RESUMO
Duzentos e vinte e cinco populações foram geradas a partir do cruzamento de vinte e cinco linhagens-elite, respeitando o grupo heterótico aos quais as mesmas pertenciam. As populações foram classificadas em Dentadas tropicais, Flints tropicas e Temperadas/Tropicais. Três ciclos de indução foram conduzidos, com diferentes populações compostas com as mesmas vinte e cinco linhagens escolhidas cruzadas entre si e com outras do mesmo padrão heterótico. As sementes haplóides foram submetidas a tratamento de duplicação cromossômica e após passar por período de aclimatação em casa de vegetação, foram levadas a campo onde foram conduzidas, polinizadas, e suas espigas colhidas. Foram determinadas as variáveis porcentagem real de indução, sobrevivência em casa de vegetação, sobrevivência a campo, percentagem de plantas polinizadas, eficiência de polinização e número de espigas colhidas. Houve diferenças significativas entre o comportamento dos grupos heteróticos em relação à porcentagem de indução, porcentagem de plantas macho-férteis, sobrevivência em casa de vegetação e porcentagem de polinizações sucedidas. Houve também interação significativa entre grupos heteróticos e ciclo de produção para as variáveis porcentagem de indução e porcentagem de plantas macho férteis. Não houve diferenças significativas para a variável sobrevivência a campo. Conclui-se que a origem genética das populações influencia na habilidade de produzir linhagens duplo- haplóides.
Palavras-chave: Duplo haplóides, haplodiplóides, haplóides in vivo, haplóides em milho,
.ABSTRACT
Two hundred and twenty five populations were generated using twenty five elite inbred lines, always respecting the heterotic pattern of each one. They were classified as Tropical Dent, Tropical Flint and Temperate/Tropical. Tree induction seasons were conducted, with populations originated from crosses with the twenty five selected lines and others from the same heterótico pool. The haploid kernels were submitted on a chromosome doubling treatment and planted under shade-house. After two weeks, they were transplanted to the field and conducted, pollinated and ears were harvested. It was estimated the real induction percentage, shade-house survival, pollination efficiency and number of harvest ears. There were statistical differences within heterotic patterns for real induction percentage, pollinated plants, shade-house survival and pollination efficiency. No statistical difference was noticed on percentage of field plants survival. Also significant interaction was observed on real induction percentage and planting season and percentage of pollinated plants and season. Data drives to understand that are difference on ability of maize on double haploid techniques to be successfully depending on its background.
Keywords: Doubled haploids, haplodiploids, In vivo haploids, haploids maize, double haploid lines production.
1) Introdução
O sucesso de um programa de melhoramento para produção de híbridos comerciais de milho está na obtenção de linhagens endogâmicas elite. Para tanto, o método padrão utilizado para este fim é por meio de sucessivas autofecundações. A tecnologia de duplo-haplóides apresenta-se como uma alternativa viável, por meio da qual se obtêm linhagens homozigotas instantaneamente após o cruzamento das populações com uma linhagem indutora de haploidia e tratamento de duplicação cromosssômica com agentes químicos. Além do ganho de tempo, outra vantagem é a utilização de menor área experimental nos campos de melhoramento, e também a possibilidade de se realizar os cruzamentos teste com uma linhagem terminada e não com uma progênie segregante F3 ou F4.
A obtenção de linhagens duplo-haplóides é uma forma de reduzir tempo e espaço na obtenção de linhagens endogâmicas nos programas de melhoramento de milho. Pode-se aumentar em até três vezes a velocidade de um programa de melhoramento, em relação aos métodos tradicionais (STRAHWALD & GEIGER, 1988, citados por BORDES et al. 2006).
Haplóides de origem maternal são resultantes de uma falha primária na fertilização, causada por uma condição anormal, induzida ou herdada, num gameta masculino ou feminino e subseqüente desenvolvimento do óvulo em embrião. (SARKAR e COE 1966).
Alguns tratamentos como tratamento de pólen com calor ou com raio “X” ou ainda o tratamento dos estigmas com hidrazina maleica, tem sido utilizados para a produção de haplóides maternais em milho (MATHUR et al. 1976, ZUOYU & MIGGUANG, 1984, respectivamente, citados por LASHERMES & BECKERT, 1988). CHASE, 1974 demonstrou que o atraso na polinização também pode produzir grãos haplóides.
Até a década de 90, a baixa eficiência das diferentes técnicas de derivação de duplo haplóides limitava esta ferramenta como uso em escala em um programa convencional de seleção. Com o desenvolvimento da técnica de indução de giminogenese in situ, tornou-se possível a produção de um grande número de duplo- haplóides. A técnica consiste em cultivo de anteras in vitro para produção de haplóides.
A partir de então, diversos trabalhos puderam ser conduzidos utilizando-se linhagens duplo-haplóides.
A viabilidade da produção de linhagens duplo-haplóides se deu com o desenvolvimento de indução de haplóides maternais (DEIMLING et al. 1997, CHALYK, 1999) com subseqüente duplicação cromossômica utilizando-se colchicina (DEIMLING et al. 1997), dessa maneira, pôde-se aplicar a tecnologia de produção de linhagens duplo-haplóides em escalas que atende a um programa de melhoramento comercial.
Com a utilização desta tecnologia é possível garantir a pureza genética das linhagens desenvolvidas, visto que todas as plantas geradas são obtidas a partir de uma única semente haplóide que foi duplicada, originando uma linha pura, proporcionando assim maior qualidade das avaliações iniciais dos híbridos.
Desta forma, o presente trabalho visa determinar a influência da origem genética das populações na eficiência de produção de linhagens obtidas pela tecnologia de duplo-haplóides.
2) Material e Métodos
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A pesquisa foi realizada nas dependências da fazenda experimental da Monsanto do Brasil Ltda. em Uberlândia, Estado de Minas Gerais, Brasil, Referenciada com latitude 18° 56’ 47’’S, longitude 48° 09’ 16’’W e altitude 870m
Vinte e cinco linhagens elite do programa de melhoramento genético da Monsanto do Brasil, sendo seis classificadas como dentadas tropicais (TD) originadas de populações Tuxpeño/Tuxpan, dez classificadas como grãos duros tropicais (TF) originadas de populações Eto/Cateto/Flint Caribeño e nove classificadas como Tropicais/Temperadas (TT) originadas de populações Stiff Stalk/Dixie/Lancaster foram utilizadas para gerar as populações segregantes utilizadas no presente estudo. Estas linhagens foram cruzadas entre si, respeitando os grupos heteróticos, dando origem a um total de duzentos e vinte e cinco populações S0.
As populações foram originadas em ciclos de cruzamentos diferentes e então semeadas em três campos isolados onde o macho foi uma linhagem indutora de haploidia utilizada no programa de Duplo-Haplóides da empresa. Foram semeadas quarenta e oito populações em Março de 2006 (WIN06), 99 populações em agosto do ano de 2006 (SUM67) e setenta e oito populações em Março de 2007 (WIN07).
Após a polinização das populações pelo macho indutor, as espigas produzidas foram colhidas e levadas ao laboratório onde foram selecionados os grãos haplóides. A seleção foi feita com auxílio de lupa com aumento de três vezes, onde se verificava a presença de marca púrpura no endosperma e ausência de pigmentação no embrião. Procedeu-se então a estimativa do peso de mil sementes por meio da pesagem de três repetições de cem grãos. A massa total de grãos diplóides foi pesada e o número total de sementes foi estimado.
As sementes haplóides foram submetidas a tratamento de duplicação cromossômica com colchicina de acordo com o protocolo proposto por DEIMLING et al., 1997 e posterior aclimatação em casa de vegetação. Após vinte dias, as plântulas
foram transplantadas a campo, onde foram conduzidas, polinizadas e suas espigas colhidas.
A percentagem real de indução, sobrevivência em casa de vegetação, sobrevivência a campo, percentagem de plantas polinizadas, eficiência de polinização e número de espigas colhidas foram determinadas. As percentagens foram calculadas relativas à média dos três ciclos trabalhados a fim de preservar a confidencialidade dos dados da eficiência do programa da empresa.
A análise dos dados foi realizada com auxílio do programa SAS através do procedimento GLM, onde foram calculados os efeitos da estação de plantio, grupo heterótico, interação grupo X estação para cada uma das variáveis mencionadas anteriormente.
No caso de diferença significativa entre os tratamentos apontados pelo teste “F”, foi aplicado o Teste de Tukey ao nível de 5% de probabilidade para a comparação das médias.
Havento interação significativa entre grupos heteróticos e estações de plantio, foi realizado o procedimento LSMeans para identificação da significância das interações entre os grupos e estações.
Durante todo o processo de duplicação e condução a campo, plantas diplóides que possam ter sido classificadas como haplóides foram descartadas e o número de grãos haplóides inicial foi corrigido.
3) Resultados e Discussão
Na tabela 1, encontram-se os valores das médias para cada variável estudada. As médias dos três ciclos foram calculadas e os dados convertidos em porcentagem relativas as médias.
Tabela 1. Média de percentagem de indução real (IR%), percentagem de plantas macho-férteis (Pol%), percentagem de sobrevivência em casa de vegetação (SCV%), percentagem de sobrevivência a campo (FS%), percentagem de linhagens produzidas (DHp%) e percentagem de plantas polinizadas que produziram grãos (Ef_Pol%).
Grupo Estação N* IR% Pol% SCV% FS% DHP% Ef_Pol%
TD WIN06 19 149 132 93 94 127 109 TF WIN06 9 90 127 109 90 129 106 TT WIN06 20 64 108 97 98 98 101 TD SUM67 20 113 84 90 106 84 98 TF SUM67 53 67 80 110 105 115 112 TT SUM67 26 136 86 97 103 66 74 TD WIN07 11 150 132 96 91 115 102 TF WIN07 18 98 101 99 104 101 110 TT WIN07 49 98 107 99 96 90 92
*Percentagem relativa à média dos três ciclos. N – Número de populações utilizadas no ciclo TD – Dentadas tropicais
TF – Flints Tropicais TT – Temperadas/tropicais
Na Tabela 2 encontram-se sumarizada a análise da variância para as variáveis estudadas percentagem de indução real (IR%), percentagem de sobrevivência em casa de vegetação (SCV%), percentagem de plantas macho-férteis (Pol%), percentagem de linhagens produzidas (DHp%) e percentagem de plantas polinizadas que produziram grãos (Ef_Pol%).
Tabela 2: Quadrados Médios obtidos na Análise da Variância para as variáveis IR%, SCV%, FS%, DHp%, Pol%, e Ef_Pol%
FV GL IR% SCV% FS% DHp% Pol% Ef_Pol%
E 2 0,2672 0,0496 0,2018 0,7343 2,8699** 0,0861
G 2 5,1780** 0,3344** 0,0105 2,3493 0,3326** 1,1666
E*G 4 2,1326** 0,0476 0,0448 0,3785 0,1919* 0,1456
Erro 216 0,5576 0,0293 0,0733 0,6473 0,0698 0,3750 Total 224
* Significativo a 5% pelo teste F ** Significativo a 1% pelo teste F E – Estação de plantio
G – Grupo (TD,TF e TT)
E*G – interação estação de plantio X grupo
3.1) Percentagem Real de Indução (IR%)
Para a variável IR, houve diferença significativa ao nível de 1% de probabilidade do teste F entre os diferentes grupos heteróticos. Não houve diferença significativa entre a média das estações que foram de 100,96, 105,43 e 115,45 para as estações WIN06, SUM67 e WIN07, respectivamente.
O grupo TD apresentou média de 137,56 diferindo pelo teste Tukey em relação aos demais grupos, TF e TT, que apresentaram médias de 85,24 e 99,04, respectivamente. As médias de IR% dos grupos TF e TT não diferem entre si.
Houve interação significativa entre grupos heteróticos e estações de plantio. Na Tabela 3 podem ser observadas as médias dos grupos heteróticos em relação às estações de plantio para a variável IR%.
Tabela 3: Comparação entre as médias de percentagem de real de indução (IR%) dentro dos diferentes grupos heteróticos em relação à estação de plantio
Grupo Estação N IR(%) TD WIN07 11 150 a TD WIN06 19 149 a TD SUM67 20 113 a TT SUM67 26 136 a TT WIN07 49 98 ab TT WIN06 20 64 b TF WIN07 18 98 a TF WIN06 9 90 a TF SUM67 53 67 a
*Médias seguidas da mesma letra não diferem entre si pelo teste T a1% de probabilidade.
Na Figura 1 pode ser observado o gráfico de interação entre grupos heteróticos e estações de plantio para a variável IR%.
A média de IR% do grupo TD na estação WIN06 foi de 150,27 e não diferiu da média do grupo TF que foi de 89,88, mas diferindo da média do grupo TT que foi de 63,67. Durante a estação SUM67, houve um aumento na IR% do grupo TT, resultando numa média de 135,71. A média do grupo TT não diferiu da média do grupo TD, que foi de 113,10, porém demonstrou uma interação do tipo complexa com a média do grupo TF que foi de 67,49, diferindo estatisticamente pelo teste “T” a 1% de probabilidade. Já na estação WIN07, a média do grupo TT foi de 97,77 e as médias dos grupos TD e TF foram respectivamente, 150,27 e 98,36, não havendo diferença significativa entre os grupos nesta estação.
Figura 1. Gráfico da interação entre médias dos grupos heteróticos e estações de plantios para a variável IR%
Os dados obtidos pelos experimentos concordam com EDER & CHALYK (2002), que realizaram ensaios de indução com vinte populações, sendo onze dentadas, quatro flint européias e cinco flint X dentadas. Os autores obtiveram uma média de indução para as populações dentadas de 5,3%, contra 3,6% das populações flint e 4,4% das populações flin X dentadas.
COE (1994) comenta que a dificuldade em isolar haplóides de genótipos de grãos duros (flint) está relacionada com genes dominantes existentes no milho, C1-I, C2-Idf e In1-D, os quais inibem a síntese de antocianina no endosperma, interferindo na expressão do marcador utilizado para seleção de haplóides. Quando há pelo menos
um dos genes presente no genótipo maternal, a identificação de haplóides torna-se muito difícil devido à falta de pigmentação.
RÖBER (1999) cita que em geral, a expressão de genes marcadores de antocianina é melhor em genótipos dentados.
De modo contrário a produção de antocianina no endosperma, CHALYK & EDER (2002) mostraram que a expressão do gene R1-nj, responsável pela pigmentação por antocianina no embrião, tem sua expressão melhor em genótipos de grãos duros, quando comparados com os genótipos dentados e flint X dentados.
3.2) Sobrevivência em Casa de Vegetação (SCV%)
Houve diferença significativa em relação aos grupos heteróticos em relação à porcentagem de sobrevivência em casa de vegetação, conforme pode ser verificado na Tabela 2. O grupo TF teve média de 105,84 de sobrevivência, diferindo significativamente dos demais pelo teste Tukey ao nível de 5% de probabilidade. Os grupos TT e TD resultaram em média de 97,66 e 92,83, respectivamente, não diferindo entre si.
Não houve diferença significativa entre as médias das estações de plantio assim como não houve interações entre as médias das estações de plantio e grupos heteróticos.
CHALYK & EDER (2002), realizaram experimentos onde após o tratamento de duplicação cromossômica com colchicina, as plântulas foram cultivadas em casa de vegetação e a campo diretamente. A sobrevivência em casa de vegetação após o tratamento foi de 90,8% enquanto que no cultivo diretamente a campo foi de 88.6%. Além disso, o cultivo em casa de vegetação também favoreceu o aumento do número de plantas tratadas que produziram pólen (macho-férteis) e o número de plantas polinizadas que produziram grãos, quando comparadas com as médias das plantas cultivadas a campo diretamente. A média da percentagem de plantas macho-férteis em casa de vegetação foi de 42,4% contra 16,1% do cultivo a campo e a percentagem de
plantas polinizadas que produziram grãos foi de 30,5% no cultivo em casa de vegetação contra 8,1% das plantas cultivadas a campo. Porém, os autores não correlacionaram estas características com a origem genética (dentadas, grãos duros ou duros X dentadas) do material, assim como fizeram para a característica de porcentagem de indução.
3.3) Porcentagem de plantas macho-férteis (Pol%)
Em relação à variável Pol%, houve diferença significativa entre as médias das estações, entre as médias dos grupos heteróticos ao nível de 1% de significância para o teste “F” e ainda interação significativa entre estações e grupos ao nível de 5% de significância, conforme pode ser verificada na Tabela 2. As médias dos grupos heteróticos obtidas em cada estação estão representadas na Tabela 1.
A média da estação WIN06 foi de 122,31, não diferindo da estação WIN07 que teve média de 113,21, porém ambas foram diferente significativamente quando comparadas a média da estação SUM67 que foi de 82,55 de acordo com o teste Tukey a 5% de probabilidade. A comparação foi considerada significativa quando maior que 0,0167, utilizando-se a correção de Bonferroni /3.
Em relação aos grupos heteróticos, a média do grupo TD foi de 116,14, diferindo significativamente pelo teste Tukey a 5% das médias dos grupos TT e TF que foram de 102,76 e 100,25, respectivamente.
A Figura 2 representa graficamente as médias dos grupos heteróticos em relação às estações de plantio. A interação entre grupos e estações foi significativa ao nível de 5%.
Na Tabela 4 podem ser verificadas as médias dos grupos heteróticos em cada estação e a diferença estatística entre elas avaliada através do teste “T” ao nível de 1% de probabilidade.
Tabela 4: Médias de percentagem de indução real (Pol%) dos diferentes grupos heteróticos em relação à estação de plantio
Grupo Estação N Pol
TD WIN06 19 132,209 a TD WIN07 11 132,142 a TD SUM67 20 84,084 b TT WIN06 20 107,529 a TT WIN07 49 107,002 a TT SUM67 26 86,228 b TF WIN06 9 127,205 a TF WIN07 18 100,739 a TF SUM67 53 80,359 b
*Médias seguidas da mesma letra não diferem entre si pelo teste T a1% de probabilidade.
Na estação WIN06, as médias dos grupos TF e TD não diferem entre si, mas diferem das médias do grupo TT. Na estação SUM67, nenhuma das médias dos grupos difere entre si, voltando a apresentar diferenças significativas na estação WIN07, onde a média de TD diferente das médias de TF e TT, sendo as duas últimas não diferentes entre elas.
O ciclo SUM67 apresentou as médias mais baixas para todos os grupos heteróticos, sugerindo que a produção de linhagens DH é facilitada pela polinização no verão, pois os ciclos induzidos no inverno são plantados a campo no verão, quando obtiveram maiores taxas de plantas macho-férteis.
Figura 2. Gráfico da interação entre médias dos grupos heteróticos e estações de plantios para a variável Pol%
Não houve diferença significativa entre as médias dos grupos e estações de plantio em relação à variável eficiência de polinização.
3.4) Sobrevivência a campo (FS%),e eficiência de polinização (Ef_Pol%) e número total de linhagens duplo-haplóides produzidas (DHp).
Não houve diferenças significativas entre os grupos heteróticos para as variáveis sobrevivência a campo (FS%), eficiência de polinização (Ef_Pol%) e número total de linhagens duplo-haplóides produzidas (DHp%), assim como também não houveram diferenças significativas entre as médias das estações de plantio para estas características.
4) Conclusões
• A origem genética das populações influencia na taxa de indução de haplóides, sobrevivência em casa de vegetação e plantas macho-férteis.
• A porcentagem de plantas macho-férteis é a variável mais influenciada pelo ambiente.
5) Referências Bibliográficas
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