ÇEŞİTLİ KÜLTÜRLERDEN İZOLE EDİLEN ESBL(+) KLEBSİELLA PNEUMONİAE SUŞLARININ PFGE MOLEKÜLER TİPLENDİRİLMESİ

1.Tutku ARSLANTAŞ, 2.Alper KARAGÖZ, 3. Nadir KOÇAK 1.Çankırı Devlet Hastanesi Mikrobiyoloji Laboratuarı

2.Uşak Üniversitesi Moleküler Biyoloji ve Genetik Bölümü Mikrobiyoloji A.B.D.

3.Selçuk Üniversitesi Tıbbi Genetik A.B.D.

ÖZET

Hastanemizde yatan hastaların çeşitli klinik örneklerinden soyutlanan, genişlemiş spektrumlu beta-laktamaz (ESBL) yapan 50 Klebsiella pneumoniae suşunun PFGE moleküler tiplendirilmesi yapıldı. Antibiyotiklere duyarlılıkları Kirby-Bauer disk-difüzyon yöntemiyle araştırıldı. ESBL varlığı çift disk sinerji testi disk merkezleri arası uzaklık 30 mm ve 20 mm olarak uygulanarak belirlendi. ESBL pozitif suşlar PFGE moleküler tiplendirilmeye alındı.

Elektroforezde yürütülen suşların dendogram analizi yapılarak suşlar arasındaki ilişki incelendi. 50 suşun major 2 grup oluşturarak birbirlerine benzerliği keşfedildi.

Anahtar Kelimeler: ESBL, Klebsiella pneumoniae, PFGE SUMMARY

PFGE molecular typing of 50 Klebsiella pneumoniae strains that produce extended spectrum beta-lactamase (ESBL) isolated from various clinical samples of patients hospitalized in our hospital was performed. Their susceptibility to antibiotics was investigated by Kirby-Bauer disc-diffusion method. The presence of ESBL was determined by applying the double disk synergy test as 30 mm and 20 mm distances between disk centers. ESBL positive strains were taken to PFGE molecular typing. Dendogram analysis of the strains carried out in electrophoresis was performed and the relationship between the strains was examined. It was discovered that 50 strains were similar to each other by forming two major groups.

Key Words: ESBL, Klebsiella pneumoniae, PFGE

GİRİŞ

Klebsiella infeksiyonlarının çoğu hastane kaynaklıdır.

Nozokomiyal Klebsiella infeksiyonlarına en sık neden olan tür ise Klebsiella pneumoniae'dır.

İnfeksiyona neden olmadan da kolonizan bakteri olarak sıkça rastlanılmaktadır. Klebsiella türleri 1970'li yıllarda gentamisin direnciyle gündemdeyken, 1982'den beri seftazidim, aztreonam direnci ve genişlemiş spektrumlu beta-laktamaz (ESBL) yapan suşların giderek artan oranda soyutlanmasıyla sorun oluşturan bakteri olma özelliğini sürdürmektedir.

MATERYAL ve METOD

Ocak 2020-Haziran 2020 tarihleri arasında Çankırı Devlet Hastanesi kliniklerinde yatmakta olan hastaların örneklerinden soyutlanan 50 adet K. pneumoniae suşları infeksiyon etkeni olup olmadığına bakılmaksızın seçildi. Aynı hastadan birden fazla izolasyon olduğunda farklı bir örnek de olsa çalışmadan çıkarıldı.

K. pneumoniae identifikasyonu klasik yöntemler ve gerekli durumlarda “Enteric-Nonfermenter (BBL)” kiti kullanılarak yapıldı. EUCAST kriterlerine gore Kirby-Bauer disk difüzyon yöntemiyle antibiyogramları yapılan suşların çift disk sinerji metodu(ÇDST) ile ESBL yapıp yapmadıkları belirlendi.

ÇDST metodu Mc Farland 0.5 bulanıklığına göre ayarlanmış bakteri süspansiyonu Mueller-Hinton agara yayıldıktan sonra disk merkezleri arasındaki uzaklık 30, 20 mm olacak şekilde bir amoksisilin/klavulanik asit (AMC) ve iki sefotaksim (CTX) diski yerleştirilerek uygulandı.

Yirmidört saatlik inkübasyondan sonra test değerlendirildi. İnhibisyon zonu oluşturan suşlar ESBL(+) olarak değerlendirilmeye alındı.

PFGE metodu ESBL(+) suşların agaroz jele gömülmesinin ve DNA extraksiyonunun ardından restrüksiyon enzimleriyle DNAların kesilerek elektroforezde yürütülmesi vasıtasıyla yapıldı. Elektroforez sonrası etidium bromürle boyanan jellerin DNA bant görüntüleri çekilerek oluşurulan dendogramlar Gel Compare II sistemiyle analiz edildi.

BULGULAR

Toplam 50 hasta örneği çalışıldı. Kliniklere göre hasta dağılımı şöyledir: Fizik tedavi ve rehabilitasyon 11, çocuk hastalıkları 17, kardiyovasküler cerrahi 7, çocuk cerrahisi 5, gastroenteroloji 5, göğüs hastalıkları 2, genel cerrahi 3. Örneklerin dağılımı: Yirmibir idrar, 11 trakeal aspirat, 9 kan, 6 yara, 1 periton, 1 kateter, 1 balgam şeklindedir. GSBL yapan 50 K.

pneumoniae suşundan AMC-CTX disk merkezleri arasındaki uzaklık 30 mm'de iken 39 (%78)'unun, 20 mm'de iken 46 (%92)'sının ve 16 mm'de iken 4 (%8)'ünün sinerji gösterdiği belirlendi.

ESBL(+) 50 K. pneumoniae suşunun PFGE moleküler tiplendirilmesi yapıldı. Elektroforezden sonra yapılan dendogram analizinde ESBL(+) 50 K. pneumonie suşunun 1.grupta 8 suş 2.grupta 42 suş olarak major 2 gruba ayıldığı ve Tennoverkriterlerine göre tüm suşlar arasında % 90 benzerlik olduğu görüldü. Bütün suşların birbirleri ile ilişkili olduğu tespit edildi.

Toplam 50 K.pneumoniae suşu çalışmaya alındı. PFGE elektroforezden sonra etıdıum bromurle boyanan jellerden elde edilen DNA bant profilleri dendogramı elde edildi. Yukarıdaki dendogram görüntüsünde 50 adet suşun major olarak 2 küme oluşturduğu gözlenmektedir.

1.küme 1 ve 7 suştan oluşan altkümelerden oluşmaktadır. 2.küme 42 suştan oluşmaktadır.

Suşlar arasında benzerlik olduğu gözlemlenmektedir.

TARTIŞMA

K. pneumoniae infeksiyon etkeni veya kolonizan bakteri olarak yatan hasta örneklerinden sıkça soyutlanmaktadır. Hastane kökenli K. pneumoniae suşları birçok antibiyotiğe de dirençlidir. K.pneumonia’de belirlenen bazı enzimlerin yeni kuşak sefalosporinleri inaktive ettiği gözlenmiş, bu enzimler ESBL olarak adlandırılmıştır. ESBL üretimini belirlemek için en sık uygulanan test ÇDST'dir. K.pneumonİae suşlarının antibiyotik direnç paterni hakkında daha ayrıntılı bilgi elde etmek adına günümüzde yapılan moleküler çalışmalardan biri de PFGE'dir. Bu çalışmada ESBL pozitif E.coli suşlarını genotipik olarak PFGE yöntemiyle inceleyerek antibiyotik dirençlerinin benzerlikleri hakkında bilgi edinmek amaçlandı ve suşlar arasında klonal ilişki olduğu tespit edildi.

Çalışmamızda PFGE-CHEF sistemi kullanılarak yapılan K.pneumoniae suşlarının analizinde Tenover ve ark.’nın standart kriterleri esas alınmıştır. Tenover kriterlerine göre

bu izolatlar aynı suştur. Bizim çalışmamızdaki 50 suş içerisinde küme oluşturan 2 suş aynı bant profiline sahip olup epidemiyolojik olarak aynı suş olabilirler, bu suşların epidemiyolojik olarak incelendiğinde aynı bölgeden hastanemize başvurdukları tespit edilmiştir. Hastanemizde özellikle K.pneumoniae kökenleri başta olmak üzere yüksek ESBL üretimi ve geniş spektrumlu sefalosporinlere karşı azalan duyarlılık söz konusudur. Geniş bir endikasyona sahip olan bu grup antibiyotiklerle ampirik tedavi tercih edildiğinde tedavi başarısızlıkları görülebilir.

Problem halen sadece K.pneumoniae ile oluşan enfeksiyonlar için görülmektedir. Ancak direnç özelliklerinin farklı tür bakteriler arasında da yayılabildiği bilinmekte olup önümüzdeki yıllarda hastanemizde farklı bakterilerde de dirençle karşılaşılabilir.

KAYNAKLAR

1. Podschun R, Ullman U. Klebsiella spp. as nosocomial pathogens: Epidemiology, taxonomy, typing methods and pathogenicity factors. Clin Microb Rev 1998;11: 589-603.

2. Swenson JM, Hindler JA, Peterson LR. Special phenotypic methods for antibacterial resistance. In: Murray PR, Baron EJ, Pfaller MA, Tenover FC, Yolken RH (eds).

Manual of Clinical Microbiology. 7^th ed. Washington DC, 1999:1569.

3. Quinn JP. Clinical significance of extended-spectrum beta-lactamases. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 1994; 13 (Suppl 1):39-42.

4. Bush K. Is it important to identify extended-spectrum beta-lactamase-producing isolates? Eur J Clin Microb Infect Dis 1996;15:361-4.

5. Gazouli M, Kaufmann ME, Tzelepi E, Dimopoulou H, Paniara O, Tzouvelekis LS.

Study of an outbreak of cefoxitin-resistant Klebsiella pneumoniae in a general hospital.

J Clin Microb 1997;35:508-10.

6. Sanders CC, Barry AL, Washington JA, et al. Detection of extended-spectrum-ß-lactamase-producing members of the family Enterobacteriaceae with the vitek ESBL test. J Clin Microb 1996;34:2997-3001.

7. Gülay Z, Abacıoğlu YH, Yuluğ N. Çift disk sinerji yönteminde diskler arası uzaklığın sonuca etkisi. İnfeksiyon Derg 1995;9:89-92.

8. Tenover et al., 1997 F.C. Tenover, R.D. Arbeit and R.V. Goering, How to select and interpret molecular strain typing methods for epidemiological studies of bacterial infections: a review for healthcare epidemiologists, Infect. Control Hosp. Epidemiol.

18 (1997), pp. 426–439.

9. Rıza Durmaz, Barış Otlu, Fatih Koksal, Salih Hosoglu, Recep Öztürk, Yasemin Ersoy, Elif Aktaş, Nafia Canan Gursoy and Ahmet Calıskan. The optimisatıon of a rapıd pulsed field gel electrophoresis protocol for the typing of Acinetobacter baumannii, Escherischia coli and Klebsiella spp. Jpn. J. İnfect. Dis., 62, 372-377, 2009

DİŞ HEKİMLİĞİNDE ANTİBİYOTİK KULLANIMI