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A partir dos fragmentos das amostras GLUT-1 negativas incluídos em parafina, foram obtidos cortes histológicos de 5µm de espessura que foram submetidos à coloração pela técnica de rotina da Hematoxilina e Eosina (HE), descrita a seguir:

 Xilol I (15 minutos);  Xilol II (15 minutos);

 Álcool absoluto (3 minutos);  Álcool 95º GL (3minutos);  Álcool 70º GL (3minutos);  Água corrente (5 minutos);

 Hematoxilina de Harris (5minutos);  Água corrente (5 minutos);

 Rápida raspagem em solução de álcool – ácido a 1%;  Água corrente (5 minutos);

 Eosina de Lison (2 minutos);  Álcool 70º GL (3minutos);  Álcool 95º GL (3minutos);  Álcool absoluto (3 minutos);  Xilol I (3 minutos);

 Xilol II (3 minutos);  Xilol III (3 minutos);

 Montagem da lamínula contra a lâmina com Permount. 4.9 ANÁLISE DO PERFIL MORFOLÓGICO

Após a obtenção das lâminas coradas em HE, realizou-se a análise morfológica dos tecidos, por dois observadores, previamente calibrados, em momentos diferentes através de um microscópio óptico (Olympus CH30, Olympus Japan Co., Tokyo, Japão) em um aumento final de 400x.Tendo como base a literatura vigente, as lesões foram então reclassificadas obedecendo a alguns critérios(Quadro 2) e os dados então anotados em fichas apropriadas (Apêndice 4).

Quadro 2- Critérios histopatológicos para o diagnóstico das lesões vasculares.

Tipo de anomalia Características morfológicas

*Hemangioma congênito rapidamente involutivo

 Grandes lóbulos de pequenos vasos sanguíneos limitados por tecido fibroso;

 Células endoteliais achatadas;

 Grande vaso estrelado no centro dos lóbulos;  Áreas de fibrose;

 Calcificações focais; *Hemangioma congênito não

involutivo

 Lóbulos de tamanho variável constituídos de pequenos vasos;

 Grandes vasos extralobulares;

 Células endoteliais com formato ovoide;

Granuloma piogênico

 Agregados lobulares de células endoteliais;  Células endoteliais em proliferação;

 Numerosos vasos sanguíneos capilares;  Presença de infiltrado inflamatório misto de

moderado a intenso;

 Membrana fibinopurulenta;  Áreas de ulceração e necrose.

Malformação vascular

 Vasos sanguíneos tortuosos limitados por endotélio maduro e achatado;

 Ectasia vascular;

 Infiltrado inflamatório escasso ou inexistente;  Agregados de células endoteliais jovens e em

proliferação escasso ou ausente.

Fonte: Enjolras e Mulliken (1997), North et al. (2000), North et al. (2001a e b), Mo et al. (2004), Leon- Villapalos et al. (2005),Mulliken eEnjolras(2004), Nguyen et al. (2004) e Enjolras, Wassef e Chapot, (2013).

*Necessidade de recorrer à ficha clínica para verificar idade do paciente e tempo de evolução da lesão.

Após a reclassificação das lesões em HI, GP e MV, pelos dois avaliadores, foi verificado o nível de concordância intraexaminadores através do cálculo do coeficiente Kappa. Além disso, foi realizada a comparação desses novos

diagnósticos com os diagnósticos histológicos dados inicialmente (hemangioma capilar, lobular, celular, cavernoso, etc) na tentativa de avaliar se algum dos subtipos antes utilizados correspondia a algum diagnóstico definitivo a partir da imunoexpressão do GLUT-1 e das características histopatológicas (Apêndice 5).

4.10 ESTUDO IMUNOISTOQUÍMICO (Ki-67 e Bcl-2)

Seguiram para uma nova etapa imunoistoquímica os espécimes reclassificados em HI, GP ou MV seguindo a proporção 1:1:1 de acordo com o tipo de lesão que apresentou menor quantidade de exemplares. A determinação foi feita de forma intencional sendo selecionadas as lesões que, segundo os avaliadores, demonstraram mais características inerentes ao tipo de anomalia.

A partir dos blocos de parafina, cortes histológicos de 3µm de espessura foram obtidos para esta etapa do estudo. Em seguida, estendidos em lâminas de vidro previamente limpas e preparadas com adesivo à base de 3-aminipropiltrietoxy- silano, usando os anticorpos primários anti-Ki-67 e anti-Bcl-2, de acordo com as especificações do quadro 3:

Quadro 3-Especificidade, fabricante, diluição, recuperação antigênica e tempo de incubação dos anticorpos primários anti-Ki-67 e anti-Bcl-2.

Especificidade Fabricante Diluição Recuperação Antigênica Incubação

Ki-67 (MIB-1) Dako 1:200 Tris/EDTA pH 9,0, Pascal, 3' 18h

(overnight)

4.11 ANÁLISE DO PERFIL IMUNOISTOQUÍMICO(Ki-67 e Bcl-2)

4.11.1 Ki-67

Os espécimes foram escaneados pelo Scanner Panoramic MIDI (3DHISTECH® Kft.29-33, Konkoly-Thege M. str.Budapest, Hungary, H-1121) e as imagens obtidas foram observadas através do programa de visualização Panoramic Viewer 1.15.2 (3DHISTECH® Kft.29-33, Konkoly-Thege M. str.Budapest, Hungary, H-1121). Com o auxílio desse programa foi possível observar toda a extensão do espécime, onde identificamos a região da lâmina que apresentava maior número de células endoteliais com imunomarcação para este marcador. Uma vez encontrada essa área, a imagem foi aumentada em 40x, de acordo com as especificações do programa, onde foram fotografados dez campos consecutivos de cada caso com o auxílio do mesmo programa de visualização anteriormente citado. Em lesões ulceradas, estas áreas foram evitadas.

Com auxílio do programa Imaging Processing and Analysis in Java (ImageJ®, National Institute of Mental Health, Bethesda, Maryland, USA) foi realizada então uma análise quantitativa da imunomarcação para o Ki-67. O estudo foi do tipo duplo- cego onde o examinador não tinha acesso aos diagnósticos dados previamente. A contagem das células positivas e negativas foi feita por um único avaliador previamente calibrado até que fosse atingida a quantidade de 1000 células endoteliais, fazendo-se uso de uma adaptação do método de contagem utilizado por Sarmento et al. (2013), com isso possibilitou-se uma comparação entre os dados das lesões com maior fidedignidade, uma vez que, independente da lesão avaliada, o valor das células total era o mesmo.

Diante da dificuldade de obter, ao término da contagem, o número exato de 1000 células, optou-se por fazer a contagem das células até o último campo em que a contagem total fornecesse um número de células contadas inferior a 1000. Então, era realizada uma proporção das células positivas e negativas encontradas em relação às células requeridas para obtenção do total final de 1000 células. Para a obtenção do número requerido de células positivas para completar o número total de células contadas foi realizada a seguinte equação:

A= B x C D A = número de células positivas requeridas

B = número de células positivas do último campo contado

C = 1000 – número total de células contadas até o último campo D = número total de células do último campo

Para a obtenção do número requerido de células negativas (E) para completar o número total de células contadas foi realizada a seguinte equação:

E= C – A

A partir deste montante, foi retirada a porcentagem de células positivas e negativas os dados anotados em fichas apropriadas (Apêndice 6).Foi utilizada, como controle interno positivo, a camada basal do epitélio que revestia as lesões e como controle negativo o anticorpo foi substituído por albumina de soro bovino a 1% (BSA - bovine serum albumin).

4.11.2 Bcl-2

Toda a área do espécime foi verificada por dois examinadores previamente calibrados, em momentos diferentes através de um microscópio óptico (Olympus CH30, Olympus Japan Co., Tokyo, Japão) em um aumento final de 100x, que realizaram uma análise semiquantitava atribuindo os seguintes escores, fazendo-se uso de uma adaptação do que foi utilizado no estudo de Meijer-Jorna et al. (2012):

 0 a 5% - escore 0;  6 a 50% - escore 1;  51 a 100% - escore 2.

O estudo foi do tipo duplo-cego onde os examinadores não tinham acesso aos diagnósticos dados previamente. Os escores obtidos por cada avaliador para cada caso foram anotados em fichas apropriadas (Apêndice 7) e, em seguida comparados. Em eventuais desacordos, o espécime foi revisto e os critérios foram discutidos até que os avaliadores chegassem ao consenso.

Foram utilizados como controle positivo externo, casos de hiperplasia linfoide e como controle negativo o anticorpo foi substituído por albumina de soro bovino a 1% (BSA - bovine serum albumin).

4.12 ANÁLISE ESTATÍSTICA

Os resultados obtidos com a análise imunoistoquímica foram digitados em planilha eletrônica Excel (Microsoft Office 2007®) e posteriormente exportados para o programa Statistical Package for the Social Sciences (versão 17.0; SPSS Inc., Chicago, IL, USA), no qual foram realizadas as análises estatísticas.

Os dados obtidos com a avaliação dos índices de positividade para o Ki-67, variável quantitativa discreta, foram submetidos ao teste de Kolmogorov-Smirnov, com o intuito de observar o tipo de distribuição dos mesmos em cada um dos grupos. Como os dados não apresentaram distribuição normal, a comparação das medianas dos índices de positividade para o Ki-67 entre HIs, GPs e MVs foi realizada por meio do teste não paramétrico de Kruskal-Wallis. Em relação aos escores de imunopositividade para Bcl-2, variável categórica ordinal, a comparação das medianas entre HIs, GPs e MVs foi realizada por meio do teste não paramétrico de Kruskal-Wallis. Em cada um dos grupos, o teste de correlação de Spearman foi utilizado para analisar possíveis correlações entre os índices de positividade para o Ki-67 e os escores de imunoexpressão de Bcl-2.

Para todos os testes estatísticos utilizados no presente estudo, o nível de significância foi estabelecido em 5% (p < 0,05).

5 RESULTADOS

Dos 109 casos diagnosticados inicialmente como “hemangiomas orais” e suas respectivas classificações, apenas 77(70,64%) obedeciam aos critérios de inclusão e exclusão e foram selecionados para compor a amostra do estudo.