon les observations effectuées, au centre des agrégats, au-delà de 0,5 mm de profondeur, on aperçoit sur toutes les observations réalisées, un marquage discontinu, parfois par plusieurs fluorophores. Il ne s’agit en fait ni de microorganismes, ni d’EPS, mais d’un marquage aspécifique du cœur minéral volumineux des agrégats. Ce cœur minéral a été en particulier caractérisé par Mañas et al. (2012). Lors de cette étude réalisée sur les granules du réacteur R1, des analyses de ce cœur minéral réalisées par spectroscopie raman, microscopie électronique à balayage couplée à de la spectroscopie de rayons X à dispersion énergétique et diffraction aux rayons X montrent qu’il est principalement composé de cristaux d’hydroxyapatite, qui sont des cristaux composés de calcium et de phosphate.

Figure 62 : Répartition globale des polysaccharides à résidus glucose ou mannose dans les granules de R1. Les granules sont coupés par un cryomicrotome, puis marqués par une méthode FISH pour la détection des bactéries AOB (A, flèche) et NOB (B, flèche) (en vert), ou par le DAPI pour la détection de l’ADN bactérien toutes espèces confondues (en bleu). Les polysaccharides possédant des résidus glucose et mannose sont marqués par la concanavaline A (en rouge). (Les images sont présentées en agrandissement en annexe 1).

Figure 63 : Répartition globale des protéines dans les granules de R1. Les granules sont coupés par un cryomicrotome, puis marqués par une méthode FISH pour la détection des bactéries AOB (A, flèche) et NOB (B, flèche) (en rouge), ou par le DAPI pour la détection de l’ADN bactérien toutes espèces confondues (en bleu). Les protéines sont marquées par le FITC (en vert). (Les images sont présentées en agrandissement en annexe 1).

B

A

B

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Selon ces images, les microorganismes localisés par le marquage par le DAPI sont répartis de manière assez homogène sur tout le pourtour des agrégats. Selon les granules observés, l’implantation des microorganismes occupe entre 0,5 et 1 mm d’épaisseur de granule en partant de la surface. Les microcolonies des granules couvrant l’ensemble de cette zone, il est impossible de les distinguer les unes des autres avec ce marquage et à ce grossissement.

Les marquages FISH observés sur les figures 62 et 63 montrent une implantation de microcolonies de bactéries AOB apparaissant en pointillé sur les images, sur une couronne à environ 0,3 mm de la surface du granule (figures 62.A. et 63.A., flèches). Les microcolonies de bactéries NOB, également en pointillés sur les images, apparaissent plus dispersées et sont marquées entre la surface et environ 0,4 mm de profondeur dans le granule (figures 62.B. et 63.B., flèches).

Comme le montrent les images de la figure 62, le marquage de résidus glucose et mannose par la concanavaline A a une localisation très similaire à celui du marquage DAPI. On observe donc la présence de polysaccharides contenant des résidus mannose et glucose sur l’ensemble de la zone occupée par les microorganismes. Cependant, contrairement au marquage DAPI, le marquage des polysaccharides par la concanavaline A n’est pas du tout homogène. En effet, on observe à la surface des agrégats marqués la présence d’une fine pellicule de polysaccharides plus denses qui semblent recouvrir entièrement les granules. A l’intérieur des agrégats, les polysaccharides marqués semblent également être condensés en certains points. Il est possible que ces points correspondent à l’emplacement de microorganismes particulièrement producteurs de polysaccharides. On note aussi la présence de forme circulaires pouvant atteindre jusqu’à 0,25 mm de diamètre, généralement localisées dans des parties assez profondes des granules, en bordure de cœur minéral. D’après la taille importante de ces formes, il pourrait s’agir de gangues de polysaccharides recouvrant des associations de plusieurs microcolonies de même espèce bactérienne colonisant les parties profondes des agrégats. Cette implantation est différente de celle observée en 2005 par McSwain et al. suite à des marquages par la concanavaline A de granules alimentés par du milieu synthétique avec un rapport C/N de 10,7 et également coupés au cryomicrotome. En effet, lors de cette étude, le marquage par la lectine révèle une localisation très périphérique des polysaccharides qui ne sont pas observés à plus de 50 µm de la surface des agrégats. Les implantations observées par Adav et Lee, 2008a sont plus similaires à ce que nous observons. Selon leur marquage, en effet, leurs granules alimentés par de l’eau usée synthétique présentant un rapport C/N de 1,4 sont caractérisés par une localisation plus profonde des polysaccharides visibles sur les 0,3 à 0,4 premiers millimètres des agrégats.

L’implantation des protéines dans les granules est différente de celle des polysaccharides. En effet, comme on peut le constater sur la figure 10, le marquage au FITC est très intense à l’extrême périphérie des agrégats, dans les premiers 0,1 mm puis décroit régulièrement alors que l’on s’enfonce dans l’agrégat. Le marquage par le FITC que nous observons n’est, lui non plus, pas homogène mais apparait par plaques de moins de 50 µm de diamètre. Ces formes correspondent peut-être aux emplacements des microcolonies productrices de protéines.

Ces observations ne sont pas tout à fait en accord avec celles de Adav et Lee (2008) et McSwain et al. (2005) qui observent une implantation généralisée des protéines marquées par le FITC dans l’ensemble de leurs agrégats granulaires. Cependant, cette différence peut s’expliquer par le fait que les granules que nous étudions, contrairement à ceux présentés dans ces deux articles, possèdent un cœur minéral volumineux et dépourvu d’EPS.

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IV.1.2. Répartition locale

Afin de mieux comprendre comment les EPS sont organisés autour des microorganismes, les images confocales des coupes de granules ont également été observées à des échelles plus locales, en utilisant les mêmes marqueurs que précédemment pour les protéines et les polysaccharides. Le marquage des bactéries AOB est effectué par FISH avec des sondes spécifiques alors que celui de l’ensemble des bactéries est obtenu avec un mélange de plusieurs sondes ciblant un large spectre de micro-organismes (mélange Eub mix).

Ce type de visualisation permet d’observer individuellement les microcolonies de bactéries qui apparaissent sous forme de taches composées de pointillés plus ou moins denses, chaque point correspondant à une bactérie (figures 64 et 65).

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Figure 64 : Analyse à l’échelle locale de la distribution des polysaccharides et des bactéries dans les granules de R1 natifs Les granules sont coupés par un cryomicrotome, puis marqués par une méthode FISH pour la détection de bactéries AOB ou de toutes les bactéries (EUB mix), et à la Concanavaline A pour les polysaccharides (résidus glucose et mannose).

B

EUBmix en vert

ConA en rouge

AOB en vert

ConA en rouge

A

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Figure 65 : Analyse à l’échelle locale de la distribution des protéines et des bactéries dans les granules de R1 natifs Les granules sont coupés par un cryomicrotome, puis marqués par une méthode FISH pour la détection de bactéries AOB ou de toutes les bactéries (EUB mix), et au FITC pour les protéines (marquage des amines secondaires).

Sur la figure 11.A., le marquage par la concanavaline A nous permet d’observer précisément les gangues de polysaccharides autour de microcolonies. Ces gangues entourent les regroupements de microorganismes de différentes dimensions. On peut les voir entourer des microcolonies de bactéries de tailles allant de 5 à 30 µm. Cependant, elles ne semblent pas entourer toutes les microcolonies. En particulier, comme on peut le voir sur figure 11.B. les AOB en sont dépourvues.

FITC en vert

EUBmix en rouge

A

FITC en vert

AOB en rouge

B

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Il est difficile d’estimer réellement la composition chimique des ces structures. En effet, la concanavaline A utilisée pour le marquage est spécifique des résidus mannoses et glucoses, qui sont très représentés dans les polymères osidiques. En particulier, il existe de nombreuses formes de glucanes (polymères de glucoses) dans le vivant et ils seront tous marqués par la concanavaline A. Ces 2 oses peuvent également être présents au sein de lipopolysaccharides ou de glycoprotéines.

Le marquage par le FITC à ce niveau de grossissement confirme la couverture protéique de l’ensemble des microcolonies. Au sein des microcolonies, les protéines marquées sont localisées à proximité immédiate des cellules. Ceci est particulièrement visible sur la figure 12.A. où la colocalisation des marquages EUB mix en rouge et FITC en vert apparaît en jaune-orangé. Un grossissement encore plus important après marquage des bactéries AOB (Figure 12.B.) permet de voir que le marqueur FITC marque aussi les microcolonies d’AOB. On peut voir également sur ces images que, si le FITC semble marquer absolument toutes les microcolonies, la forme que prend ce marquage varie d’une microcolonie à l’autre, et sans doute, d’une espèce bactérienne à l’autre.

D’après les résultats de ce marquage, on a également une forte présence protéique à proximité des cellules des agrégats. Cependant, il est difficile d’affirmer que ces protéines sont des EPS. En effet, le marqueur se liant à toutes les protéines, étant donné la proximité avec les microorganismes, il peut aussi bien s’agir de protéines membranaires et en particulier de protéines de la membrane externe de bactéries à gram négatif.