ANKARA ÜNĠVERSĠTESĠ FEN BĠLĠMLERĠ ENSTĠTÜSÜ
YÜKSEK LĠSANS TEZĠ
KIRMIZI ġARAPLARDA trans-RESVERATROL, TOPLAM ANTĠOKSĠDAN VE TOPLAM FENOL TAYĠNĠNDE OPTĠMUM EKSTRAKSĠYON
KOġULLARININ BELĠRLENMESĠ
Ahsen Tuğçe ÇAYBOYLU
GIDA MÜHENDĠSLĠĞĠ ANABĠLĠM DALI
ANKARA 2020
Her hakkı saklıdır
ii ÖZET Yüksek Lisans Tezi
KIRMIZI ŞARAPLARDA trans-RESVERATROL, TOPLAM ANTİOKSİDAN VE TOPLAM FENOL TAYİNİNDE OPTİMUM EKSTRAKSİYON KOŞULLARININ
BELİRLENMESİ
Ahsen Tuğçe ÇAYBOYLU
Ankara Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Gıda Mühendisliği Anabilim Dalı
Danışman: Prof. Dr. R. Ertan ANLI
Bu çalışmada, 3 farklı üzüm çeşidinden elde edilen (Syrah, Öküzgözü ve Kalecik karası) 2015, 2016 ve 2017 yıllarında hasat edilen kırmızı şarapların, polifenollerinin ekstraksiyonu ve analizi için matematiksel modelleme yapılmış ve optimum koşulları belirlenmiştir. Kırmızı şarapların; çeşitli kimyasal özellikleri, toplam fenolik madde içeriği, toplam antioksidan aktivite, toplam monomerik antosiyanin içeriği, renk yoğunluğu, renk tonu, renk bileşimi ve trans-resveratrol içeriği incelenmiştir.
Kırmızı şaraplarda ekstraksiyonda; çözücü ekstraksiyonu ve ses ötesi dalga destekli (UAE) ekstraksiyon yöntemi ile çalışılmış, EtOH/H2O çözücü olarak kullanılmıştır.
Ekstraksiyon çalışmasında, deneysel tasarım için cevap yüzey metodolojisinden (RSM) merkezi kompozit tasarım (CCD) ile çalışılmıştır. Ekstraksiyonda bağımsız değişken olarak; çözücü oranı (%v/v), sıcaklık (⁰C), süre (dk), çözücü/şarap oranı (mL/mL) üzerinde TFM (GAE, mg/L), TAA (% inhibisyon), TMA (mg/L), trans-resveratrol (HPLC) ve renk tonu (RY) etkileri incelenmiştir.
Mayıs 2020, 138 sayfa
Anahtar kelimeler: Kırmızı şarap, trans-resveratrol, Fenolik Bileşik, Ses Ötesi Dalga destekli Ekstraksiyon (UAE), Optimizasyon, Modelleme
iii ABSTRACT Master Thesis
THE DETERMINATION OF OPTIMUM EXTRACTION CONDITIONS IN DEFINING THE trans-RESVERATROL, TOTAL ANTIOXIDANT AND TOTAL
PHENOL IN RED WINES
Ahsen Tuğçe ÇAYBOYLU
Ankara University
Graduate School of Natural and Applied Sciences Department of Food Engineering
Supervisor: Prof. Dr. R. Ertan ANLI
In this study the mathematical models have been formed and the optimum conditions have been determined for the polyphenols extractions and analysis of the red wines made from three types of grapes (Syrah, Öküzgözü and Kalecik karası) harvested in 2015, 2016 and 2017. Various chemical characterictics, total phenolic substance content, total antioxidant activity, total monomeric anthocyanin content, colour density, colour tone, colour compound and trans-resveratrol content of the red wines have been analyzed.
In the extraction of the red wines, solvent extraction method and ultrasound assisted extraction (UAE) method have been used and EtOH/H2O has been used as a solvent. In the extraction study central composite design (CCD) of response surface methodology (RSM) has been used for the experimental design. The solvent ratio (%v/v), temperature (⁰C), time (min), solvent/wine ratio (mL/mL) on TPC (GAE, mg/L), TAA (%
inhibition), TMA (mg/L), trans-resveratrol (HPLC) and colour tone (CT) effects have been examined as an independant variation on the extraction.
May 2020, 138 pages
Keywords: Red wine, trans-resveratrol, Phenolic Compound, Ultrasound Assisted Extraction (UAE), Optimization, Modeling
iv TEŞEKKÜR
Kırmızı şaraplarda geleneksel ekstraksiyon yöntemlerine alternatif olan, ses ötesi dalga destekli (UAE) ekstraksiyonunda optimum koşulların belirlenmesi çalışması Ankara Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü, Gıda Mühendisliği Anabilim Dalı Yüksek Lisans programında yapılmıştır.
Bu tez çalışmasının planlanması, hazırlanması, yürütülmesi ve danışmanlık aşamalarında bilgi ve tecrübesi ile bana yol gösteren ve bilgilerini benimle paylaşan değerli hocam Sayın Prof. Dr. R. Ertan ANLI' ya (Ankara Üniversitesi, Gıda Mühendisliği Anabilim Dalı), çalışmam süresince beni yönlendiren ve laboratuvar çalışmalarımda her zaman desteğini gördüğüm değerli hocam Sayın Uzm. Dr. Nilüfer VURAL' a (Ankara Üniversitesi, Kimya Mühendisliği Anabilim Dalı) teşekkürlerimi sunarım.
Araştırmada kullanılan şarap örneklerinin temin edildiği, Sevilen Şarap Sanayi A.Ş.' ye teşekkürü borç bilirim.
Tez çalışmalarım süresince her zaman yanımda olan, manevi desteklerini hissettiğim sevgili aileme, annem Öğr. Gör. Müzeyyen Hülya ÇANLI' ya ve babam Prof. Dr.
Mehmet ÇANLI' ya sonsuz teşekkür ederim.
Ahsen Tuğçe ÇAYBOYLU Ankara, Mayıs 2020
v
İÇİNDEKİLER TEZ ONAY SAYFASI
ETİK………..ⅰ ÖZET………ⅱ ABSTRACT………ⅲ TEŞEKKÜR………ⅳ SİMGELER VE KISALTMALAR DİZİNİ………...ⅸ ŞEKİLLER DİZİNİ………ⅺ ÇİZELGELER DİZİNİ………...………ⅻⅰ
1. GİRİŞ………1
2. KURAMSAL TEMELLER…...……….4
2.1 Üzüm Meyvesi………...……….……4
2.2 Ülkemizde Yetişen Şaraplık Üzüm Çeşitleri………...5
2.3 Şarabın İnsan Sağlığına olan Potansiyel Etkisi………...………...8
2.4 Fenolik Bileşiklerin Sınıflandırılması………..9
2.4.1 Fenolik asitler….………...12
2.4.1.1 Hidroksisinnamik asitler….………..12
2.4.1.2 Hidroksibenzoik asitler…….…...……….…16
2.4.1.3 Hidroksisinnamik türevleri……….……….19
2.4.2 Flavonoidler………...………...19
2.4.2.1 Antosiyanidinler……….22
2.4.2.2 Flavonoller………..26
2.4.2.3 Flavonlar……….28
2.4.2.4 Flavanonlar………...……….29
2.4.2.5 Prosiyanidinler………...30
2.4.2.6 Dihidrokalkonlar………...…………....31
2.5 Şarap Örneklerinde Fenolik Bileşenlerin Ekstraksiyonu ve Analizi…………..31
2.5.1 Geleneksel ekstraksiyon metotları……….……….32
vi
2.5.2 Geleneksel olmayan (Modern) ekstraksiyon metotları……..…………...….32
2.5.2.1 Süper-kritik akışkan ekstraksiyonu………..………...33
2.5.2.2 Ultrasonik ses ötesi dalga destekli ekstraksiyon (UAE)…………..…....…...34
2.5.2.3 Mikrodalga destekli ekstraksiyon....………....37
2.5.2.4 Vurgulu elektrik alan ekstraksiyonu……...………...….38
2.5.2.5 Yüksek hidrostatik basınç ekstraksiyonu...………...…………..39
2.5.3 Toplam antioksidan kapasitesi tayini…...………...………...41
2.5.4 Toplam fenolik madde tayini……...………...……….43
2.5.5 trans-resveratrol ’ün sıvı kromatografik tayini………....……….44
2.6 Deney Tasarımı ve Optimizasyon………...……….………..47
2.6.1 Deney tasarımı……….……….47
2.6.2 Cevap yüzeyleri……….………50
2.6.3 Merkezi kompozit tasarım (CCD)…………...………51
2.6.4 Box-Behnken tasarımı……….……….52
3. KAYNAK ARAŞTIRILMASI………...………...53
3.1 Şarap Yapısında Bulunan Fenoliklerin Yapısı………...………..53
3.2 trans-Resveratrol Kimyasal Yapısı ve Analiz Metotları………..54
3.3 Cevap Yüzey Metodolojisi (Response Surface Methodology, RSM) ile Yapılmış olan Litaritür Çalışmaları..……...…………...………..………..60
4. MATARYEL VE YÖNTEM………...……….……65
4.1 Materyal………...………65
4.1.1 Kırmızı şarap örnekleri…...…………..………...65
4.2 Yöntem………..66
4.2.1 Şarapların hazırlık aşaması………..………...66
4.2.2 Şarap ekstraksiyonu……….………66
4.2.3 Şarap analizleri……….………68
4.2.3.1 Serbest SO2 tayini……….……….68
4.2.3.2 Uçucu asit tayini………...………..………...68
vii
4.2.3.3 Toplam asit tayini………..………68
4.2.3.4 Alkol tayini……….………68
4.2.3.5 Renk tayini……….………68
4.2.3.6 Toplam monomerik antosiyanin tayini………..……….69
4.2.3.7 Toplam fenolik madde tayini………..……….70
4.2.3.8 Toplam SO2 tayini……….………71
4.2.3.9 pH tayini……….………72
4.2.3.10 Toplam antioksidan aktivite tayini………...……….72
4.3 trans-Resveratrolün HPLC Analizi………72
4.3.1 Standart çözeltilerin hazırlığı………..………72
4.3.2 Örneklerin hazırlığı……….……….73
4.3.3 Kullanılan cihaz, yazılım ve kimyasallar……..………..73
4.3.4 HPLC koşulları……….………74
5. ARAŞTIRMA BULGULARI………...76
5.1 Kırmızı Şaraplarda trans-Resveratrol’ ün Çözücü Ekstraksiyonu için Deneysel Tasarım ve Optimizasyon Çalışması………..………...…..76
5.2 Şarap Örneklerinde Kimyasal Analiz Sonuçları……….……….91
5.3 Şarap Örneklerinde ve Çözücü Ekstraksiyonu Yapılmış, Hidroalkolik Ekstraktlarda Toplam Fenolik Madde Miktar Tayini……...……….……....97
5.4 Şarap Örneklerinde ve Çözücü Ekstraksiyonu Yapılmış, Hidroalkolik Ekstraktlarda Toplam Antioksidan Aktivite Miktar Tayin……...………...100
5.5 Şarap Örneklerinde ve Çözücü Ekstraksiyonu Yapılmış, Hidroalkolik Ekstraktlarda Toplam Monomerik Antosiyanin Miktar Tayini………...103
5.6 Şarap Örneklerinde ve Çözücü Ekstraksiyonu Yapılmış, Hidroalkolik Ekstraktlarda trans-Resveratrol Miktar Tayini……….…...……….106
5.7 Şarap Örneklerinde ve Çözücü Ekstraksiyonu Yapılmış, Hidroalkolik Ekstraktlarda Renk Tayini………...…...……….109
6. SONUÇ VE TARTIŞMA………118
viii
KAYNAKLAR……….………121 EKLER………...………..132 EK 1 Toplam Fenol Madde Tayininde Kullanılan Gallik Asit Standart
Kalibrasyon Grafiği……….……….………133 EK 2 Toplam Monomerik Antosiyanin Miktarı Tayininde Kullanılan
Malvidin-3-glukoid Kalibrasyon Grafiği……….………....………134 EK 3 trans-resveratrol Starndart Kalibrasyon Grafiği...135 EK 4 Öküzgözü-3, 2016 Şarabının 320 nm’ deki HPLC Kromatogramı……...…136 EK 5 Öküzgözü-4, 2016 Şarabının 320 nm’ deki HPLC Kromatogramı……..….137 ÖZGEÇMİŞ………....……….138
ix
SİMGELER DİZİNİ
SO2 Kükürt di oksit KCl Potasyum klorür CH3COONa Sodyum asetat H Hidrojen N Normalite
NaOH Sodyum hidroksit RY Renk yoğunluğu OY Optik yoğunluk
ɛ Molar absorpsiyon katsayısı
⁰C Celcius H2SO4 Sülfürik asit Kg Kilogram L Litre m Kütle mg Miligram ml Mililitre hl Hektolitre V Hacim
SF Seyreltme faktörü A Absorbans
CO2 Karbon dioksit
ppm Milyonda biri ifade eder ppb Milyarda biri ifade eder ppt Binde biri ifade eder EGCG Epigallokateşin gallat
x Kısaltmalar
CVD Kardiyovasküler Hastalıklar IHD Kalp damar tıkanıklığı CHD Kroner kalp hastalığı
HPLC Yüksek basınçlı sıvı kromatografi DAD Diyot Array Dedektör
MA Moleküler ağırlık
OIV Uluslararası Şarap Örgütü
USDA Amerika Birleşik Devletleri Tarım Bakanlığı FAO Gıda ve Tarım Örgütü
GRAS Genellikle güvenli kabul edilebilen Diyabetes Mellitus Tip 1 Şeker Hastalığı
Glokom Göz tansiyonu
Plateled- Kan trombositlerinin pıhtılaşması Aggregation
FRAP The Ferric Reducing Antioxidant Potential ABTS 2,2'-azino-bis
DPPH 2,2-difenil-1-pikrilhidrazil DHC Dihidrokalkonlar
UAE Ultrasound - Assisted Extraction EFSA Avrupa Gıda Güvenliği Ajansı EU Avrupa Birliği
RSM Response Surface Methodology
PEF Pulsed Electric Field, Vurgulu Elektrik Alan
HHP High Hydrostatic Pressure, Yüksek Hidrostatik Basınç ANOVA Varyans Analizi
CCD Merkezi Kompozit Dizaynı BBD Box-Behnken Tasarımı
xi
ŞEKİLLER DİZİNİ
Şekil 2.1 Üzüm Tanesinin Anatomik Yapısı……….4
Şekil 2.2 Hidroksisinnamik Asidin Kimyasal Yapısı………...…12
Şekil 2.3 İsoferulik Asidin Kimyasal Yapısı………...12
Şekil 2.4 p-Hidroksisinnamik Asidin Kimyasal Yapısı………...………...13
Şekil 2.5 Hidroksisinnamik Asit Çeşitlerinin Yapısal Özellikleri………...…...13
Şekil 2.6 Hidroksibenzoik Asidin Kimyasal Yapısı………...16
Şekil 2.7 Sirinjik Asidin Kimyasal Yapısı………...16
Şekil 2.8 Hidroksibenzoik Asit Çeşitlerinin Kimyasal Özellikleri………...17
Şekil 2.9 Vanilik Asit Kimyasal Yapısı………...17
Şekil 2.10 Klorojenik Asit Kimyasal Yapısı………...…19
Şekil 2.11 Flavonoidlerin Genel Kimyasal Yapısı……….….20
Şekil 2.12 Genel Antosiyanin Bileşiği Kimyasal Yapısı………...…..22
Şekil 2.13 Flavonol Çeşitlerinin Kimyasal Yapısı………...……...28
Şekil 2.14 Flavonların Genel Kimyasal Yapısı………...……...29
Şekil 2.15 Luteolin Kimyasal Yapısı………...…..29
Şekil 2.16 Narinjenin Kimyasal Yapısı………...…………....30
Şekil 2.17 Doğal Prosiyanidin Kimyasal Yapısı………...…………..31
Şekil 2.18 Proses veya Sistemin Genel Modeli………...49
Şekil 2.19 Merkezi Kompozit Tasarım (k=3)………....…………..51
Şekil 3.1 Resveratrolün İzomerlerinin (trans ve cis) Kimyasal Yapısı…...…………....55
Şekil 4.1 Ultrasonik Banyo………..………....67
Şekil 5.1 TFM (GAE, mg/L) için deneysel sonuçların kuadratik modelden hesaplanan sonuçlarla karşılaştırılması………..……..………80
Şekil 5.2 Süre-Çözücü/Şarap oranı iki faktörlü modeli için, kodlanmış değerlerle eğrilik içeren üç boyutlu yüzey grafiği ve izohips eğrisi……….…81
Şekil 5.3 TMA ( mg/L) için deneysel sonuçların kuadratik modelden hesaplanan sonuçlarla karşılaştırılması………..…83
Şekil 5.4 EtOH-Süre oranı iki faktörlü modeli için, kodlanmış değerlerle eğrilik içeren üç boyutlu yüzey grafiği ve izohips eğrisi……….………..84
Şekil 5.5 Çözücü/Şarap-EtOH oranı iki faktörlü modeli için, kodlanmış değerlerle eğrilik içeren üçboyutlu yüzey grafiği ve izohips eğrisi………..85
Şekil 5.6 Süre-sıcaklık oranı iki faktörlü modeli için, kodlanmış değerlerle eğrilik içeren üç boyutlu yüzey grafiği ve izohips eğrisi………...…...85
Şekil 5.7 TAA (% inhibisyon) için deneysel sonuçların kuadratik modelden hesaplanan sonuçlarla karşılaştırılması………...………….87
Şekil 5.8 Süre-Çözücü/Şarap oranı iki faktörlü modeli için, kodlanmış değerlerle eğrilik içeren üç boyutlu yüzey grafiği ve izohips eğrisi………...……..…88
Şekil 5.9 Kırmızı ŞaraplardaTFM (GAE, mg/L) UAE, Uygulamadan, Optimum 1 ve 2 Aşamalarındaki Değişimi………...………...100
xii
Şekil 5.10 Kırmızı Şaraplarda TAA (% inhibisyon) UAE, Uygulamadan, Optimum 1 ve 2 Aşamalarındaki Değişimi…...………..…...103 Şekil 5.11 Kırmızı Şaraplarda TMA (mg/L şarap) UAE, Uygulamadan, Optimum
1 ve 2 Aşamalarındaki Değişimi………...………...106 Şekil 5.12 Kırmızı Şaraplarda trans-resveratrol (mg/L şarap) UAE, Uygulamadan,
Optimum 1 ve 2 Aşamalarındaki Değişimi………...………109 Şekil 5.13 Kırmızı Şaraplarda Renk Tonu (RY) UAE Uygulanmadan, Optimum
1 ve Optimum 2 Aşamalarındaki Değişimi………..……….117
xiii
ÇİZELGELER DİZİNİ
Çizelge 2.1 Türkiye’ de Yetiştirilen Kırmızı Şaraplık Üzüm Çeşitleri ve Yetiştiği
Bölgeler Tablosu………...………...5
Çizelge 2.2 Türkiye’ de Yetiştirilen Beyaz Şaraplık Üzüm Çeşitleri ve Yetiştiği Bölgeler Tablosu………6
Çizelge 2.3 Tarım ve Orman Bakanlığı 2018 Ocak Ayına ait Dünya Üzüm Verileri Tablosu………..……….7
Çizelge 2.4 Tarım ve Orman Bakanlığı 2018 Ocak Ayına ait Türkiye’ de Üzüm Verileri Tablosu………..………...7
Çizelge 2.5 Gıdalardaki Başlıca Fenolik Madde Grupları (Fenolik Asitler)…....……...10
Çizelge 2.6 Gıdalardaki Başlıca Fenolik Madde Grupları (Flavanoidler)………...11
Çizelge 2.7 Bazı Hidroksisinnamik Asit Türevlerinin Yapıları………...…...15
Çizelge 2.8 Bazı Hidroksibenzoik Asit Türevlerinin Yapıları………...…18
Çizelge 2.9 Flavonoid Alt Gruplarının Kimyasal Yapısı………...…...21
Çizelge 2.10 Yaygın Olarak Bulunan Antosiyaninlerin Yapıları………...22
Çizelge 2.11 Yaygın Olarak Bulunan Antosiyanidinlerin Kimyasal Yapısı………...23
Çizelge 2.12 Antosiyanidinlerin Doğada Bulunma Yüzdeleri Tablosu………...24
Çizelge 2.13 Yaygın Olarak Bulunan Antosiyanidinlerin Maksimum Absorbans ve Molar Absorpsiyon Değerleri……….…………...………..25
Çizelge 2.14 Yaygın Olarak Bulunan Flavonollerin Genel Kimyasal Yapısı………...27
Çizelge 2.15 Kırmızı Üzüm ve Kırmızı Üzümden Elde Edilmiş Ürünlerde Ses Ötesi Dalga Destekli Ekstraksiyonu ile Yapılmış Olan Literatür Çalışmaları……...35
Çizelge 2.16 Geleneksel Olmayan (Modern) Ekstraksiyon Metotları ile Yapılmış Olan Çalışmalar………..….40
Çizelge 3.1 Şaraplarda Bulunan Çeşitli Fenolik Bileşiklerin Genel Konsantrasyon Aralığı Tablosu……….………...54
Çizelge 4.1 Kırmızı Şarap Örnekleri Cins, Bağ ve Yıl Bilgisi………65
Çizelge 4.2 trans-resveratrolün HPLC Analizinde Kullanılan Gradient Sistem Mobil Faz Konsantrasyonları………...………..75
Çizelge 5.1 Merkezi Kompozit Tasarımda, (Central Composite Design, CCD) Kullanılan Bağımsız Değişkenlerin İncelenen Etkinlik Aralığı………..76
Çizelge 5.2 EtOH/H2O Ekstraksiyonu Deneysel Tasarım Noktaları ve Deney Sonuçları………..77
Çizelge 5.3 EtOH/H2O ekstraksiyonu: TFM (GAE, mg/L) Cevap Faktörü için Tanımlanan Kuadretik Modelin ANOVA Sonuçları...…………...79
Çizelge 5.4 EtOH/H2O ekstraksiyonu: TMA Cevap Faktörü için Tanımlanan Kuadretik Modelin ANOVA Sonuçları………...82
Çizelge 5.5 EtOH/H2O ekstraksiyonu: TAA (% inhibisyon) Cevap Faktörü için Tanımlanan Kuadretik Modelin ANOVA Sonuçları………...86
xiv
Çizelge 5.6 EtOH/H2O ekstraksiyonu: trans-resveratrol miktarı (HPLC ölçümü)
Cevap Faktörü için Tanımlanan Kuadretik Modelin ANOVA Sonuçları………..………...….89 Çizelge 5.7 Kırmızı Şaraplarda Genel Kimyasal Analiz Sonuçları……...………...….92 Çizelge 5.8 Kırmız Şaraplarda pH Analizi Sonuçları………...96 Çizelge 5.9 Kırmızı Şarapların TFM (GAE, mg/L şarap) Analiz
Sonuçları………...98 Çizelge 5.10 Kırmızı Şarapların TAA (% inhibisyon) Analiz Sonuçları………..101 Çizelge 5.11 Kırmızı Şarapların TMA (mg/L) Analiz Sonuçları………..104 Çizelge 5.12 Kırmızı Şarapların trans-resveratrol (mg/L) Analiz Sonuçları………....107 Çizelge 5.13 Kırmızı Şarapların Renk Yoğunluğu Analiz Sonuçları………....110 Çizelge 5.14 Kırmızı Şarapların Optimum Nokta 1 (UAE) Renk Yoğunluğu
Analiz Sonuçları……….………...113 Çizelge 5.15 Kırmızı Şarapların Optimum Nokta 2 (UAE) Renk Yoğunluğu
Analiz Sonuçları…………..………..114 Çizelge 6.1 Ses Ötesi Dalga Destekli (UAE) EtOH/H2O Çözücü Ekstraksiyonundan
Elde Edilen Optimizasyon Çalışması Sonuçları...119
1 1. GİRİŞ
Üzüm meyvesinin fermantasyonuyla, üzümün teknolojik açıdan ve katma değerce en nitelikli ürünü olarak düşünülen alkollü bir içecek olan şarap elde edilmiş olur.
Yüzyıllar boyunca, hemen hemen her kıtada üzümün şarap olarak işlenmiş olduğu bilgisi tarih kayıtlarında bulunmaktadır. Şarap kalitesini; üzüm cinsi, üzüm doğal yapısı, yetiştiği coğrafyanın iklim koşulları ve fermantasyon yöntemi gibi birçok oenolojik faktör etkilemektedir (Mencarelli ve Bellincontro 2018). Günümüzde birçok araştırmacı şarabın beslenme içerisinde sağlık üzerine olan etkisi üzerindeki etkilerini araştırmakta ve buna dikkat çekmektedir (Bisson vd 2002, Mencarelli ve Bellincontro 2018).
Şarap tüketimine dair yapılan epidemiyolojik klinik araştırmalar, kardiyovasküler hastalıklar (CVD) ile düzenli günlük şarap tüketimi arasında negatif bir korelasyon oluşturduğunu ortaya çıkarmıştır (Leger vd 1979, Haseeb vd 2019). Sağlık üzerine olan pozitif etkisi bakımından, düzenli günlük şarap tüketimi ile ölüm oranları ve kroner kalp damar tıkanıklığının (IHD) azalabileceği araştırılmaktadır. Yapılan bazı çalışmalarda şarabın kalp sağlığını korumadaki bu etkisinin, içeriğinde bulundurduğu kimyasal bileşen potansiyelinden kaynaklandığını öne sürmektedir. Şarabın biyoaktif bileşenlerinden olan etanol ve polifenol içeriği yapılan in-vivo çalışmalarda antioksidan etki oluşturması bakımından sağlık üzerine sinerjit bir etki oluşturduğunu ortaya çıkarmıştır (Iriti ve Varoni 2014). Geçmişten günümüze üzümün kimyasal yapısı üzerine yapılan araştırmalarla; şarabın biyolojik özelliklerinin daha iyi anlaşıla bilirliğine katkı bulunulmuştur (Gronbaek vd 1995). Renaud ve Lorgeril’ in French Paradox olarak adlandırılan çalışması ile elde edilen bulgular, şarabın antioksidan potansiyeline dair birçok araştırmacıyı teşvik eder niteliktedir.
Üzüm meyvesinin, ekonomik açıdan en değerli ürünü olan şarabın, besinsel içeriğinin sağlık üzerine olan olumlu etkileri, günümüzdeki araştırmalarda oldukça önem taşıyan bir konudur. Yapılan çalışmalarda, şarap tüketiminin insan sağlığına dair olumlu etkilerinin olduğu, bu etkilerin içeriğindeki yüksek miktardaki fenolik maddeler ile ilişkili olduğu düşünülmektedir. Şarap içeriğinde yer alan fenolik maddeler, yüksek antioksidan aktivitesine sahip olması ile birçok hastalığa karşı bağışıklık sistemini
2
güçlendirici etki göstermektedir. Ayrıca şarap içeriğinde yer alan yüksek miktardaki fenolik maddeler, antioksidan aktiviteleri sayesinde serbest radikallerin yakalanarak, inhibizasyonunu sağlar. Şarabın doğal yapısı gereği içeriğinde bulunan mevcut bileşenleri tespit etmek, analiz etmek ve ekstraksiyon aşamasında kullanılan yöntemlerin etkili olup, olmadığını belirlemek bu olumlu özellikleri barındırmasından dolayı önem taşımaktadır. Analizlerde kullanılan metotların sürdürülebilirliği ve metodun geliştirilebilirliği gelecekteki araştırmacılar için yol gösterici nitelikte kaynak oluşturmaktadır.
Şarap, karmaşık kimya ve biyokimyanın bir sonucu olarak oluşan bir alkollü içecektir (Bisson vd 2002). Aynı zamanda, şekerler, organik asitler, mayanın otoliz ürünleri ve fenolik bileşikler de dahil olmak üzere şarap bileşenleri zamanla şarabın tadını ve tadını iyileştirme eğiliminde olan bazı karmaşık reaksiyonlardan geçecektir (Zhang, Fu ve García Martín, 2017). Şarabın tüm bileşenleri arasında, fenolik bileşikler, şarabın organoleptik özelliklerinin oluşumunda, görünüm, koku ve tat gibi önemli bir rol oynadıklarından, şarabın kalitesini tanımlamada çok önemlidirler (Dipalmo, Crupi, Pati, Clodoveo ve Di Luccia, 2016). Spesifik olarak, antosiyaninler ve polimerik pigmentler şarap renginden sorumluyken, antosiyanik olmayan fenoller, özellikle flavan-3-ol ve flavonoller şarabın ekşimsi yapısının ve acılığının sebebidir (Coletta vd 2013).
Yıllandırma süreci devam ettikçe, şarabın içindeki monomerik flavan-3-ollar, glikoksilik asit ya da glikokal ile yavaş yavaş bağlanırlar (Tao ve arkadaşları, 2014).
Bu tez kapsamında, şarabın içeriğindeki fenolik bileşenlerin ekstraksiyon koşulları belirlenerek, optimize edilmiştir. Ekstraksiyonun optimizasyonu için matematiksel modeller uygulanmış, çözüm kümesi istenebilirlik fonksiyonuna göre belirlenmiştir.
Kırmızı şarap fenol bileşenleri ve toplam antioksidan madde miktarını tayin etmek için spektroskopik yöntemlerden, trans-resveratrol tayini için ise HPLC (high pressure liquid chromotography, yüksek basınçlı sıvı kromatografisi) yöntemi kullanılmıştır.
Enstrümantal olarak yapılan analizlerde günümüzdeki ilerlemeler, tek bir örneklemde yüzlerce değişkenin ölçülmesine olanak sağlayan bir hale gelmiştir. Bu veri setlerinin, çok değişkenli modelleme yaklaşımı ile çözümlenmesi sağlanmaktadır. Modellemeler ile araştırmacıların zaman bakımından verimliliği ve çevreci yeni nesil bir metotların
3
geliştirilmesine katkı sağlamaktadır. Temel bileşen analizleri genellikle ürün ve içindeki kimyasal bileşen arasındaki ilişkiyi araştırılmak için kullanılmaktadır. Fakat modellenmiş çok değişkenli bir istatistik teknik çalışma ile analizin sonuçlarının farklı yönlerden değerlendirilmesi arasında bir ilişki oluşturmaktadır.
Günümüzde biyoaktif bileşenlerin ekstraksiyonu için değişik metotlar kullanılmakta ve geliştirilmektedir. Geliştirilmekte olan güncel metotlarda, araştırmacıların dikkate değer bulduğu parametreler çevreci niteliklerin sağlanabilmesidir. Bu amaçla, solvent kullanımını en aza indirgemek ve ekstraksiyondan elde edilebilecek verimin maksimize edilmesi önem taşımaktadır. Bu çalışmada, bu değerler ışığında ekstraksiyon metodunu optimize etmek amaçlanmış olup, sonuçlar bu bilinçle incelenmiştir.
Ülkemizde bağcılık faaliyetleri kapsamında yetiştirilen üzüm çeşitlerinden; şarap teknolojisi bakımından üstün nitelikler gösteren Öküzgözü, Kalecik Karası ve Shiraz türlerinden belli koşullarda şarap üretimi yapılmış ve şarapların gerek fenol yapısı gerekse de antosiyanin yapısı HPLC ile saptanarak, ekstraksiyon metodu ile olan ilişkileri irdelenmiştir.
Şarap kalitesini belirleyici unsurların başında; üzümün kimyasal bileşimi, çeşidi, yetişme yılı, rekoltesi, yetişme bölgesi ve bölgesinin coğrafi koşulları gibi faktör gelmektedir (Ekşi 1989). Bu çalışma kapsamında; Ege bölgesinde Sevilen Şarap Sanayi A.Ş.’ ye ait Urla Kuşcular mevkiinde Güney, Batı ve Tepe bağlarından gelen 2015, 2016, 2017 döneminde hasat edilip Syrah, Kalecik Karası ve Öküzgözü üzümlerinden elde edilen şaraplar kullanılmıştır. Kalite bakımından yeterli olgunluğa erişen üzümler Ağustos – Eylül aylarında hasat edilmiştir. Şarap üretimi esnasında fermantasyon sıcaklığı 20-23 °C aralığındadır.
4 2. KURAMSAL TEMELLER
Üzüm meyvesinin çeşitli proseslerden geçerek, fermente edilmesi ile oluşan alkollü içeceğe şarap denilmektedir (Ribereau-Gayon 2000). Şarap içeriğinde yer alan kimyasal bileşenler, hem şarap işleme kalitesi bakımından hem de insan sağlığı bakımından önemli görülmekte ve bu amaçla incelenmektedir. Şarap; alkol, şeker, organik asit, ester, azotlu madde, renk bileşenleri, enzim, polifenol ve amino asitleri içeren kompleks bir yapıya sahiptir. Üzüm meyvesinin bileşiminden temel niteliklerini kazanan şarap, üzüm cinsi ve yapısı bakımından kalite değerlendirilmesi yapılır.
2.1 Üzüm Meyvesi
Asma bitkisinin meyvesi olan üzüm tanesi; histolojik olarak tane kabuğu (ekzokarp), tane eti (mezokarp ve endokarp) ve çekirdek olmak üzere üç kısımdan oluşmaktadır.
Üzüm tanesinin anatomik yapısı aşağıdaki şekilde açıklanmaktadır (Şekil 2.1).
Şekil 2.1 Üzüm Tanesinin Anatomik Yapısı
Mezokarp: Şeker:
%50, Organik asit:
%35, Aroma Maddeleri: <%20, Fenolikler: %10 - 20, K+: %20-30.
Endokarp: Şeker:
%25, Organik asit:
%30, Fenolikler: % 60, K+: % 20-30.
Ekzokarp: Şeker:
%25, Organik asit:
%35, Aroma maddeleri: >%80, Fenolikler: %20- 30, K+: %30-40.
5
Üzümün bu üç ana bölümü, hasat sonrası dahil olmak üzere şarap kalitesi üzerinde büyük etki göstermektedir. Üzümün cinsine göre, içeriğindeki kimyasal bileşenler farklılık göstermektedir. Oluşan bu farklılıklar, şarap içeriğinde de ölçüm metotları ile tespit edilebilmektedir.
2.2 Ülkemizde Yetişen Şaraplık Üzüm Çeşitleri
Şaraplık üzüm yetiştiriciliğinde Türkiye, ılıman iklimin uzun zaman görülmesi sebebiyle avantajlı bir coğrafyaya sahiptir. Üzüm meyvesinin, ılıman iklim özelliklerinde uzun zamanda olgunlaşması ile iyi kalitede kabul edilen şarapların eldesi mümkündür. Çok sıcak iklimde, kısa sürede olgunlaşan üzümden elde edilen şaraplarda ise; iyi şarap kalitesi oluşumuna rastlanmamaktadır. Aromatik madde içeriğince zengin kabul edilen şaraplar, ılıman iklim özelliklerinde yetişen üzümlerden elde edilmektedir.
Düşük verimde yetiştirilen üzümlerden, kalite değeri yüksek şarap elde edilmektedir.
Çok verimli ovalara ise; şaraplık üzüm yetiştiriciliği faaliyetleri tavsiye edilmemektedir.
Türkiye’ de yetiştirilen kırmızı şaraplık üzüm çeşitleri ve yetiştiriciliğinin yapıldığı bölgeler aşağıdaki çizelgede açıklanmaktadır (Çizelge 2.1).
Çizelge 2.1 Türkiye’ de Yetiştirilen Kırmızı Şaraplık Üzüm Çeşitleri ve Yetiştiği Bölgeler Tablosu
Yetiştiği Bölgeler Üzüm Çeşidi
Marmara Bölgesi Pinot Noir, Adakarası, Papazkarası, Semillon, Kuntra, Gamay, Karalahana, Cinsaut
Ege Bölgesi Carignane, Çal Karası, Merlot, Cabernet Sauvignon, Alicante, Bouschet
Karadeniz Bölgesi Öküzgözü, Boğazkere
İç Anadolu Bölgesi Kalecik Karası, Papazkarası, Dimrit Akdeniz Bölgesi Sergi Karası, Burdur Dimriti
Doğu Anadolu Bölgesi Öküzgözü, Boğazkere
Güneydoğu Anadolu Bölgesi Horoz Karası, Öküzgözü, Boğazkere, Sergi Karası
6
*Kaynak: Tarım ve Orman Bakanlığı, Bağ Yetiştiriciliğinde Softalık ve Şaraplık Üzüm Çeşitleri, 2006.
Türkiye’ de yetiştirilen beyaz şaraplık üzüm çeşitleri ve yetiştiriciliğinin yapıldığı bölgeler aşağıdaki çizelgede açıklanmaktadır (Çizelge 2.2).
Çizelge 2.2 Türkiye’ de Yetiştirilen Beyaz Şaraplık Üzüm Çeşitleri ve Yetiştiği Bölgeler Tablosu
Yetiştiği Bölgeler Üzüm Çeşidi
Marmara Bölgesi Clairette, Chardonnay, Riesling, Semillon, Beylerce, Yapıncak, Vasilaki
Ege Bölgesi Semillon, Bornova, Misketi
Karadeniz Bölgesi Narince
İç Anadolu Bölgesi Emir, Hasandede
*Kaynak: Tarım ve Orman Bakanlığı, Bağ Yetiştiriciliğinde Softalık ve Şaraplık Üzüm Çeşitleri, 2006.
Üzüm ve bağcılık faaliyetlerine dünya çapında bakılacak olduğunda, Türkiye’ nin gelişmekte olan bir konuma sahip olduğu açıkça görülmektedir. Bağ alanı ve üretim kapasitesi bakımından pazar içinde yer alan payı, dikkate değer bir aralıktadır. Fakat üzüm üretiminin şarapçılık faaliyetlerinde değerlendirilmemesi, geleneksel şarap kültürüne sahip olmamasından kaynaklanmaktadır. Aynı şekilde yıllık şarap tüketim miktarları değerlendirildiğinde de, bu durumun etkisi görülmektedir. Ülkemizde şarap tüketimine dair geleneksel bir kültürün yerleşmemesinin başlıca sebepleri, toplumsal inanç faktörüdür.
Tarım ve Orman Bakanlığı’ na ait verilere göre; Dünyada 2018 Ocak ayında yayınlanan tablo aşağıdaki gibidir.
7
Çizelge 2.3 Tarım ve Orman Bakanlığı 2018 Ocak Ayına ait Dünya Üzüm Verileri Tablosu
2012/2013 2013/2014 2014/2015 2015/2016 2016/2017 Alan (bin ha) 7.077 7.108 7.124 7.480 7.500
Verim (ton/ ha) 28 29 29 29 30
Üretim 20.059 21.005 20.916 21.942 22.002 Tüketim 20.002 20.916 20.908 21.804 21.989 İthalat 2.657 2.688 2.741 2.888 2.907 İhracat 2.677 2.753 2.724 3.007 2.901
*Kaynak: USDA, FAO (Erişim 26.01.2018)
Tarım ve Orman Bakanlığı’ na ait verilere göre; Türkiye’ de 2018 Ocak ayında yayınlanan tablo aşağıdaki gibidir.
Çizelge 2.4 Tarım ve Orman Bakanlığı 2018 Ocak Ayına ait Türkiye’ de Üzüm Verileri Tablosu
2012/2013 2013/2014 2014/2015 2015/2016 2016/2017 Alan (bin ha) 4.622 4.687 4.670 4.619 4.620
Verim (ton/ ha) 916 855 894 790 865
Üretim 4.234 4.011 4.175 3.650 4.000
Tüketim 1.991 1.996 2.093 1.831 2.071
İthalat 15 24 14.5 15.6 14.3
İhracat 1.123 1.187 971 1.296 1.000
*Kaynak: UDSA, TÜİK (Erişim: 26.01.2018)
Türkiye’ de sofralık ve kurutmalık üzüm üretiminde Ege Bölgesi birinci sırada gelmektedir. Ülke çapında sofralık ve kurutmalık üzüm üretim kapasitesinin %50’ den fazlası bu bölgeden sağlanmaktadır. Türkiye’ de Manisa ili bu üretimin yaklaşık olarak
%90’ lık kısmını tek başına karşılamaktadır.
8
Türkiye’ nin bağcılık haritasına bakıldığında; en geniş alanda yetiştiricilik yapan bölge Ege Bölgesi’ dir. Üretimin en büyük olduğu alan Manisa’ ya aittir. Manisa’ yı sırasıyla;
Denizli ve Mersin takip eder. Adana ve Antalya illeri de sıralamada diğer illerden sonra yer almaktadır.
Dünya üzüm yetiştiriciliğine bakıldığında, sofralık üzüm üretiminde Çin birinci sırada gelmektedir. Çin, Asya’ nın en büyük tedarikçisi olarak kabul edilmektedir. Avrupa Birliği’ nde ise; en önemli üzüm yetiştiriciliği İtalya ve Yunanistan’ da gerçekleşmektedir.
Tüketim şekli bakımından sofralık, kurutmalık ve şaraplık-şıralık olarak ayrılan üzüm için alternatif tüketim yollarının geliştirilmesi son yıllarda gündemde tutulmaktadır.
Üzüm suları; günümüzde beslenme otoriteleri bakımından antioksidan içeriğince zengin bir gıda olarak sağlıkça değerli görülmektedir. OIV (International Organisation of Vine and Wine) 2015 yılından itibaren üzüm için alternatif tüketim yollarına destek olmaktadır.
2.3 Şarabın İnsan Sağlığına olan Potansiyel Etkisi
21. yüzyılın en yaygın ve en tehlikeli hastalıklarından biri kabul edilen kansere karşı, günlük diyet içeriği ile alınan antioksidan madde miktarının antagonist bir ilişki gösterdiği yapılmış olan epidemiyolojik araştırmalarla kanıtlanmıştır. Kanser ile ilişkilendirilen serbest radikallerin, şarap içeriğinde yer alan yoğun antioksidan aktivite kapasitesine sahip olan fenolik maddeler aracılığıyla vücut hücrelerinden bloke edilerek uzaklaştırılabileceği kanıtlanmıştır. Şarabın doğal yapısında bulunan resveratrol; damar tıkanıklığı, cilt iltihabı, alerji gibi birçok hastalığın tedavisinde ve tümör oluşumuna izin verebilecek hücre içi moleküller üzerine serbest radikallerin bağlanmasını önleyerek, kanser oluşumunu engellemekte kullanılmaktadır. Bu kadar önemli bir bileşik olan resveratrolün en iyi kaynağının kırmızı üzüm olduğu tespit edilmiştir.
Kırmızı üzümün kabuk, etli meyve ve çekirdeklerinden elde edilen şarap yüksek polifenol bileşen içeriği bakımından, doğada erişilebilen en cazip kaynak olarak kabul
9
görmektedir (Drosou vd 2015). Şarap içinde yer alan bu fenolik bileşen içeriği büyük oranda antosiyaninlerden (malvidin, peonidin, pelargonin, delfinidin ve petunidin gibi) oluşmaktadır. Şarabın kimyasal yapısı içinde yer alan bu fenolik bileşenler antioksidan ve antimikrobiyel etki göstermesi bakımından önemli fitokimyasallar olarak belirlenmektedir.
İnsan sağlığı açısından işlevleri; tat ve koku oluşumundaki etkileri, renk oluşumu ve değişimine katılmaları, antimikrobiyal ve antioksidatif etki göstermeleri, enzim inhibisyonuna neden olmaları gibi birçok açıdan önem taşımaktadır. Fenolik bileşenler, 80 monomerli bileşiklere kadar kondanse olabilirler ve proteinlerle kompleks oluşturarak yapı içinde yer alırlar. Fenolik bileşikler, gıda maddelerinin görünüş, tat ve aroma gibi tüketim açısından önemli olan kalite özellikleri üzerine etkileri ve doğal antioksidan olarak insan sağlığı üzerine olumlu etkileri nedeniyle önemli bileşenlerdir.
Sağlık üzerine olumlu etkilerinden dolayı, fonksiyonel gıda olarak değerlendirilmektedir. Beslenme otoriteleri, fenolik bileşenlerin beslenemeye dair olumlu etkilerinden dolayı biyoflavonoid olarak adlandırmaktadır.
Son yıllarda bitkisel kökenli gıdalarda bulunan fenolik bileşiklerin yoğun bir şekilde incelenmesi, bunların insan sağlığı ile yakından ilişkisi olduğunun saptanmasından ve özellikle de kanser rastlanma sıklığını azalttığı yönündeki epidemiyolojik bilgilerden kaynaklanmaktadır. Birçok çalışmadan elde edilen bulgular, flavonoidlerin antimutajen ve antikarsinojen olduğunu desteklemektedir.
2.4 Fenolik Bileşenlerin Sınıflandırılması
Fenolik asitler (fenolik karbonik asitler) ve flavonoidler (flavan türevleri) olarak ana iki başlık altında incelenmektedirler. Fenolik asitler de kendi içinde üç başlıkta incelenmektedir. Bunlar; hidroksisinamik asitler (C6-C3), hidroksibenzoik asitler (C6- C1) ve hidroksisinamik türevleridir. Flavonoidler ise kendi içinde 8 alt başlığa ayrılmaktadır. Bunlar; antosiyanidinler, kateşinler, lökoantosiyanidinler, flavonoller, flavonlar, flavanonlar, proantosiyanidinler ve dihidrokalkonlardır.
10
Gıdalardaki başlıca fenolik madde gruplarının şematize edilmiş hali çizelge 2.5 ve çizelge 2.6’ de detaylı bir şekilde açıklanmaktadır.
Çizelge 2.5 Gıdalardaki Başlıca Fenolik Madde Grupları (Fenolik Asitler)
Fenolik Asitler
1.
Hidroksisinnamik Asitler (C6-C3)
1.1 o-kumarik asit 1.2 p-kumarik asit 1.3 Kafeik asit 1.4 Ferulik asit 1.5 İzoferulik asit 1.6 Sinapik asit
2. Hidroksibenzoik Asitler (C6-C1)
2.1 Salisilik asit
2.2 m-hidroksibenzoik asit 2.3 p-hidroksibenzoik asit 2.4 0-protokateşuik asit 2.5 β-rezorsilik asit 2.6 Gensitik asit 2.7 Vanilik asit 2.8 Paravanilik asit 2.9 Sirinjit asit
3. Hidroksisinnamik Türevleri
3.1 Klorojenik asit 3.2 Neoklorojenik asit 3.3 Kriptoklorojenik asit 3.4 İzoklorojenik asit 3.5 p-kumaraoilquinik asit 3.6 Kaftarik asit 3.7 Kutarik asit
11
Çizelge 2.6 Gıdalardaki Başlıca Fenolik Madde Grupları (Flavanoidler)
FL A V AN OİDL ER
1.Antosiyanidinler
1.1 Pelargonin 1.2 Siyanidin 1.3 Delfinidin 1.4 Peonidin 1.5 Petunidin 1.6 Malvidin
2. Kateşinler
2.1 (+) Kateşin 2.2 (-) Epikateşin 2.3 (+) Gallokateşin 2.4(-) Epigallokateşin
3. Lökoantosiyanidinler 3.1 Lökosiyanidin 3.2 Lökodelfinidin
4. Flavonoller
4.1 Kamferol 4.2 Quersetin 4.3 Mirisetin 4.4 İzonamretin
5. Flavonlar 5.1 Apigenin
5.2 Luteolin
6. Flavanonlar
6.1 Narinjenin 6.2 Hesperitin 6.3 Eriyodiktol 6.4 İzosakuranetin
7. Prosiyanidinler
7.1 Prosiyanidin dimer 7.2 Prosiyanidin oligomer 7.3 Prosiyanidin oligomer
8. Dihidro-kalkonlar 8.1 Floridzin 8.2 Floretin
12 2.4.1 Fenolik asitler
Fenolik asitler, bitki dokularında serbest halde bulunmamaktadırlar. Bitkilerin prosesi sırasında, hidrolize şekilde ortaya çıkmaktadırlar. Fenolik asitlerin, fenol halkasına bağlı olan hidroksil grupları yapı gereğince çok aktif nitelik taşımaktadır. Fenolik asitler;
hidroksisinamik asit ve hidroksibenzoik asit olarak iki alt grupta incelenmektedir.
2.4.1.1 Hidroksisinnamik asitler
Hidroksisinnamik asitler, doğada bitkisel kaynaklarda yaygın bir biçimde bulunurlar.
C6-C3 fenilpropan halka yapı özelliği göstermektedir. Fenilpropan halka yapısına bağlanan hidroksil grubunun konfigürasyon (konum ve sayısına göre) özelliğine göre farklılık göstermektedir.
Şekil 2.2 Hidroksisinnamik Asidin Kimyasal Yapısı
Hidroksisinnamik asitler, doğada serbest halde çok nadir halde bulunurlar, genellikle asit türevleri formunda bulunurlar. Hidroksisinnamik asit türevlerine örnek olarak; p- kumarik asit, kafeik asit ve ferulik asit verilmektedir.
Şekil 2.3 İsoferulik Asidin Kimyasal Yapısı
13
Şekil 2.4 p-Hidroksisinnamik Asidin Kimyasal Yapısı
Şekil 2.5 Hidroksisinnamik Asit Çeşitlerinin Yapısal Özellikleri
Hidroksisinnamik asitlerin antioksidan aktiviteleri, yapılan in-vitro çalışmalarda araştırmacılar tarafından detaylı olarak incelenmiş ve bu bileşiklerin yapısal özellikleri ile antioksidan aktiviteleri tanımlanmıştır (Razzaghi-Asl vd 2013).
Hidroksisinnamik asitlerin antioksidan aktivitesini etkileyen faktörler;
• Aromatik halka üzerinde asıl grubun yerini alan gruplar,
• Karboksil fonksiyonel grubuna göre, hidroksil gruplarının sayısı ve konumları,
• Bileşiğin esterifikasyonu, konumu ve niteliği,
Son yıllarda yapılan araştırmalarda, hidroksisinnamik asitlerin antimikrobiyel ajan özelliklerinde olduğu ve minimum konsantrasyonlarda dahi patojenik
Asit R1 R2 R3 R4
p-Kumarik H OH H H
Kafeik H OH OH H
Ferulik OCH3 OH H H Sinapik OCH3 OH OCH3 H
14
mikroorganizmaları inhibe edebileceğini göstermiştir (Guzman vd 2013). Yapılan çalışmalarda; antimikrobiyel etki bakımından selektif indekse göre en etkili hidroksisinnamik asidin o-kumarik asit olduğu tespit edilmiştir. o-kumarik asidi;
sırasıyla p-kumarik asit, m-kumarik asit ve sinnamik asit takip etmektedir.
Hidroksisinnamik Asit ve Türevlerinin Fonksiyonları:
• İnsülin direncine karşı koyabilen,
• Kardiyovasküler hastalıklara karşı koruyucu,
• Kilo alma ve obeziteyi engelleyici,
• Diyabetes mellitusu (şeker hastalığı) önleyici,
• Oksidatif stresi engelleyici,
• Güçlü antioksidan potansiyeli,
• Anti kanserojenik etki potansiyeli,
• Anti mutajenik etki,
• Bağışıklık sistemini destekleyici,
• Karaciğer fonksiyonlarını iyileştirici,
• Böbrek fonksiyonlarının bozukluğunun giderilmesi,
•
Antiproliferatif etkiye sahip,•
Yaşlanma karşıtı etki gösterme özelliği,•
Diş ve diş eti hastalıklarının oluşumunu engelleyici,15
Çizelge 2.7 Bazı Hidroksisinnamik Asit Türevlerinin Yapıları Sıra
No:
Kimyasal Adı:
Konfigürasyon Gösterimi (yapısal):
Formül Gösterimi:
Doğada Bulunduğu Kaynaklar:
1 Kafeik
Asit C9H8O4
Kahve, şarap, zerdeçal, adaçayı, patates, elma, mantar, armut, çilek vb.
2 Kumarik
Asit
C9H8O3
Karanfil, yer fıstığı, zeytin, hurma, elma, domates, sarımsak, havuç, fesleğen vb.
3 Ferulik
Asit
C10H10O4
Bitter çikolata, pirinç, buğday, yulaf, ananas, kahve çekirdeği, kuşkonmaz, yer fıstığı, fındık, muz, ıspanak, pancar, soya fasulyesi, üzüm, patlıcan vb.
4 Sinapik Asit
C11H12O5
Çilek, yulaf, limon, biberiye, adaçayı, brokoli, lahana, defne yaprağı, beyaz soğan, kekik, şalgam, yaban mersini vb.
16 2.4.1.2 Hidroksibenzoik asitler
Hidroksibenzoik asitler, bitkisel kaynaklarda iz miktarda (10 ppm kadar) bulunmaktadırlar. C6-C1 iskelete sahip fenilpropan yapısına sahiptirler. Doğada renksiz halde bulunurlar ve bağlı formdadırlar.
Şekil 2.6 Hidroksibenzoik Asidin Kimyasal Yapısı
Hidroksibenzoik asitlerin yaygın olan türevlerine; salisilik asit, m-hidroksibenzoik asit, p-hidroksibenzoik asit, o-protokateşuk asit, β-rezorsilik asit, gensitik asit, vanilik asit, paravanilik asit ve sirinjik asit örnek olarak verilebilir.
Şekil 2.7 Sirinjik Asidin Kimyasal Yapısı
17
Şekil 2.8 Hidroksibenzoik Asit Çeşitlerinin Kimyasal Özellikleri
Hidroksibenzoik asitler ile ilgili olarak yapılan epidemiyolojik çalışmalarda, kronik hastalık riskinin azaltılmasında etkili rol oynadıkları tespit edilmiştir (Pietta vd 2003 ve Lee 2003).
Şekil 2.9 Vanilik Asit Kimyasal Yapısı Hidroksibenzoik
Asitler
R1 R2 R3 R4
• p-Hidroksibenzoik Asit
OH H H H
• Vanilik Asit OH H OCH3 H
• Gallik Asit OH OH OH H
• Sirinjik Asit OH OCH3 OCH3 H
• Salisilik Asit H H H OH
• Gensitik Asit OH H H OH
18
Çizelge 2.8 Bazı Hidroksibenzoik Asit Türevlerinin Yapıları
Sıra No:
Kimyasal Adı:
Konfigürasyon Gösterimi (yapısal):
Formül Gösterimi:
Doğada Bulunduğu Kaynaklar:
1
p-Hidroksibenzoik Asit C7H6O3
Ahududu, elma, armut, çilek, üzüm, portakal vb.
2
Vanilik Asit
C8H8O4
Pembe (rose) şarap, hurma, vanilya, paprika biberi, yaban mersini vb.
3
Gallik Asit
C7H6O5
Çay, fındık, zeytin, zeytinyağı, ceviz, yeşil çay, kahve çekirdeği vb.
4 Sirinjik
Asit C9H10O5
Biberiye, kekik, fesleğen, bal, kırmızı şarap, balkabağı, hurma, zeytin vb.
5
Salisilik Asit
C7H6O3
Sarımsak, soya sosu, vanilya, safran, beyaz şarap, kimyon, tarçın, adaçayı, zerdeçal, nane, zencefil, bal vb.
6
Gensitik Asit
C7H6O4
Karadut, buğday, arpa, çavdar, mantar, kivi, çilek, kuş üzümü, kırmızı şarap vb.
19 2.4.1.3 Hidroksisinnamik türevleri
• Klorojenik Asit
• Neoklorojenik Asit
• Kriptoklorojenik Asit
• İzoklorojenik Asit
• p-kumaraoilquinik Asit
• Kaftarik Asit
• Kutarik Asit
Klorojenik asit, yeşil kahve çekirdeklerinden izole edilmiştir. Quinik ve kafeik asit ile kolayca ayrışabilme özelliği taşımaktadır. Kahve çekirdeklerinin, %5-10’ unu klorojenik asit oluşturmaktadır. Kahveye özgü olan, aromatik tatların gelişmesinde etkili rol oynamaktadır.
Şekil 2.10 Klorojenik Asit Kimyasal Yapısı
2.4.2 Flavonoidler
Flavonoidler, bitki ve mantarların sekonder (ikincil) metabolitleri olarak kabul edilmektedir. Kimyasal yapısını, iki fenil halkası ve bir heterosiklik halka oluşturmaktadır. Genel flavonoid yapısı, 15 karbon içeren bir iskelet yapısıdır.
20
Şekil 2.11 Flavonoidlerin Genel Kimyasal Yapısı
Flavonoidler, sağlığı olumlu yönden etkileyen ve kronik hastalıklara karşı önleyici etkiye sahip bileşenler olarak kabul edilmektedir. Epidemiyolojik olarak klinik ve hayvan grupları üzerinde yapılan çalışmalarda, flavonoidlerin kanser gibi önemli hastalıkların oluşma koşullarına karşı koruyucu etki gösterebileceklerini ortaya koymaktadır. Flavonoidler; antibakteriyel, antiviral ve antienflamatuar etki özelliklerine sahiptirler.
Flavonoidler, bitkilerde yaygın olarak bulunabilen bir fenolik sınıfıdır. Kuarsetin ve rutin çay, kahve ve tahıl ürünlerinde yer alan en büyük flavonoid gruplarındandır.
Flavonoidler; antosiyanidinler, kateşinler, lökoantosiyanidinler, flavonoller, flavonlar, flavanonlar, prosiyanidinler, dihidrokalkonlar olmak üzere alt gruplarda incelenmektedirler.
21
Çizelge 2.9 Flavonoid Alt Gruplarının Kimyasal Yapısı Sıra
No:
Flavonoid Alt Grubu:
Konfigürasyon Gösterimi (yapısal):
Flavonoidlere Örnek:
Doğada Bulunduğu Kaynaklar:
1 Flavonoller
Kuarsetin, Kaempferol, Mirisetin
Soğan, brokoli, elma, vişne, çay, karalahana, kırmızı şarap, üzüm vb.
2 Flavonlar
Apigenin, Luteolin, Tangerin
Maydanoz, kekik, limon, mandalina, portakal vb.
3
Antosiyanidinler
Siyanidin, Delfinidin, Malvidin, Peonidin, Petunidin, Pelargonin
Vişne, kiraz, üzüm, çilek, ahududu vb.
4 Prosiyanidinler Epikateşin,
Elma, üzüm, kakao, çam ağacı kabukları vb.
5 Flavanonlar
Narinjenin, Hesperitin
Limon, portakal, mandalina, greyfurt vb.
6 İsoflavonlar
Daidzein, Genistein,
Glycitein, Daizin, Genistin, Glisitin
Soya fasulyesi, bakla, fasulye vb.
22 2.4.2.1 Antosiyanidinler
Antosiyanidinler, doğada serbest formda bulunmayan ve yapısının temeli 2- fenilbenzopirilium (flavilium katyonu) oluşmaktadır. Antosiyaninler; meyve, sebze ve çiçeklerde tat, aroma, koku ve renk niteliklerini kazandıran suda çözünebilir özellikteki bileşiklerdir. Antosiyanidinler, kırmızı üzümlerdeki renk bileşenleridir. Şarapların kendine özgü kırmızı, mavi ve mor tonlardaki renklerini oluşturmaktadırlar (Mazza 1995).
Çizelge 2.10 Yaygın Olarak Bulunan Antosiyaninlerin Yapıları
Antosiyanidin R3 R5
Pelargonin (Pg) H H
Siyanidin (Cy) OH H
Peonidin (Pn) OCH3 H
Delfinidin (Dp) OH OH
Petunidin (Pt) OCH3 OH
Malvinidin (Mv) OCH3 OCH3
Şekil 2.12 Genel Antosiyanin Bileşiği Kimyasal Yapısı
23
Çizelge 2.11 Yaygın Olarak Bulunan Antosiyanidinlerin Kimyasal Yapısı Sıra
No:
Antosiyanidin Adı:
Konfigürasyon Gösterimi (yapısal):
Kimyasal Formülü:
Doğada Bulunduğu Kaynaklar:
1 Delfinidin
C15H9O7
Kırmızı üzüm, portakal, böğürtlen,
2 Siyanidin C15H11O6
Elma, kırmızı üzüm, kırmızı lahana, kiraz, şeftali, portakal, erik, ahududu, çilek, böğürtlen vb.
3 Malvidin C17H15O7
Kırmızı şarap, yaban mersini, üzüm vb.
4 Peonidin C16H13O6
Üzüm, erik, vişne, kızılcık, yaban mersini vb.
5 Petunidin C15H11O7
Üzüm, domates, çilek, nar vb.
6 Pelargonin C15H11O5
Çilek, karadut, üzüm, erik, nar, kızılcık, portakal, ahududu vb.
24
Çizelge 2.12 Antosiyanidinlerin Doğada Bulunma Yüzdeleri Tablosu
Antosiyanidin Doğada Bulunma Olasılığı Yüzdesi (%) Pelargonin (Pg) %12
Siyanidin (Cy) %50 Peonidin (Pn) %12 Delfinidin (Dp) %12 Petunidin (Pt) %7 Malvinidin (Mv) %7
Petunidin; doğada birçok meyvede yer alan en yaygın antosiyanidin formudur.
Malvidin; antioksidan potansiyeli bakımından oldukça önemli kabul edilen bir bileşiktir.
Antosiyanidin Bileşenlerin Sağlık Üzerine Olan Faydaları;
• Glokom (göz tansiyonu) gibi görme kusurları için, iyileştirici etkilerinin olduğu,
• Kardiyovasküler hastalıklar bakımından incelendiğinde; yapılan in-vitro çalışmalarda, kan damarlarındaki trombositlerin pıhtılaşmasını (Plateled Aggregation - PLT) engellediği,
• Günlük diyet ile alımında, kan damar tıkanıklarının engellenebileceği,
• Göğüs kanserinin yayılmasına karşı engelleyici etki gösterebileceği,
• Diyabet hastalarında, insülin hassasiyetinde etkili olduğu,
• Yapılan deneysel çalışmalarda, obez deney farelerinde yağ yakımı etkisini arttırıcı özelliğe sahip olduğu,
• Metabolik hastalıklara karşı, koruyucu etkilerinin olduğu,
25
Ultrason Destekli Ekstraksiyon Uygulamaların Antosiyanidin Ekstraksiyonuna Olan Avantajları:
• Hızlı ekstraksiyon avantajına sahip olması,
• Ekstraksiyon süresini kısaltması,
• Organik solvent tüketimini azaltması,
• Çevre kirliliğini engelleyebilir olması,
• Performansı daha yüksek ekstrakte eldesi,
• (ısıl işlem olmaması nedeniyle)
• Kolay ve güvenli olması,
• Yatırım ve operasyon maliyetlerinin düşük olması,
• Sürdürebilir olması,
• Yeni nesil çevreci alternatif uygulama olması,
Çizelge 2.13 Yaygın Olarak Bulunan Antosiyanidinlerin Maksimum Absorbans ve Molar Absorpsiyon Değerleri
Antosiyanidin Adı:
Kullanılan Çözücü:
λvis-max (nm)
Molar Absorpsiyon Katsayısı (ε)
Referans:
Siyanidin %0,1 HCl’ de EtOH
510.5 nm 24600 Schou, 1927
Delfinidin %0,1 HCl’ de EtOH
522.5 nm 34700 Hrazdina vd,
1927 Malvidin %0,1 HCl’ de
EtOH
520 nm 37200 Schou, 1927
Pelargonin %0,1 HCl’ de EtOH
504.5 nm 17800 Schou, 1927
Peonidin %0,1 HCl’ de EtOH
511 nm 37200 Schou, 1927
Petunidin %0,1 N HCl 520 nm 33040 Niketic-
Aleksic ve Hrazdina, 1972
26 2.4.2.2 Flavonoller
Flavonoller, doğada çeşitli bitki gruplarında yüksek konsantrasyonlarda yer alan fitokimyasal bileşen olarak değerlendirilir. Flavonoller, 3-hidroksiflavon yapı omurgasına sahip flavonoid sınıfıdır. Flavonoller; kimyasal yapı farklılıklarına göre kendi içinde çeşitlilik göstermektedir. Çeşitliliği, fenolik – OH gruplarının farklı konumlarından kaynaklanmaktadır. Doğada yaklaşık olarak, 4000 farklı flavonol tanımlanmıştır. Tanımlanan flavonollerin; anti-viral, anti-alerjik, antioksidan ve bağışıklık sistemi için anti-enflamatuar etkilerinin olduğu belirlenmiştir. Bitkilerde yer alan flavonoller, genellikle açık sarı renk tonlarında bulunmaktadırlar. Meyve içeriğinde bulunan flavonol miktarını; meyve türü, yetişme koşulları, olgunlaşma derecesi, hasat zamanı ve işleme tekniklerine göre değişkenlik gösterebilirler. Mirisetinin olgun siyah üzümlerde yüksek konsantrasyonlarda, kuarsetinin de olgunlaşmamış siyah üzümlerde yüksek konsantrasyonlarda bulunduğu tespit edilmiştir (Hermann 1976).
Kuarsetinin, saman nezlesi ve alerjik kronik hastalıklara karşı yatıştırıcı etkilerinin olduğu araştırmacılarca tespit edilmiştir (Szalay 2015). Anti-enflamatuar etkileri bakımından, sağlık ile ilişkilendirilmektedirler.
Flavonoller; elma, kayısı, bezelye, brokoli, domates, kırmızı şarap, yaban mersini, kızılcık, lahana, pırasa, armut, soğan, brüksel lahanası, çay, kırmızı üzüm ve kiraz gibi gıdalarda yüksek konsantrasyonlarda bulunmaktadırlar.
Flavonoller, monoglikozit ve triglikozit formunda bulunurlar (Shadidi ve Naczk, 1995).
Monoglikozitler genellikle, 3-O-glikozit formu şeklinde bulunmaktadırlar (Hermann 1976).
27
Çizelge 2.14 Yaygın Olarak Bulunan Flavonollerin Genel Kimyasal Yapısı Sıra
No:
Flavonol Adı:
Konfigürasyon Gösterimi (yapısal):
Kimyasal Formülü:
Doğada Bulunduğu Kaynaklar:
1 Kuarsetin
C15H10O7
Kırmızı şarap, ıspanak, soğan, lahana, yeşilçay, adaçayı, elma, bezelye, üzüm, zeytinyağı, domates, kakao, buğday, yeşil yapraklı sebzeler vb.
2 Kaempferol C15H10O6
Lahana, ıspanak, hindiba, rezene, safran, tarhun, frenk soğanı vb.
3 Mirisetin
C15H10O8
Fesleğen, maydanoz, rezene, çay, kırmızı şarap, üzüm vb.
4 İzoramnetin
C16H12O7
Frenk soğanı, rezene, tarhun, armut, soğan, badem vb.
28
Şekil 2.13 Flavonol Çeşitlerinin Kimyasal Yapısı
2.4.2.3 Flavonlar
Flavonlar, genellikle aglikon ve glikozit formunda gıdalarda yer almaktadırlar.
Flavonlar, 2-fenilkromen-4-on yapı iskeletine sahip bir flavonoid alt sınıfıdır. Flavonlar, flavonoller kadar meyve ve sebzelerde yaygın olarak bulunmazlar. Flavonlar, genellikle 7-O-glikozit yapı formunda bulunmaktadır.
Doğada yaygın olarak bulunan flavonlar; apigenin, luteolin ve tangerindir. Flavonlar yaygın olarak, bitkilerde ve kırmızı-mor meyvelerde bulunmaktadır.
Yapılan in-vitro ve in-vivo çalışmalarda, flavonların biyolojik aktiviteleri araştırılmaktadır. Bitkilerde yer alan flavon konsantrasyonunun; bitkinin yetişme koşullarından etkilendiği tespit edilmiştir. Kurutulmuş papatya çiçeklerinde ve kurutulmuş maydanoz yapraklarında, en yüksek flavon konsantrasyonlarına ulaşılmıştır (Švehlíková ve Repčák, 2006).
Günlük diet içinde alınan flavon miktarı, sağlık faydalarının yanında metabolizma için gereken biyolojik aktivitelerin sağlanmasında önemli rol oynamaktadır (L.H vd, 2004).
Flavonol Adı: R1 R2
Kaempferol H H
• Kuarsetin H OH
• Mirisetin OH OH
• İzoramnetin H OCH3
29
Şekil 2.14 Flavonların Genel Kimyasal Yapısı
Tahıl ve tahıl türevlerinde, flavon çeşidi olan luteolin varlığı tespit edilmiştir. Hububat tanelerinde ve bazı ot türlerinde luteolin bulunmaktadır. Luteolin glikozitleri, bazı sebze ve yapraklarında bulunduğu tespit edilmiştir (Peterson ve Dwyer, 1998).
Şekil 2.15 Luteolin Kimyasal Yapısı
2.4.2.4 Flavanonlar
Flavanonlar, genellikle glikozit formunda olan ve renksiz halde bulunan flavonoidlerin alt sınıfıdır. Flavanonların, insan sağlığına olan yararlı etkileri nedeniyle çoğu bitki türündeki sentezlenme mekanizması günümüzde araştırmacılarca çalışılmaktadır.
Flavanonlar, doğada en yaygın olarak turunçgillerde bulunmaktadır. Turunçgillerde genellikle, glikozit yapı formunda yer alan flavanonlar; bitkilerde glikozidik yapı
30
formunda bulunmaktadır (Rouseff, 1980). Flavanonların bitkilerde, bitki türüne bağlı olarak gövde, çiçek, yaprak, kök, tohum, meyve ve kabuklarda bulunduğu tespit edilmiştir. Turunçgillerde, meyvenin etli kısımlarına oranla kabuk kısımlarına yakın olan yerler ve kabukta daha yüksek konsantrasyonda flavanon bulunmaktadır.
Flavanonlardan en yaygın olanları; narinjenin, hesperitin, eriyodiktol ve izosakuranatindir.
Narinjenin; turunçgillerde yüksek konsantrasyonda bulunurken, domates ve ürünlerinde düşük konsantrasyonlarda bulunduğu tespit edilmiştir (Erlund, 2004). Narinjenin hem aglikon formunda, hem de glikozit formunda bulunabilmektedir. Turunçgillerde yer alan ekşimsi, acı tat oluşumunda narinjenin farklı formlarının bulunması sorumlu olmaktadır.
Şekil 2.16 Narinjenin Kimyasal Yapısı
2.4.2.5 Prosiyanidinler
Prosiyanidinler, flavonoidlerin proantosiyanidin sınıfına ait bir alt grubudur. Bitkilerde yaygın olarak bulunan proantosiyanidinler, biyolojik aktiviteleri bakımından yararlı kabul edilen polifenollerdendir (Kraus ve Geraskin, 2017).
Diet fitokimyasal yapısı olarak prosiyanidinler; dimerik, trimerik, tetramerik ve oligamerik formlarda bulunabilirler. Doğada yüksek konsantrasyonlarda bulunduğu kaynaklar; elma, kakao, üzüm ve duttur.
31
Şekil 2.17 Doğal Prosiyanidin Kimyasal Yapısı
Üzüm meyvesinin kabuklarında bulunan prosiyanidinler; yaklaşık olarak %53 dimer,
%24 trimer ve %23 tetramer yapısında bulunmaktadır.
2.4.2.6 Dihidrokalkonlar
Dihidrokalkonlar (DHC), kalkon halkası ile ilişkili olan kimyasal bileşenlerdir. Kalkon yapısının hidrojenlendirilmiş bir formu olarak, aktif olan bir bileşendir.
Yaygın olarak bulunan dihidrokalkonlar, floridzin ve floretindir. Floridzin, floretinin glikozit formudur. Floridzin, yaygın olarak genç elma dallarından elde edilebilmektedir.
2.5 Şarap Örneklerinde Fenolik Bileşenlerin Ekstraksiyonu ve Analizi
Ekstraksiyon işlemi ile fenolik bileşenleri şarap örneklerinden ayırmanın ilk basamağı olarak görülmektedir. Ekstraksiyon yöntemleri arasında ekstraksiyon prensibine göre;
çözücü ekstraksiyonu, damıtma metodu, presleme gibi çeşitli metotlar bulunmaktadır.
Fenolik maddelerin tanımlanmasında, uygulanılan ekstraksiyon tekniği önem bakımından birincildir.
Ekstraksiyon gerçekleşirken, örneğin doğal yapısı içindeki birçok faktörden etkilenmektedir. Örneğin kimyasal özelliklerinden; aroma halka yapısı, polaritesi, hidroksil grupları gibi farklıları ekstraksiyonu etkileyen faktörlerdir.
