Psoriatik Epidermiste Keratinosit Apoptozisi Azalm›ﬂt›r Keratinocyte Apoptosis is Decreased in Psoriatic Epidermis

(1)

Orijinal Araﬂt›rma

Original Investigation

Psoriatik Epidermiste Keratinosit Apoptozisi Azalm›ﬂt›r

Keratinocyte Apoptosis is Decreased in Psoriatic Epidermis

Semih Tatl›can, Ata Türker Ar›kök*, Özlem Gülbahar**,

Cemile Eren, Zeliha Ulukarada¤, Fatma Eskio¤lu

Sa¤l›k Bakanl›¤› D›flkap› Y›ld›r›m Beyaz›t E¤itim ve Araflt›rma Hastanesi, Dermatoloji Klini¤i, Ankara *Sa¤l›k Bakanl›¤› D›flkap› Y›ld›r›m Beyaz›t E¤itim ve Araflt›rma Hastanesi, 2. Patoloji Klini¤i, Ankara **Gazi Üniversitesi T›p Fakültesi, T›bbi Biyokimya Anabilim Dal›, Ankara, Türkiye

167

Yaz›flma Adresi/Address for Correspondence: Dr. Semih Tatl›can, Sa¤l›k Bakanl›¤› D›flkap› Y›ld›r›m Beyaz›t E¤itim ve Araflt›rma Hastanesi, Dermatoloji Klini¤i, Ankara, Türkiye Tel.: +90 312 418 48 58-312 596 30 28 E-posta: semihtatlican@gmail.com

Geliﬂ Tarihi/Received: 19.05.2009 Kabul Tarihi/Accepted: 17.06.2009

Özet

Amaç: Keratinositlerin hiperproliferasyonu ve anormal diferensiyasyonu psoriasis vulgarisin temel özellikleridir. Psoriasis

vulgaris keratinosit apoptozisinin azald›¤› bir hastal›k olarak kabul edilse de; sonuçlar birbiriyle çeliflmektedir. Bu çal›flma-n›n amac› kal›nlaflm›fl bir epidermisin oluflmas›nda artm›fl keratinosit proliferasyonu yaçal›flma-n›nda azalm›fl keratinosit apoptozisi-nin de rol al›p almad›¤›n› araflt›rmakt›r.

Gereç ve Yöntem: Çal›ﬂmaya 43 tedavi edilmemiﬂ psoriasis vulgaris hastas› ve 20 sa¤l›kl› kontrol birey dahil edildi.

Kat›l›m-c›lardan al›nan biyopsi örnekleri; keratinosit proliferasyonunu göstermewk amac›yla Ki-67 ekspresyonlar› için immünhisto-kimyasal boyama ile ve keratinosit apoptozisini göstermek amac›yla terminal deoksinükleotidil transferaz (TdT)-arac›l› dUTP-biotin çentik-uç etiketleme (terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP-biotin nick-end labeling, TUNEL) yöntemi ile de¤erlendirildi.

Bulgular: Apoptotik indeks (TUNEL pozitif hücrelerin yüzdesi) psoriatik epidermiste (0,33±0,64) normal epidermisten

(0,75±0,85) belirgin olarak daha düﬂük iken (p=0,021), Ki-67 indeksi (Ki-67 için pozitif boyanan hücrelerin yüzdesi) psoria-tik epidermiste (30,86±10,49) normal epidermisten (11,65±2,98) belirgin olarak daha yüksekti (p=0,00).

Sonuç: Azalm›fl keratinosit apoptozisi de artm›fl keratinosit proliferasyonu gibi psoriasisteki artm›fl epidermal kal›nl›¤a

kat-k›da bulunur. (Türkderm 2009; 43: 167-70)

Anahtar Kelimeler: Apoptozis, hücre proliferasyonu, psoriasis

Summary

Background and Design: Abnormal differentiation and hyperproliferation of keratinocytes are the hallmarks of psoriasis

vulgaris. Although psoriasis vulgaris is generally accepted as a disease of decreased keratinocyte apoptosis, the results are contradictory. The aim of the current study is to investigate whether decreased keratinocyte apoptosis contributes to the formation of a thickened epidermis as increased keratinocyte proliferation.

Material and Method: Forty-three untreated psoriasis vulgaris patients and 20 healthy control subjects were included into

the study. Biopsy specimens taken from the enrollee were evaluated by immunohistochemical staining for Ki-67 expressi-ons to show the proliferation of keratinocytes and by the terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP-biotin nick-end labeling (TUNEL) method to show the apoptotic keratinocytes.

Results: Apoptotic index (percentage of the TUNEL positive cells) was significantly lower in psoriatic epidermis (0.33±0.64)

than in normal epidermis (0.75±0.85); whereas Ki-67 index (percentage of positively staining cells for Ki-67) was significantly higher in psoriatic epidermis (30.86±10.49) than in normal epidermis (11.65±2.98), (p=0.021 and p=0.00; respectively).

Conclusion: Decreased keratinocyte apoptosis also contribute to increased epidermal thickness in psoriasis as well as

increa-sed keratinocyte proliferation. (Turkderm 2009; 43: 167-70)

Key Words: Apoptosis, cell proliferation, psoriasis

Türkderm-Deri Hastal›klar› ve Frengi Arﬂivi Dergisi, Galenos Yay›nc›l›k taraf›ndan bas›lm›ﬂt›r. Her hakk› sakl›d›r. Turkderm-Archives of the Turkish Dermatology and Venerology, published by Galenos Publishing. All rights reserved.

(2)

Giriﬂ

Psoriasis vulgaris (PV) epidermiste hiperproliferasyon ve di-ferensiyasyon bozuklu¤u ile karakterize kronik inflamatu-var bir hastal›kt›r1_.

Keratinosit apoptozisi epidermal geliﬂmenin ve homeostaz›n düzenlenmesinde kritik bir role sahiptir2_{. Spontan keratinosit}

apoptozisinde azalma ve uyar›lm›ﬂ keratinosit apoptozisine di-renç psoriasiste görülen epidermal kal›nlaﬂma için ileri sürülen mekanizmalar aras›ndad›r2_.

PV hastalar›n›n deri biyopsilerinde hücre kineti¤ini araflt›rmak amac›yla keratinosit proliferasyonu ve apoptozisinin birlikte araflt›r›ld›¤› az say›da çal›flma mevcuttur; Bu çal›flmalarda kera-tinosit proliferasyonu artm›fl olarak bulunurken, kerakera-tinosit apoptozisi ile ilgili sonuçlar birbirleriyle çeliflmektedir3-10. Çal›flmalar›n bir k›sm›nda apoptotik boyanma artm›fl3,4,9_olarak

bulunurken; bir k›sm›nda ise azalm›ﬂ5-8_{olarak bulunmuﬂtur.}

Bu çal›flmada oldukça genifl say›da ve sistemik tedavi almam›fl PV hastas›ndan elde edilen deri biyopsilerinde keratinosit pro-liferasyonu ve apoptozisi de¤erlendirilerek hücre kineti¤inde-ki de¤iflikliklerin araflt›r›lmas› amaçlanm›flt›r.

Gereç ve Yöntem

Çal›ﬂma Gruplar›

Çal›flma 23 kad›n ve 20 erkek kronik plak tip psoriasis hastas› ile herhangi bir deri hastal›¤› bulunmayan 20 bireyden elde edilen deri biyopsi örnekleriyle gerçeklefltirildi. Çal›flmaya dahil edilen hastalar daha önce hiçbir sistemik tedavi almam›fllard›. Topikal tedavi alan hastalarda da deri örne¤i al›nmadan 1 ay öncesinde bu topikal tedaviler kesildi. Dahili veya deri kanseri olan; püstüler, guttat, eritrodermik veya invers psoriasisi olan ve baflka bir nedenle sistemik veya topikal tedavi alan kifliler çal›flmaya dahil edilmedi. Çal›flma protokolünün hastane etik kurulu taraf›ndan onaylanmas›ndan sonra tüm kat›l›mc›lardan bilgilendirilmifl onam formlar› al›nd›. PV tan›s› klinik ve histo-patolojik olarak konuldu. Hastalar klinik olarak “Psoriasis Are-a Are-and Severity Index” (PASI) skoru ile de¤erlendirildi.

Deri Örneklerinin Toplanmas›

Çal›flmada klinik olarak PV tan›s› alan 43 hastan›n gövdesin-den (normal olarak günefl görmeyen bir bölge oldu¤u için ter-cih edildi) “punch” biyopsi örnekleri al›nd›. Kontrol deri biyop-sileri herhangi bir deri hastal›¤›, deri kanseri veya sistemik kan-seri bulunmayan hastalara ait deri örneklerinden olufltu. “Punch” biyopsi örnekleri formaldehitte fikse edildikten sonra parafine gömülerek iflleme al›nd›. Hematoksilen ve eozin bo-yas› ile PV tan›s› histopatolojik olarak kesinlefltirildikten sonra immünhistokimya ile Ki-67 ve terminal deoksinükleotidil trans-feraz (TdT)-arac›l› dUTP-biotin çentik-uç etiketleme (terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP-biotin nick-end labeling, TUNEL) yöntemi ile apoptozis de¤erlendirildi. Tunel Metodu

Apoptozisin tespit edilebilmesi için TUNEL yöntemi kullan›ld›. Bunun için bir ApopTag kiti (Chemicon, ApopTag®_Plus

Peroxi-dase In Situ Apoptosis Detection Kit, S7101) üreticinin önerdi¤i protokole göre uyguland›. K›saca parafin kesitler ksilol ile depa-rafinize edildi, 20μg/ml proteinaz K ile 15 dakika inkübe edildi.

Endojen peroksidaz aktivitesi %3’lük H2O2ile bloke edildi.

Den-geleyici tampon ile 10 saniye ve TdT enzim ile 370_{C’lik etüvde 1}

saat inkübe edildi. Sonra s›ras›yla anti-digoxigenin peroksidaz ve peroksidaz substrat ile iflleme devam edildi. Aralarda Fosfat tam-ponlu tuz solüsyonu (Phosphate Buffer Saline, PBS) ile y›kand›. Z›t boya olarak metil yeflili kullan›ld›. Lamel ile kapat›larak ›fl›k mikroskobunda incelendi. TUNEL için sadece koyu kahverengi nükleer boyamalar pozitif kabul edildi.

‹mmünhistokimyasal Boyama

Formalinle fikse, parafine gömülü dokulardan 4 mikrometrelik kesitler al›nd›. Ksilol ile deparafinize edildikten sonra etanol ile dehidrate edildi. Antijen geri kazan›m› için mikrodalgada sit-rat ile 20 dakika iﬂleme al›nd›ktan sonra endojen peroksidaz aktivitesini bloke etmek için %3’lük H2O2ile 10 dakika inkübe

edildi. PBS ile y›kand› ve protein blokaj sonras›nda primer an-tikor Ki-67 (Novocastra, klon MM1) ile oda s›cakl›¤›nda 1 saat inkübe edildi. Devam›nda s›ras›yla sekonder antikor, streptavi-din peroksidaz kompleksi ve renklendirmek için %0,1’lik di-aminobenzidin ile iflleme devam edildi ve her birinin aras›nda PBS ile y›kand›. Z›t boya için mayer hematoksilen kullan›ld› ve dehidratasyon ve berraklaflt›rma sonras›nda lamel ile kapat›la-rak ›fl›k mikroskobunda de¤erlendirildi. Nükleer boyanmalar pozitif kabul edildi.

Sonuçlar›n De¤erlendirilmesi

Ki-67 ve apoptozis indeksleri boyanma görülen 3 farkl› alanda da 100 hücre say›larak; toplam pozitif hücre say›s›n›n toplam hücre say›s›na (300) bölünmesi ile elde edilen ve yüzde ile ifa-de edilen ifa-de¤erlerdir.

‹statistiksel Analiz

Çal›flmada elde edilen tüm verilerin istatistiki analizinde SPSS for Windows 15 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA) program› kullan›l-d›. Sürekli de¤iflkenler ortalama±standart sapma ve kategorik de¤iflkenler yüzde ile ifade edildi. Kategorik de¤iflkenler ara-s›ndaki iliflkilerin de¤erlendirilmesinde ki-kare testi kullan›ld›. Sürekli de¤iflkenlerin normal da¤›l›m gösterip göstermedi¤i Shapiro Wilks testi ile incelendi. Normal da¤›lan de¤iflkenler için gruplar aras›ndaki farkl›l›klar t testi veya Mann Whitney U testi ile incelendi. Anlaml›l›k de¤eri 0,05 olarak kabul edildi.

Bulgular

Çal›flmaya dahil edilen hasta (ortalama yafl: 38,98±13,50, 23 (%53,48) kad›n ve 20 (%46,52) erkek) ve kontrol grubunun (ortalama yafl: 37,05±13,10, 7 (%35) kad›n ve 13 (%65) erkek) yafl (p=0,597; t testi) ve cinsiyet (p=0,273; Ki kare testi) da¤›l›m-lar› benzerdi.

Apoptotik ‹ndeks

Normal deri örneklerinde az say›da apoptotik hücreye rastla-n›rken, psoriatik deri örneklerinde çok daha az say›da apopto-tik hücre tespit edildi. Psoriaapopto-tik derideki ortalama apoptoapopto-tik indeks (0,33±0,64), normal derideki ortalama apoptotik in-deksten (0,75±0,85) istatistiki olarak anlaml› derecede düﬂüktü (0,021; Mann Whitney U testi), (Resim 1,2).

Ki-67 ‹ndeksi

Hasta grubuna ait psoriatik deri örneklerindeki ortalama Ki-67 indeksi (30,86±10,49) kontrol grubuna ait normal deri örnekle-rindeki ortalama Ki-67 indeksinden (11,65±2,98) istatistiki ola-rak anlaml› derecede yüksekti (P=0,00; t testi), (Resim 3,4).

Tatl›can ve ark.

Psoriasiste Keratinosit Apoptozisi

Türkderm 2009; 43: 167-70

168

(3)

Tart›ﬂma

Keratinositlerde anormal diferensiyasyon ile birlikte hiperpro-liferasyon, dermal ve epidermal inflamatuvar hücre infiltrasyo-nu ve dermal damarlarda geniﬂleme psoriasisin karakteristik özellikleridir1_{. Psoriasisin öncelikle bir keratinosit bozuklu¤u}

olmay›p; T lenfositler ve antijen sunucu hücreler ile keratino-sitler aras›ndaki karmafl›k iliflkiler sonucunda keratinokeratino-sitlerde anormal diferensiyasyon ve hiperproliferasyona ba¤l› olarak epidermal kal›nlaflma ile karakterize klinik görünümün ortaya ç›kt›¤› bilinmektedir1,2_.

Keratinosit apoptozisi normal epidermal kal›nl›¤› korumak için proliferasyonu dengeler2_{. Psoriasis hücre ölümü ile yaﬂam›}

ara-s›ndaki apoptotik dengenin hücre ölümü aleyhine bozuldu¤u hastal›klar aras›nda yer almaktad›r2_.

Laporte ve ark5_{. psoriatik epidermisteki germinatif tabakada}

normal epidermisteki germinatif tabakaya oranla apoptozisin belirgin derecede azald›¤›n› ve regresyondaki psoriasiste ise artt›¤›n› göstermiﬂlerdir.

Bir baflka çal›flmada da psoriatik keratinositlerin metil selüloz ile uyar›lan apoptozise karfl› direnç gösterdi¤i tespit edilmifltir9_.

Castelijns ve ark taraf›ndan6-8_{kalsipotriol,}

klobetazol-17-propi-yonat ve takalsitolün psoriatik deriye olan etkilerinin araflt›r›l-d›¤› bir dizi çal›flmada da epidermisin tüm katlar›nda çok az sa-y›da apoptotik hücre tespit edilmifltir.

Ayn› yöntem ile yap›lan biri retrospektif di¤er iki çal›flmada ise TUNEL boyanma pozitifli¤i psoriatik epidermiste artm›fl olarak bulunmufltur3,4_{. Buna ra¤men apoptotik boyanma indeksinin}

yüksek ç›kmas› apoptozisin artt›¤› yönünde de¤erlendirilme-mifl aksine TUNEL pozitifli¤inin ço¤alan hücrelerin say›s›ndaki art›fltan kaynakland›¤› yönünde yorumlanm›flt›r3,4_.

Resim 1. Kontrol olgusu, granüler tabaka içinde 2 adet apopto-tik hücre mevcut (oklar), ( TUNEL metodu, X400 büyütme)

Resim 2. Psoriasis olgusu, epidermiste apoptotik hücre yok. Dermiste 2 adet apoptotik lenfosit mevcut. Nükleusta koyu kahverengi boyanma yan› s›ra piknozis mevcut (TUNEL me-todu, X400 büyütme)

Resim 3. Kontrol olgusu, Ki-67 pozitif hücreler bazal tabaka-da mevcut (‹mmünhistokimyasal boyama, X400)

Resim 4. Psoriasis hastas›nda epidermiste bazal ve supraba-zal bölgede çok say›da Ki-67 pozitif hücre mevcut (‹mmün-histokimyasal boyama, X400)

Tatl›can ve ark. Psoriasiste Keratinosit Apoptozisi Türkderm

2009; 43: 167-70

169

(4)

Bu çal›ﬂmalar›n tamam›nda Ki-67 indeksi psoriatik deride an-laml› oranda yüksek bulunmuﬂtur3-10_{. Ki-67 monoklonal bir}

an-tikor ile tespit edilen ve hücre proliferasyonunu göstermek için kullan›lan bir nükleer proteindir11_.

Psoriasis patogenezinde keratinosit apoptozisinin rolüne iliﬂkin apoptotik dengenin bozuldu¤unu gösteren ve tedavi ile apop-toziste art›ﬂ oldu¤unu gösteren yay›nlar bulunmaktad›r12-15_.

Keratinositlerde survivin ekspresyonunda art›ﬂ12,13_{, Bcl-xL}

eks-presyonunda art›ﬂ14_{ve interlökin (IL)-15 düzeylerinde art›ﬂ}15

pso-riasiste apoptozisin azald›¤› yönündeki bulgular aras›ndad›r12-15_.

Psoriasis tedavisinde etkili oldu¤u bilinen PUVA5_{, infliksimab}13,16

ve metotreksat›n17_{antiinflamatuar etkileri yan›nda keratinosit}

apoptozisini uyararak da etki gösterdikleri ifade edilmiﬂtir 5,13,16,17_.

Bizim çal›flmam›zda psoriatik epidermiste normal deriye k›yas-la Ki-67 indeksi ank›yas-laml› derecede yüksek ve apoptotik indeks anlaml› derecede düflük bulunmufltur. Ki-67 indeksinin yüksek ve apoptotik indeksin düflük olmas› artm›fl keratinosit prolife-rasyonu kadar azalm›fl keratinosit apoptozisinin de psoriasis patogenezinde rolü oldu¤unu düflündürmektedir.

Kaynaklar

1. Ergun T: Psoriasisin etyopatogenezi. Türkderm 2008; 42 Özel Say› 2:18-22.

2. Raj D, Brash DE, Grossman D: Keratinocyte apoptosis in epidermal development and disease. J Invest Dermatol. 2006; 126: 243-57. 3. Doger FK, Dikicioglu E, Ergin F et al: Nature of cell kinetics in

pso-riatic epidermis. J Cutan Pathol 2007;34:257-63.

4. Kawashima K, Do H, Ito Y et al: Evaluation of cell death and proli-feration in psoriatic epidermis. J Dermatol Sci 2004;35:207-14. 5. Laporte M, Galand P, Fokan D et al: Apoptosis in established and

healing psoriasis. Dermatology 2000;200:314-6.

6. Castelijns FA, Gerritsen MJ, van Erp PE et al: Efficacy of calcipotri-ol ointment applied under hydroccalcipotri-olloid occlusion in psoriasis. Der-matology 2000;200:25-30.

7. Castelijns FA, Gerritsen MJ, van Vlijmen-Willems IM et al: The epidermal phenotype during initiation of the psoriatic lesion in the symptomless margin of relapsing psoriasis. J Am Acad Derma-tol 1999 40:901-9.

8. Castelijns FA, Gerritsen MJ, van Vlijmen-Willems IM et al: Prolifera-tion is the main epidermal target in the treatment of psoriatic pla-ques with once daily application of tacalcitol ointment. Acta Derm Venereol 1999;79:111-4.

9. Wrone-Smith T, Mitra RS, Thompson CB et al: Keratinocytes deri-ved from psoriatic plaques are resistant to apoptosis compared with normal skin. Am J Pathol 1997;151:1321-9.

10. Krueger JG, Wolfe JT, Nabeya RT et al: Successful ultraviolet B tre-atment of psoriasis is accompanied by a reversal of keratinocyte pathology and by selective depletion of intraepidermal T cells. J Exp Med 1995;182:2057-68.

11. Schlüter C, Duchrow M, Wohlenberg C et al: The cell proliferation-associated antigen of antibody Ki-67: a very large, ubiquitous nuc-lear protein with numerous repeated elements, representing a new kind of cell cycle-maintaining proteins. J Cell Biol 1993;123:513-22.

12. Abdou AG, Hanout HM. Evaluation of survivin and NF-kappaB in psoriasis, an immunohistochemical study. J Cutan Pathol 2008; 35:445-51.

13. Markham T, Mathews C, Rogers S et al. Downregulation of the inhibitor of apoptosis protein survivin in keratinocytes and endothelial cells in psoriasis skin following infliximab therapy. Br J Dermatol 2006;155:1191-6.

14. Fukuya Y, Higaki M, Higaki Y et al. Effect of vitamin D3 on the increased expression of Bcl-xL in psoriasis. Arch Dermatol Res 2002;293:620-5.

15. Rückert R, Asadullah K, Seifert M et al. Inhibition of keratinocyte apoptosis by IL-15: a new parameter in the pathogenesis of psoria-sis? J Immunol 2000;165:2240-50.

16. Krüger-Krasagakis S, Galanopoulos VK, Giannikaki L et al. Prog-rammed cell death of keratinocytes in infliximab-treated plaque-type psoriasis. Br J Dermatol 2006;154:460-6.