T.C.
ERCİYES ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ
BİYOLOJİ ANABİLİM DALI
ECHINOPS ORIENTALIS TRAUTV. BİTKİSİNİN KÖKÜNDEN ELDE EDİLEN EKSTRAKTLARIN ANTİMİKROBİYAL VE ANTİKANSEROJEN ETKİSİNİN
İNCELENMESİ
Hazırlayan Dilek DABANLI
Danışman
Yüksek Lisans Tezi
Aralık 2011 KAYSERİ
Yrd. Doç. Dr. Servet ÖZCAN
Öğr. Gör. Dr. Gökçen DİNÇ
T.C.
ERCİYES ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ
BİYOLOJİ ANABİLİM DALI
ECHINOPS ORIENTALIS TRAUTV. BİTKİSİNİN KÖKÜNDEN ELDE EDİLEN EKSTRAKTLARIN ANTİMİKROBİYAL VE
ANTİKANSEROJEN ETKİSİNİN İNCELENMESİ (Yüksek Lisans Tezi)
Hazırlayan Dilek DABANLI
Danışman
Yrd. Doç. Dr. Servet ÖZCAN Öğr. Gör. Dr. Gökçen DİNÇ
Bu çalışma; Erciyes Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Birimi tarafından FBY-11-3486 kodlu proje ile desteklenmiştir.
Aralık 2011
KAYSERİ
TEŞEKKÜR
Çalışmalarım boyunca bilimsel duruşuyla beni aydınlatan, zamanını, ilgi ve yardımlarını esirgemeyen değerli hocam sayın Yrd. Doç. Dr. Servet ÖZCAN’ a teşekkürü bir borç bilirim.
Çalışmamın ortaya çıkması sırasında ve sonraki aşamalarda göstermiş olduğu yardım ve yönlendirmelerden dolayı sayın hocam Öğr. Gör. Dr. Gökçen DİNÇ’ e sonsuz teşekkür ederim. Beni laboratuvarlarında misafir edip, çalışmalarıma verdikleri destek için GATA ekibi sayın Prof. Dr. Ali Uğur URAL, Doç. Dr. Ferit AVCU, Uzman Biyolog M.
Pınar ELÇİ ve Uzman Biyolog Meral SARPER’ e çok teşekkür ederim. İhtiyaç duyduğum her an yardımlarını benden esirgemeyen sayın hocam Prof. Dr. Coşkun TEZ, Doç. Dr. Cem Vural, Yrd. Doç Dr Ebru SAATÇİ ve Güler TOPRAK’ a teşekkürlerimi sunarım.
Çalışmalarım sırasında beni yalnız bırakmayıp, yardımlarını esirgemeyen çalışma arkadaşlarım Dilek CEYLAN, Tuğba DİŞYAPAR, Ebru KARADAŞ, Fatih Serdar ŞAHİN, Sevgi BAKIR, Murat TELCİOĞLU, Metin KILIÇ, Handan ŞAPÇI, Ömer ERGİN ve Osman İBİŞ’ e çok teşekkür ederim.
En derinden teşekkürlerim beni hiç yalnız bırakmayan, en vazgeçtiğim zamanlarda bile her şeyi anlamlı kılan ailem Seher DABANLI, Torun DABANLI, Ahmet ÇETİNOK, Müşerref ÇETİNOK, Nevzat ÇETİNOK, Şengül ÖZPİŞKİN KEBAPÇI ve Mehmet Ali BAHAR’ a.
Bu tez çalışmasına maddi destek veren Erciyes Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Birimi’ne (Proje No: FBY-11-3486) teşekkür ederim.
Dilek DABANLI Kayseri, Aralık 2011
ECHINOPS ORIENTALIS TRAUTV. BİTKİSİNİN KÖKÜNDEN ELDE EDİLEN EKSTRAKTLARIN ANTİMİKROBİYAL VE ANTİKANSEROJEN
ETKİSİNİN İNCELENMESİ Dilek DABANLI
Erciyes Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü Yüksek Lisans Tezi, Aralık 2011 Danışman: Yrd. Doç. Dr. Servet ÖZCAN
Öğr. Gör. Dr. Gökçen DİNÇ
KISA ÖZET
Bu çalışmada Echinops orientalis Trautv. türüne ait örneklerin kök kısımlarının metanol, kloroform ve hekzan ekstraktlarının antimikrobiyal ve antikanserojenik özellikleri araştırılmıştır. Metanol, kloroform ve hekzan ekstaraktları 14 standart bakteri ve bir fungus türü ile, üç hücre hattı üzerinde uygulanmıştır. Antimikrobiyal etki disk difüzyon ve MİK deneyleri yapılarak, antikanserojenik aktivite ise MTT yöntemi uygulanarak araştırılmıştır. Sonuçlar ekstraktların antimikrobiyal özelliği bulunmadığını; hücre tipi, zaman ve konsantrasyona bağlı olarak da sitotoksik etkisi olduğunu göstermiştir. Kloroform ve hekzan ekstraktlarının hücreler üzerinde metanol ekstraktından daha etkili olduğu görülmüştür. Elde edilen sonuçlar E. orientalis’ in kanser tedavisinde kemoterapötik bir bitki olarak dikkate alınması gerektiğini göstermiştir.
Anahtar Kelimeler: Echinops orientalis, Antimikrobiyal, Antikanserojen, Hücre Kültürü, MTT
SCREENING OF ANTIMICROBIAL AND ANTICARSINOJENIC EFFECTS OF ECHINOPS ORIENTALIS ROOT EXTRACTS
Dilek DABANLI
Erciyes University, Graduate School of Natural and Applied Sciences M.Sc. Thesis, December 2011
Supervisor: Asist. Prof. Servet ÖZCAN
University Lecturer Dr. Gökçen DİNÇ
ABSTRACT
The aim of this study was to investigate antimicrobial and anticarcinogenic effects of Echinops orientalis root extract. Methanolic, chloroformic and hexanoic extracts Echinops orientalis was evaluated on 14 bacteria and one fungi and in vitro on two human cell lines (MCF-7, PC3 and fibroblast cells as control group). Antimicrobial effects of extracts were determined by disc-difusion and MIC and anticarcinogenic effects of the extracts were determined by MTT assay. Results showed that there were not antimicrobiological effect of the extracts Depending on cell type and concentration used extracts had different effect. Chloroformic and hexanoic extracts had more strong effect than methanolic extract effect. Echinops orientalis could be considered as a chemotherapeutic plant in cancer treatment in future.
Keywords: Echinops orientalis, Antimicrobial, Anticarcinogenic, Cell Culture, MTT
İÇİNDEKİLER
ECHINOPS ORIENTALIS TRAUTV. BİTKİSİNİN KÖKÜNDEN ELDE EDİLEN EKSTRAKTLARIN ANTİMİKROBİYAL VE ANTİKANSEROJEN ETKİSİNİN
İNCELENMESİ
Sayfa
BİLİMSEL ETİĞE UYGUNLUK SAYFASI ... ii
YÖNERGEYE UYGUNLUK SAYFASI ... iii
KABUL VE ONAY SAYFASI ... iv
ÖNSÖZ ... v
ÖZET... vi
ABSTRACT ... vii
İÇİNDEKİLER ... viii
KISALTMALAR LİSTESİ ... xi
SEMBOLLER LİSTESİ ... xii
TABLOLAR LİSTESİ ... xiv
ŞEKİLLER LİSTESİ ... xv
GİRİŞ ... 1
1. BÖLÜM GENEL BİLGİLER 1.1. Tıbbi Bitkiler ve Kullanım Alanları……….…..3
2.1. Antimikrobiyal Aktivite………...4
2.2. Kullanılan Suşlar ve Özellikleri……….4
3. Hücre Kültürü………....6
3.1. Tarihçe……….…7
3.2. Kültür Hücrelerinin Biyolojisi ………...8
3.4. Hücre Döngüsü………....9
3.5. Laboratuvar Düzeni ve Ekipmanları………..10
3.6. Hücre Kültür Mediumları………....11
3.6.1.Fizikokimyasal Özellikleri………...11
3.6.2. PBS (Fosfatla Tamponlanmış Tuz Solüsyonu)………....12
3.6.3. Medium ve İçerikleri ……….…12
3.7. Hücre Kültür Modelleri………..….14
3.8. Sitotoksisite……….……...15
3.8.1. MTT Testi………....15
3.9. Deneylerde Kullanılan Hücre Hatlarının Genel Özellikleri……….…....16
4. Echinops orientalis Bitkisinin Sınıflandırılması………....17
4.1. Asteraceae Familyasının Genel Özellikleri……….…...17
4.2. Echinops Cinsinin Genel Özellikleri……….17
4.3.Echinops orientalis’ in Genel Özellikleri………...18
4.4. Echinops Cinsine Ait Çalışmalar ve Kullanımı……….….19
2. BÖLÜM GEREÇ VE YÖNTEM 2.1. Bitkisel Materyal……….22
2.2. Bitkilerin Toplanması………...22
2.3. Bitki Ekstraktlarının Hazırlanması……….22
2.4. Antimikrobiyal Testlerde Kullanılan Mikroorganizmalar…………...23
2.5. Antimikrobiyal Aktivite Testleri………..24
2.5.1. Disk Difüzyon Metodu……….24
2.5.2. Mikrodilusyon Metodu………26
2.6. Hücre Kültürü……….26
2.6.1 Hücrelerin Temini……….26
2.6.2. Hücrelerin Büyütüleceği Mediumun Hazırlanması…………..27
2.6.3. Hücrelerin Kültür Basamakları……….……27
2.6.4. Hücrelerin Sayımı………27
2.6.5. Hücrelerin ELISA Pleytlerindeki Optimizasyonu…………....28 2.6.6. Hücreler Üzerindeki Etkisi İncelenecek
Ekstraktların Optimizasyonu…………..………..…...28
2.6.7. MTT Test Metodu………...….29
3. BÖLÜM BULGULAR 3.1. Ekstraksiyon Verimi………..…..30
3.2. Bitki Ekstraktlarının Antimikrobiyal Aktiviteleri ………...30
3.3. Mikrodilüsyon Sonuçları……….30
3.4. Bitki Ekstraktlarının Kültür Hücreleri Üzerine Etkileri………35
3.4.1. Bitki Ekstraktlarının MCF-7 Hücre Hattı Üzerine Etkisi…....35
3.4.2. Bitki Ekstraktlarının PC-3 Hücre Hattı Üzerine Etkisi …...37
3.4.3. Bitki Ekstraktlarının Fibroblast Hücreleri Üzerine Etkisi...40
4. BÖLÜM TARTIŞMA-SONUÇ ve ÖNERİLER 4.1. Ekstraksiyon Verimi………44
4.2. Antimikrobiyal Aktivite………..45
4.3. Kültür Hücreleri Üzerine Etkisi……….46
KAYNAKLAR………..………49
ÖZGEÇMİŞ………..55
KISALTMA LİSTESİ
WHO World Health Organization
CAMs Kalsiyuma bağlı olmayan adezyon mokelülleri HEPES N-2-hidroksi etilpiperazin N-2 etansulfonik asit PBS Fosfatla Tamponlanmış Tuz Solüsyonu
MTT 3-(4,5-dimetiltriazol-2-il)-2,5- difeniltetrazolium bromid MİK Minimum İnhibitör Konsantrasyonu
ATCC American Type Culture Collection TSA Triptik Soy Agar
YPDA Yeast Pepton Dekstroz Agar TSB Triptik Soy Broth
YPDB Yeast Pepton Dekstroz Broth CFU Colony forming unit
MHA Müller hinton Agar DMSO Dimetil Sülfoksit
DMEM Dulbecco’s Modify Eagle Medium FBS Fetal Bovine Serum
NYS Nistatin MYC Mikanozol
SİMGE LİSTESİ
µl Mikrolitre mm Milimetre µg Mikrogram mg Miligram ml Mililitre gr Gram
ºC Santigrat derece atm Atmosfer
TABLOLAR LİSTESİ
Tablo 2.1. Kullanılan organizmalar ve kültür koleksiyon merkezi (ATCC) kodları.23
Tablo 2.2. Mikroorganizmalar ve seyreltme katsayıları………25
Tablo 3.1. Ekstraktların verimlilik sonuçları……….30
Tablo 3.2. Standart antibiyotiklerin oluşturduğu zonlar………...31
Tablo 3.3. Ampisilin MİK sonuçları………...32
Tablo 3.4. Tetrasiklin MİK sonuçları……….33
Tablo 3.5. Trimetoprim MİK sonuçları………..…34
Tablo 3.6. Nistatin ve mikanazol MİK sonuçları………...34
Tablo 3.7. Ekstraktların MCF-7 hücreleri üzerindeki etkisi………...36
Tablo 3.8. Ekstraktların PC-3 hücreleri üzerine etkisi……….….38
Tablo 3.9. Ekstraktların Fibroblast hücreleri üzerine etkisi………...…..40
ŞEKİLLER LİSTESİ
Şekil 1.1. Hücre kültürü uygulamaları………7
Şekil 1.2. Hücre adezyonu………..8
Şekil 1.3. Hücre döngüsünün ana safhaları……….…...9
Şekil. 1.4 MTT’ nin formazan kristallerine dönüşmesi………....16
Şekil 1.5. Echinops orientalis………..…….18
Şekil 2.1. Soksolet cihazı……….…….23
Şekil 3.1. MCF-7 hücreleri 24 saat sonraki mikroskobik görüntüsü a. MTT uygulamasından önce, b. MTT sonrası formazan kristalleri (x20)……...36
Şekil 3.2. 1000 µg/ml’ lik metanol ekstraktı uygulanan MCF-7 hücrelerinin 24 saat sonraki mikroskobik görüntüsü a. MTT uygulamasından önce, b. MTT sonrası formazan kristalleri (x20)………...37
Şekil 3.3. 600 µg/ml’ lik kloroform ekstraktı uygulanan MCF-7 hücrelerinin 24 saat sonraki mikroskobik görüntüsü a. MTT uygulamasından önce, b. MTT sonrası formazan kristalleri (x20)………...37
Şekil 3.4. MCF-7 hücrelerinin Tukey testi sonuçları………37
Şekil 3.5. PC-3 hücrelerinin 24 saat sonraki mikroskobik görüntüsü a. MTT uygulamasından önce, b. MTT sonrası formazan kristalleri (x20)……….…39
Şekil 3.6. 900 µg/ml’ lik metanol ekstraktı uygulanan PC-3hücrelerinin 24 saat sonraki mikroskobik görüntüsü a. MTT uygulamasından önce, b. MTT sonrası formazan kristalleri (x20)………....40
Şekil 3.7. 300 µg/ml’ lik kloroform ekstraktı uygulanan PC-3 hücrelerinin 24
saat sonraki mikroskobik görüntüsü a. MTT uygulamasından önce, b. MTT sonrası formazan kristalleri (x20)………..….40
Şekil 3.8. PC-3 hücrelerinin Tukey testi sonuçları………..…………40 Şekil 3.9. Fibroblast hücrelerinin 24 saat sonraki mikroskobik görüntüsü a.
MTT uygulamasından önce, b. MTT sonrası formazan kristalleri (x20)……....42 Şekil 3.10. 800 µg/ml’ lik metanol ekstraktı uygulanan fibroblast hücrelerinin
24 saat sonraki mikroskobik görüntüsü a. MTT uygulamasından önce, b. MTT sonrası formazan kristalleri (x20)………....42 Şekil 3.11. 700 µg/ml’ lik kloroform ekstraktı uygulanan fibroblast hücrelerinin
24 saat sonraki mikroskobik görüntüsü a. MTT uygulamasından önce, b. MTT
sonrası formazan kristalleri (x20)………..……..43 Şekil 3.12. Fibroblast hücrelerinin Tukey testi sonuçları………...43
GİRİŞ
Enfeksiyon ve kanser hastalıkları Dünya’da birçok insanın hayatını etkileyen sağlık sorunlarıdır. Dünya Sağlık Örgütü’nün raporlarına göre, yalnızca kanserden Amerika’
da 2010 yılında 550.000 civarında kişi hayatını kaybetmiştir [1].
Dünya Sağlık Örgütü’ nün raporlarına göre kanser kaynaklı ölümlerde ilk sırada akciğer kanseri yer almaktadır. Kadınlarda meme kanseri, erkeklerde ise prostat kanseri ikinci sırayla en çok ölüme neden olan kanser çeşitleridir [1]. Enfeksiyon hastalıklarında ise adından en çok bahsettiren hastalıklar AIDS, grip ve hastane enfeksiyonlarıdır.
Türkiye’ de ise dünyadakine benzer bir şekilde, kanser ve enfeksiyona bağlı hastalıklardan kaynaklanan ölüm oranı, hastalıkların çeşitlenmesi ve tedavi edilememesi sebebiyle gün geçtikçe artmaktadır. Türkiye’ de 0-6 yaş arası çocuklarda en yaygın hastalık solunum yolu enfeksiyonları iken [2]; akciğer ve bronş kanserleri en çok görülen kanser hastalıklarıdır [3].
Mikroorganizmalar, gün geçtikçe antibiyotiklere karşı daha dirençli hale gelmektedir.
Benzer şekilde kanser hücrelerinin kanser ilaçlarına karşı geliştirdiği direnç de artmaktadır. Kansere karşı, geliştirilen ilaçların toksik etki göstermesiyle de daha çok insanın hayatı tehdit altına girmektedir. Bu durum, hastalıkların tedavisi için yeni yöntemler geliştirmeyi gerekli kılmaktadır. Yeni tedavi yöntemlerinin aranmasıyla aktif bir araştırma alanı doğmuş olup bu çalışmalarda tıbbi bitkilerden yaygın bir şekilde yararlanıldığı görülmektedir [4-6].
Hastalıkların çeşitlenmesi, tedavi için doğada var olan potansiyelin kullanılması gerekliliği gibi nedenler, araştırmacıları kansere karşı bitkilerden yararlanma yoluna yöneltmiştir. Diğer yandan tıbbi bitkilerin yüzyıllardır çeşitli hastalıkların tedavisinde
geleneksel olarak kullanıldığı bilinmekte birlikte özelikle tıbbi bitkilerin kullanımı, Afrika, Asya ve Çin’de çok fazla rağbet gören bir tedavi yöntemidir.
Tıbbi bitkilerin ekstraktlarının enfeksiyon ve kanser hastalıklarına olan etkilerini araştırmak amacıyla pek çok çalışma yapılmıştır [7-9].
Tıbbi bitkilerin içeriğinde bulunan birçok bileşik, in vivo ve in vitro çalışmalarda kullanılmıştır. Bu çalışmalardan en yaygın olanları canlılık, antimikrobiyal aktivite ve sitotoksisite testleridir.
Ülkemizin bitkisel zenginliği üç fitocoğrafik bölgenin kesiştiği bölgede bulunması, Güney Avrupa ile Güneybatı Asya floraları arasında köprü olması ve pek çok cins ve seksiyonun orjin ve farklılaşım merkezlerinin Anadolu oluşu, ekoloji ve fitocoğrafik farklılaşma ile ilgili olarak tür endemizminin yüksek oluşunu açıklamaktadır [10].
Bu çalışmada Türkiye’de geniş bir yayılış alanı olan Echinops orientalis bitkisinden elde edilen methanol, kloroform ve hekzan ekstraktlarının antimikrobiyal aktiviteleri test edilmesi ve antikanserojen etkilerinin araştırılması amaçlanmıştır.
1. BÖLÜM
Genel Bilgiler
1. 1. Tıbbi Bitkiler ve Kullanım Alanları
Bitkiler, antik çağlardan itibaren tıbbın kullanım alanındadır. Dünya’da 250.000 ile 500.000 bitki türü bulunduğu tahmin edilmektedir. Bunlardan %10’ u insanlar ve hayvanlar için besin kaynağını oluştururken bir kısım bitki tıbbi amaçlar için kullanılmaktadır [11,12]. Hipokrat M.Ö. 50. yüzyılın sonlarında, 300 - 400 kadar tıbbi bitki olduğunu söylemiştir. İsveçli botanikçi hekim Carolus Linnaeus (1707-1778) ise ilk kez binnomial sınıflandırma ile bitkileri sınıflandırmış ve Species Platarum ve Systema Naturae çalışmalarıyla tıbbi bitkilerin kulanımının gelişimine katkıda bulunmuştur. Kutsal kitaplarda da şifalı bitkilerden bahsedilmesi insanların tıbbi bitkilere olan ilgisini arttırmıştır. Bu nedenle Orta Çağ boyunca Arap dünyası bu konuda çalışmalar yapmıştır. Günümüzde ise Asya’ dan Afrika’ ya kadar her kıtada bu konuyla ilgili birçok bilimsel araştırma yapılmıştır. Örneğin Çin, tıbbi bitkilerin kullanımıyla ilgili yaptığı çalışmalarla adını sıkça duyuran ülkeler arasındadır [12].
Tıbbi bitkilerin bu kadar yaygın olarak kullanılmasının nedeni olarak yeterli kimya endüstrisine sahip olmayan ülkelerde bitkilerden yararlanmanın daha ucuz ve kolay olması [13], sentetik bileşiklere göre daha ucuz olması, birden çok olumlu etkilerinin olması, yan etkilerinin sentetik bileşiklere oranla daha az olması ve kültürel inanışlar sayılabilir [14-16].
Tıp alanında bitkilere yönelinmesi AIDS ya da kanser gibi tedavisi pek de mümkün olmayan çeşitli hastalıkların mağdurlarına bir umut kaynağı olmaktadır [17, 18]. Bu amaçla da birçok çalışma yapılmış ve bitkiler ilaçlar için hammadde olarak
kullanılmıştır. Bu çalışmalara bağlı olarak Amerika’ da Eczacılar Birliği tarafından üretilen bütün yeni bileşiklerin %25’ nin bitkilerden elde edildiği kaydedilmiştir [13].
Yurdumuzda 9000’ e yakın farklı doğal bitki türü bulunmaktadır [19]. Bütün dünya ile birlikte ülkemizde de bitkilerden elde dilen birçok sayıda baharat ve çay tedavi amaçlı olarak yıllardır kullanılmaktadır [20].
2.1. Antimikrobiyal Aktivite
Bitkilerin tedavi amaçlı kullanılmasıyla birlikte etnobotanik gelişmiştir. Bitkilerin mikroorganizmaları öldürücü etkileri başta olmak üzere insan sağlığı için önemli olan özellikleri uzun yıllardır araştırılmaktadır (21, 22). Tedavi amaçlı kullanılan bitkilerin sayısı Dünya Sağlık Örgütü’nün (WHO) araştırmalarına göre 20.000 civarındadır (23).
Doğadaki bazı bitki ekstraktlarının ve uçucu yağların bakterilere olduğu kadar, mantarlara karşı da antimikrobiyal aktivite gösterdiği yapılan çalışmalarda tespit edilmiştir.
Antimikrobiyal bileşiklerin, mikroorganizmalar üzerindeki etkileri, etki derecelerine göre iki grupta incelenir:
1. Bakteriyostatikler: Bakterilerin gelişmesini ve üremesini engellerler, bakterileri doğrudan öldürmezler.
2. Bakteriyositler: Bakterileri direk yok ederler [24].
Antimikrobiyal aktivite testleri mikrobiyal üremeleri inhibe eden maddelerin test edilmesini amaçlayan testlerdir.
2.2. Kullanılan Suşlar ve Özellikleri
1. Staphylococcus aureus: Besin zehirlenmelerine yol açan bir bakteri olarak bilinir.
Gram pozitif, kok şeklinde, tekli, üçlü veya dörtlü zincirler şeklinde ya da üzüm benzeri bir yapıdadır. Hareketsizdir, spor oluşturmaz ve genellikle kapsülsüzdür veya sınırlı bir kapsül yapısına sahiptir. Fakültatif anaeroptur. Optimum üreme 37 °C’ de gözlenir [25].
2. Staphylococcus epidermidis: İnsan derisinde yaygın olarak bulunur. Son yıllarda yapılan çalışmalarda nosokomiyal enfeksiyon nedeni olarak sıkça adından söz ettirir.
Gram pozitif, kok şeklinde bakteridir. Anaerobik gelişim gösterir [25].
3. Escherichia coli: Orijinal adı Bacterium coli olan E. coli’ nin habitatı, insan ve hayvan gastrointestinal sistemidir. E. coli Gram negatif, anaerop, 0,5 - 3,0 µ m uzunlukta çomak şeklinde bir bakteridir [25].
4. Klebsiella pneumoniae: Kapsüllü, hareketsiz çomak şeklinde bakteridir. 30-35 °C’
de optimumüreme gösterir. Gram negatiftir. Memelilerde geniş bir yelpazede yayılış gösterir. Nosokomiyal patojenler arasında önemli bir yeri vardır. Başta hastanelerde yatan hastalarda olmak üzere solunum yolu enfeksiyonlarına yol açar [25].
5. Bacillus cereus: Besin zehirlenmesine neden olur. Düz, veya çok az kıvrılmış, 3-12 µm uzunluğundadır. Gram pozitif, endospor oluşturan, anaerop bir bakteridir. 30-40 °C’
de gelişim gösterir [25].
6. Bacillus subtilis: Gram pozitif, kolonileri düz, mat ve geniş bir yayılış gösterir. Oval endospor oluşturur. Besin zehirlenmelerine, göz ve dokularda enfeksiyona yol açar [25].
7. Listeria monocytogenes: İnsan patojenidir. Gram pozitif çomak şeklinde bir yapılanma gösterir. Düşük sıcaklık ve yüksek tuz oranı gibi uç noktalara karşı dirençlidir, değişen çevre koşullarına karşı çok iyi bir adaptasyon yeteneğine sahiptir.
Gastroenteritis, menenjitis, ensefalitis gibi enfeksiyonlara neden olur. Küçük, Gram pozitif, sporsuz, kapsülsüz bir bakteridir. 20 °C’ de hareketli, 37 °C’ de hareketsizdir [25].
8. Corynebacterium renale: Genel olarak toprak ve hayvanlarda bulunur. İnsan ve hayvanlarda patojen olan bu bakteri deride ve mukoz membranlarda görülür. Gram pozitif ve çomak yapıdadır. Anaerob veya aeroptur [25].
9. Proteus mirabilis: İnsan, kuş ve sürüngenlerin bağırsak sisteminde görülen bir bakteri türüdür. İnsanlarda özellikle üriner sistemde de rastlanır. Optimum üreme
sıcaklığı 37 °C’ dir. Gram negatif, çomak yapıdadır. Çok sayıda ve uzun kirpiklerle hareketlilik kazanır [25].
10. Micrococcus luteus: Gram pozitif, küre şeklinde, hareketsiz ve spor oluşturmayan bir bakteridir. Genellikle memeli deri yüzeyinde bulunur. Aerobiktir. İnsanlarda özellikle üriner sistemde görülür [25].
11. 12. Pseudomonas aeruginosa ve P. fluorescens: Gram negatif, çomak şeklinde bakterilerdir. 42 °C’ ye kadar yaşayabilirler. Koloni morfolojisi, hareketlilik ve pigmentasyon değişiklik gösterir. Genel olarak su ve toprakta yaşarlar, bitkilerde patojendirler. İdrar yolları, solunum sistemi ve gastrointestinal sistemde enfeksiyonlara yol açar [25].
13. Enterococcus faecalis: İnsanlarda bağırsak enfeksiyonuna neden olan, nosokomiyal bir bakteridir. Gram pozitif, fakültatif anaerobik ve küre şeklinde bir bakteridir.
İnsanlarda genellikle üriner sistem enfeksiyonlarına neden olur [25].
14. Enterobacter aerogenes: Hareketli, Gram negatif, fakültatif anaerob bir bakteridir.
Yanıkları, solunum yollarını ve idrar yollarını enfekte eder [25].
15. Candida albicans: Ökaryotiktir. Saprofit veya parazit özellik gösterir. Deri, ağız, vajina ve bağırsakların normal florasında bulunur. Aynı ortamdaki flora, antibiyotik kullanımı ile uzaklaştırıldığında maya üremesine olanak sağlanır ve enfeksiyon meydana gelir [26].
3. Hücre Kültürü
“Hücre kültürü” terimi, orijinal bir dokudan, primer kültürden, hücre hattından enzimatik, mekanik veya kimyasal ayırma yöntemleri ile hücrelerin elde edilerek kültürünün yapılması anlamında kullanılır [27].
Hücre kültürlerinde, kültüre edilen hücreler elde edildikleri dokuların genel özelliklerini ve normal fonksiyonlarını gösterir. Bu nedenledir ki dokunun in vivo bütünlüğü ve
özellikleri hücre kültürlerinde in vitro olarak da gözlenebilir. Böylelikle gerek çeşitli hastalıkların tedavisine yönelik araştırmalar, gerekse ilaç etkinlik deneyleri gibi deneysel çalışmalar hücre kültürünün önemini ortaya koyar [28]. Hücre kültürü üzerinde yapılabilecek çalışmalar Şekil 1.1’ deki gibi özetlenebilir.
Şekil 1. 1. Hücre kültürü uygulamaları [27]
3. 1. Tarihçe
Hücre kültürü deneyleri bugün bütün dünyada yaygın bir şekilde yapılmaktadır.
Hücrenin vücut dışında büyüyebilmesini gerektiren tekniklerin gelişmesi 20. yüzyılda ortaya çıkmıştır. İlk hücre kültürü çalışması Wilhelm Roux tarafından 1885’ te gerçekleştirmiştir. Bu çalışmada tavuk embriyoları tuzlu suda bekletilmiş ve birkaç gün boyunca canlılıklarını koruyabildiği gözlenmiştir. Daha sonra Loeb tarafından 1897 yılında yapılan bir çalışma ile kan yapan hücreler ve bağlayıcı dokular uzun süre yaşatılmıştır [29]. 1898 yılında ise Ljunggren, bir asit sıvısı içinde insanlara ait deri parçalarını haftalarca canlı olarak muhafaza edebilmiştir [30-32, 28]. Bu çalışmalardan sonra ise 1907 yılındaki başarısıyla adını “doku kültürünün babası” olarak kabul ettiren Ross Harrison’ un çalışması gelmektedir. Ross Harrison, muhtemelen soğukkanlı bir hayvan olup inkübasyon gerektirmediğinden seçtiği, kurbağa embriyosundan aldığı doku parçalarını kültüre etmiş ve sadece doku parçalarını değil sinir fibrillerini de
yaşatmayı başarmıştır. Bu çalışmalardan sonra ise hücre kültürü çalışmalarını bugünkü haline getiren pek çok araştırma yapılmıştır [27].
3.2. Kültür Hücrelerinin Biyolojisi
Kültür hücrelerinin yaşadıkları mikroçevre kendi içinde her zaman değişkenlik gösterir.
Hücre-hücre ve hücre–matriks etkileşimleri, in vivo ortamdaki üç-boyutlu yapılarına göre hormonlar ve besin uyarıcıları yüzünden değişkenlik gösterir (indirgenir).
Ortamdaki bu değişiklik ise hücrelerin yayılmasını, göç etmelerini ve çoğalmalarını etkiler. Hücrelerin ortama tutunması, hücreler arası ilişki, mediumun fizikokimyası, gaz fazın yapısı ve inkübasyon sıcaklığı hücre ortamlarının en önemli özelliklerini oluşturur.
Bir yüzeye tutunarak çoğalan hücrelerin, çoğalabilmesi için dokudan ayrıldıktan veya ikinci kültürlerinin (subkültür) yapılmasından sonra bir yüzeye tutunması ve yayılması gereklidir. Hücreler polistirol (polystyrene) gibi plastik bir yüzeye veya güçlü bir asitle ve yüksek enerjili iyon radyasyonuyla işlenmiş bir plastik yüzeye ya da yine işlenmiş bir cam yüzeye tutunabilirler [27]. Hücrelerin adezyonu Şekil 1. 2.’ de gösterilmiştir.
Şekil 1.2. Hücre adezyonu [27]
Yüzey dışında hücrelerin tutunmasını etkileyen bir diğer faktör ise hücre adezyon molekülleridir. Hücre-hücre ve hücre-yüzey adezyonunda dört büyük transmembran proteininin rol oynadığı belirlenmiştir. Bu moleküller şu şekilde sıralanabilir:
1. Ca2+ bağlı kaderinler
2. Ca2+ bağlı olmayan hücre-hücre adezyon molekülleri (CAMs)
3. Fibronektin, entaktin, laminin ve kollajen gibi moleküllerle etkileşime giren integrinler
4. Transmembran proteoglikanları 5. Klaudinler ve okludenler [27]
3.4. Hücre Döngüsü
Yeni bir hücre oluşturmak için var olan tek yol halihazırda var olan hücrenin dublike olmasıdır. Bu temel olay 19. yüzyılın ortalarında ilk kez ortaya çıkmıştır. Hücre döngüsü bakterilerden memelilere kadar tüm canlılarda esastır. Hücrede var olan genetik materyalin ve hücre içeriğinin iki katına ulaşıp ikiye ayrılması olayına hücre döngüsü denir. Hücre döngüsü bütün canlıların yeniden üremesi için zorunludur. Hücre döngüsünün kontrol sistemi genelde protein kinaz ailesinin üyelerinden olan siklin-bağlı kinazlar (Cdks). tarafından kontrol edilir [32]. Hücre döngüsünün fazları Şekil 1.3.’ te verilmiştir.
Şekil 1.3. Hücre döngüsünün ana safhaları [33]
a) G0: Dinlenme fazıdır. Hücreler işlevi görmek üzere programlanırlar.
b) G1 (interfaz): Hücre fonksiyonları için gereken proteinler ve RNA sentezlenir.
Ayrıca, DNA sentezi için gereken enzimler üretilir.
c) S: Hücredeki DNA ve proteinlerin sayısı ikiye katlanır.
d) G2 fazı: Mitoz başlar ve kardeş kromatidler ayrılana dek bu süreç devam eder. Mitoz genel olarak profaz, prometafaz, metafaz, anafaz ve telofaz olmak üzere beş basamakta gerçekleşir.
e) M (mitoz): En kısa süren safhadır. Genetik materyal oluşan iki yeni hücreye dağılır.
Protein ve RNA sentez hızı aniden yavaşlar. Mitozu takiben oluşan yeni hücreler ya G0 ya da G1 fazına girerler [34].
Çoğalma kapasitesine sahip hücreler normal olarak belirli kontrol noktalarında dururlar.
İlk kontrol noktası G1 fazında gerçekleşir. Eğer G1 fazından önce bir anormallik saptanırsa, hasar onarılır veya apoptoza giderek öldürülür. İkinci kontrol ise hücreler M (mitozis) fazına girmeden önce yapılır. Sonuç olarak hücre, döngü boyunca ilerlerken iki noktada kontrol edilmiş olur [35-37].
3.5. Laboratuvar Düzeni ve Ekipmanları
Hücre kültürlerinin yapıldığı laboratuarlar diğer deneylerin gerçekleştirildiği laboratuvarlara göre bazı değişiklikler gösterir. Bu laboratuvarlar için tercih edilen kültür yapılan ortamın, preparasyon alanlardan ayrı tutulmasıdır. Çalışmaların sağlıklı bir şekilde yürütülebilmesi için laboratuarı kullanan kişi sayısı, laboratuar alanı, hazırlık alanlarının yerleşimi, malzemelerin depolanması gibi özellikler oldukça önem taşır.
Laminar kabin, invert mikroskop, inkübatör, CO2 inkübatörü, azot tankı, santrifüj ve flasklar hücre kültürü laboratuarlarının en temel donanımlarıdır. Laminar kabinler kontrol edilebilir bir şekilde, çalışma alanında steril bir hava akımı olmasını sağlayarak çalışmalarda kontaminasyonun önlenmesi açısından büyük önem taşırlar. İnvert mikroskoplar flaskın alt yüzeyine tutunmuş hücrelerin düzenli olarak gözlenebilmesi için çok önemlidir. Hücrelerin yaşayıp çoğalabilmeleri için gerekli atmosfer, nem ve sıcaklığın kontrolü CO2 inkübatörleri ile sağlanır. Bir anlamda hücrelerin elde edildiği organizmanı in vivo koşullarını taklit eden CO2 inkübatörlerinde hücreler genellikle, 37
°C sıcaklık, %5 CO2 ve sabit nemli bir ortam ile kültüre edilirler. Azot tankları ise dondurulan hücrelerin bozulmadan saklanabileceği (kritik sıcaklık seviyesi -135 °C’
altında) -196 °C’ lik ortamı sağlamada hücre kültür laboratuvarlarının en önemli donanımlarından biridir. Hücrelerin dondurulmasında dimetilsülfoksit (DMSO) ve gliserol kullanımı, hücrelerin zarar görmeden dondurulmasına yardımcı olur. Kademeli olarak soğutma sağlayan özel dondurma kapları da yine hücrelerin zarar görmeden dondurulmasında etkilidir.
3.6. Hücre Kültür Mediumları
3.6.1. Fizikokimyasal Özellikleri
Hidrojen İyonu (pH): Hücrelerin kültür ortamında yaşatılabilmesi için hidrojen iyonu konsantrasyonu oldukça önemlidir. Hücrelerin birçoğu pH 7.4’ te iyi bir şekilde büyürler. Bununla beraber hücre hattına göre çeşitli pH değerlerinden de söz edilebilir.
Mediumların birçoğunun içinde pH indikatörü olarak fenol kırmızısı bulunur. Medium rengi kırmızı iken pH 7.4 tür. Mediumun turuncuya dönüşmesi pH’ ın 7.0, sarıya dönüşmesi ise pH’ ın 6.5 civarlarında olduğunu gösterir. pH 7.6 gibi yüksek pH’ a sahip mediumlarda ise mediumun rengi koyu kırmızı-pembe bir renk alır [27].
Karbondioksit ve Bikarbonat: Karbondioksit HCO3-
iyonlarıyla dengeyi kurmak için, gaz fazında iken medium içinde çözünür ve laktik asitin de artmasıyla mediumun pH’ ı düşer. Çözünmüş CO2, HCO3-
ve pH birbiriyle ilişkili olduğu için CO2’ in direk etkisini kontrol etmek zordur. Ortamın pH’ ının sabit kalabilmesi için CO2 ve H2CO3 tampon sistemleri kullanılır. Karbondioksitin H2CO3 oluşturduğu denklem şu şekilde gösterilebilir:
H2O + CO2 ↔H2CO3 ↔H+ + HCO3−
Mediumlara bu dengeyi korumak için CO2, NaHCO3 veya HEPES ilave edilir.
Bikarbonat tamponlarıyla karşılaştırıldığında daha ucuz ve daha az toksik olduğundan son yıllarda tamponların en iyilerinden birisi olarak kabul edilen HEPES‘ in kullanımı oldukça yaygındır [27].
Oksijen: Diğer bir önemli bileşen ise gaz formundaki oksijendir. Oksijen oranının artması hücrelerde toksik etki oluşturmasının yanısıra %95 oksijene ihtiyaç duyan hücreler olduğu gibi; %5’e kadar inen düşük oksijen seviyelerinde yaşayan insan mezenkimal kök hücreleri ve insan embriyonik akciğer fibroblastları gibi hücreler de mevcuttur [27].
Osmolarite: Birçok hücre osmotik basınca oldukça dayanıklıdır. İnsan plasması yaklaşık olarak 290 mOsm/kg’dır. Osmolaritedeki ± 10 mOsm/kg’lık bir değişim tolere edilebilir. Mediumun hazırlanmasında osmolarite oldukça önemlidir ve ölçümü için osmometre kullanılır [27].
Sıcaklık: Hücre kültürleri için sıcaklık hücrelerin elde edildiği organizmanın sıcaklığına bağlıdır. Bu yüzden sıcakkanlı hayvanlardan elde edilen hücrelerde optimum sıcaklık 37
°C’ dir. Memeli hücrelerinin kültürlerinde hücreler 4 °C’ de birkaç gün yaşayabilir ve kademeli olarak soğutulduklarında -196 °C’ de dondurulabilirler. Kuşlar gibi daha yüksek sıcaklığa sahip hayvanların hücreleri 38,5 °C’ de canlılıklarını sürdürürler.
Soğukkanlı hayvanların kültüre edilen hücreleri ise 15 -26 °C’ de yaşayabilirler [27].
Vizkozite: Vizkozite hücre kültürlerinde, hücrelerin çalkalanması veya hücrelerin tripsinizasyon sonrası ayrılmasında önemi bir rol oynar. Mediumlardaki vizkozite daha çok serum ile sağlanır [27].
3.6.2. PBS ( Fosfatla Tamponlanmış Tuz Solüsyonu )
İnorganik tuzlardan oluşan PBS, sodyum bikarbonat veya glukoz içerebilir. Genellikle tripsinizasyon öncesinde mediumun tripsin aktivitesini düşürmesini engellemek için hücreleri yıkamada kullanılır. İzotonik bir solüsyon olduğundan hücrelere zarar vermez.
3.6.3. Medium ve İçerikleri
Kültüre edilen hücreler besin ihtiyaçlarını mediumdan sağlarlar. Mediumlar hücre hatları için çeşitlilik gösterdiğinden mediumlara eklenen destekleyici içerikler de değişiklik gösterir. Bu yüzden mediumlar basal mediumlar ve tamamlanmış mediumlar
olarak ikiye ayrılırlar. Bazal mediumlarda hücrelerin yaşaması için gerekli bütünleyici içerikler olmadığından tek başına hücrelerin yaşatılabilmesi için uygun değildirler.
Tamamlanmış mediumlar ise hücre hattına göre değişen gerekli bütünleyici içerikleri ile hücrelerin yaşatılmasına yardımcı olurlar. Bütünleyici içerikler şu şekilde sıralanabilir:
Aminoasitler: Aminoasit konsantrasyonu hücrelerin yaşaması ve büyümesinde önemlidir. Hücre tipine göre değişse de genel olarak kullanılan zorunlu amino asitler sistein, arjinin, glutamin ve tirozindir. Hücre için en çok kulanılan amino asit ise glutamindir. Ancak glutaminin yarılanma ömrü kısadır ve ürettiği amonyak sebebiyle toksik bir etkiye neden olabilir. Çeşitli firmalarca glutamin yerine kullanılabilecek daha stabil bir yapıya sahip olan bileşikler de vardır [27].
Vitaminler: B grubu vitaminler, folik asit, inositol, biotin, nicotinamit, A, D, E, K vitaminleri ve kolin gibi çeşitli mediumlarda bulunan çeşitli vitaminler hücre canlılığının devamı için önemlidir [27].
Tuzlar: Na+, K+, Mg2+, Ca2+, Cl-, SO42
-, PO43
-, HCO3- tuzları mediumun osmolaritesine katkıda bulunan tuzlardır. Özellikle Ca+ sinyal iletiminde rol alıp, hücrelerin büyümesi ve çoğalmasında etkili olduğu için oldukça önemli bir tuzdur. Birçok medium orijinal olarak kendi tuz konsantrasyonuna sahiptir [27].
Glukoz: Enerji kaynağı olarak kullanılan glukoz, birçok mediumda kendiliğinden bulunur. Glikolizle laktata dönüşen pirüvat oluşumunu metabolize edebilir, sitrik asit döngüsüne katılarak CO2 ve su okside edebilir [27].
Organik Bileşenler: Hücre mediumunda bulunan diğer bileşenler ise protein, peptit, nükleosit, piruvat ve lipitlerdir. İçeriği indirgenmiş serumlarda bu organik bileşenler hücre devamlılığı açısından önem taşır [27].
Hormonlar ve Büyüme Faktörleri: Hormonlar ve büyüme faktörleri her medium için gerekli değildir, daha çok serum içermeyen mediumlarda kullanılır.
Antibiyotikler: Hücre kültürlerinde aseptik koşullar oldukça önemlidir. Kullanılan malzemeler ile ortamın sterilitesi ve çalışanların temizliği hücrelerin sağlıklı bir şekilde yaşamaları için elzemdir. Bu nedenle mediumların içerisine mikroorganizmaların üremesini engellemek için çeşitli antibiyotikler eklenir. Hücre kültür laboratuarlarında en çok görülen kontaminasyon sebebi bakterilerin özellikle de mikoplazmaların yol açtığı kontaminasyonlardır. Bunlar için de genelde streptomisin, penisilin ve gentamisin gibi antibiyotikler kullanılır.
Serum: Büyüme faktörleri içeren serumlar, hücre bölünmesinin indüklenmesini ve antitripsin özelliği ile de hücrelerin adezyonunu sağlarlar. Aynı zamanda birçok hormonun, lipitin ve mineralin kaynağıdır. Mediumlarda daha çok büyükbaş hayvanlardan elde edilen serumların kullanılmasının yanısıra atlardan ve nadiren insanlardan elde edilen serumlar da kullanılabilir. Ancak kullanılmadan önce bu serumların HIV ve Hepatit B gibi virüsler açısından kontrol edilmiş olması gereklidir.
Ayrıca bazı serumlar yine kullanımdan önce ısı ile inaktive edilerek mikoplazmalara karşı önlem alınmalıdır. Serumsuz olarak kullanılan mediumlar da vardır.
3.7. Hücre Kültür Modelleri
Bir doku veya organdan alınan hücreler, işlenmiş özel yüzeylere sahip ortamlarda belirli mediumlarda ve gereken besin miktarıyla tam olarak doku veya organ özelliği göstermeseler dahi yaşayarak çoğalabilirler. Hücrelerin ilk subkültürden önce, hücre hattı oluşturmadığı ve elde edildiği dokudan izole edildikten sonraki kültürlerine primer hücre kültürü denir. Primer hücre kültürleri yapabilmek için hücreler ait oldukları dokulardan eksplant yöntemiyle, mekanik ayrıştrmayla veya kollejenaz gibi enzimlerin kullanılmasıyla izole edilebilirler. İzole edilmiş hücreler dokudaki gibi genetik özelliklerini korurlar. Primer hücre kültürleri, kullanılan dokuyu oluşturan hücrelerin varlığıyla heterojen bir yapılanma gösterirler. Bu yapılanmadan kaynaklanan tek tip hücrenin elde edilmesi zor olması ve kontaminasyona daha açık bir işlem geçirmesi sebebiyle primer hücre kültürlerinin dezavantajları vardır.
Primer hücre kültürlerini oluşturan hücreler, mitoz bölünmeyle çoğalarak ve seçici bir mediumun kullanılması ile subkültüre edilerek daha homojen bir hale gelirler. Kanser
ve kök hücrelerin aksine diğer hücre tipleri telomeraz aktivitesinden yoksun olup senesense uğradıkları için ancak 20-100 kere subkültürleri yapılabilir. Bazı virüslerin kullanılmasıyla ise hücreler ölümsüz (immortal) hale getirilerek sonsuz sayıda subkültürlerinin yapılabilmesine olanak sağlanır [27]. Bu şekilde indüklenerek veya doğal olarak telomeraz aktivitesine sahip olduğu için sonsuz bölünme yeteneğine sahip hücrelerin kültürleri ise devamlı hücre kültürü olarak adlandırılır.
3.8. Sitotoksisite
Sitotoksisite terimi hücreleri zehirleyici olmak anlamında kullanılır. İn vivo olarak sitotoksisite hücrelere direk olarak zarar verip işlevlerini yapmasına engel olan fizyolojik bir durumdur. İn vitro olarak ise sitotoksisiteyi sistemik ve fizyolojik bir şekilde gözlemlemek zordur. Sitotoksisitenin değişkenliği çalışmaya bağlı olarak hücrenin ölmesi veya fenotipik olarak değişmesi gibi çeşitli şekillerde olabilir. Buna ek olarak hücreler nekrozis, apoptozis, otofaji ve sitostazis gibi şekillerde ölebilirler. Yeni ilaçlar, kozmetik ürünler, gıdalardaki katkı maddeleri üretilmeden önce sitotoksisite testlerinden geçerler. Bu toksisite testlerinden en yaygın olanı MTT, XTT ve MTS testleridir. Bu testlerde direk olarak hücre sayısını ölçme yerine, artan DNA, protein miktarı, devam eden metabolik aktivite, tetrazolium tuzunun formazan kristallerine dönüşmesi ya da proteinin veya DNA’ nın toplam miktarı ölçülür [27].
3.8.1. MTT Testi
MTT testi dolaylı olarak hücre sayısının artmasını veya hücre ölümünü değerlendirmeyi amaçlayan bir testdir. Hızlı kolorometrik bir yöntem olarak MTT testinde yalnızca canlı hücreler çok kuyucuklu bir spektrofotmetrede taranırlar. Çok yönlü, sayısal değerler veren, hassas ve tekrarlanabilir, kolay, hızlı ve daha ekonomik olmasıyla bu test diğer geleneksel yöntemlere göre daha avantajlıdır. İlk olarak Mosmann tarafından tanımlanan, 3-(4,5-dimetiltriazol-2-il)-2,5 difeniltetrazoliumbromid (MTT) yöntemi hücre canlılığının belirlenmesi için çok sık kullanılan pratik bir yöntemdir [38]. Wilson ve arkadaşları, MTT'den oluşan formazonun yoğunluğunun direkt olarak yaşayan hücrelerin sayısıyla bağlantılı olduğunu ileri sürmüşlerdir. Bu yöntemi, kanserli hastaların tedavisinde kullanılan ilaçlar üzerinde denemişler ve elde ettikleri klinik sonuçların, MTT sonuçlarıyla paralel olduğunu rapor etmişlerdir [39, 28]. Bu test
sağlam hücrelerde mitokondirinin MTT boyasının tetrazolium halkasını parçalayabilmesi ilkesine dayanmaktadır. Bu reaksiyon kırılgan bir mitokondriyal enzim olan süksinatdehidrogenaz enziminin aktivitesine bağımlıdır. MTT, hücrelere aktif olarak absorbe olan ve mitokondriye bağlı bir reaksiyon ile renkli, suda çözünmeyen formazana indirgenen bir maddedir [40, 28]. Tetrazolium halkasının parçalanması sonucu soluk sarı renkli MTT boyası koyu mavi-mor formazan ürününe dönüşmektedir. Hücrelerin MTT indirgeme özelliği hücre canlılığının ölçütü olarak alınır ve MTT analizi sonucunda elde edilen boya yoğunluğu canlı hücre sayısı ile korrelasyon gösterir [41, 28]. Sonuç olarak canlı ve mitokondri fonksiyonu bozulmamış hücreler mor renkte boyanmakta, ölü ya da mitokondri fonksiyonu bozulmuş hücreler ise boyanmamaktadırlar. MTT’ nin formazan kristallerine dönüşmesi Şekil 1.4. ‘te verilmiştir.
Şekil. 1.4 MTT’ nin formazan kristallerine dönüşmesi [42]
3.9. Deneylerde Kullanılan Hücre Hatlarının Genel Özellikleri
MCF-7, meme epitelinden şekillenen bir adenokarsinoma hücresidir. Meme dokusunun birkaç ideal karakteristik özelliğini gösterdiği için kanser çalışmalarında sıkça kullanılmaktadır. Östrojen reseptör pozitif bir hücre hattıdır. İlk kez 1970’ te Kafkas ırkından 69 yaşında bir kadından izole edilmiştir. Tavsiye edilen subkültür oranı 1:3 veya 1:6’ dır. Optimum yaşama koşulları 37 °C’ de %5 CO2’li ortamdır.
PC-3 prostat epitelinden elde edilen bir adenokarsinoma hücresidir. İlk kez yine Kafkas ırkından 62 yaşındaki bir erkekten izole edilmiştir. Düşük asit-fosfat ve testosteron-5-
alfa redüktaz aktivitesi gösterir. Optimum yaşam ortamı 37 °C’ sıcaklık ve %5 CO2’ li ortamdır. Yine tavsiye edilen subkültür oranı 1:3 veya 1:6’ dır.
Fibroblast hücresi bağ dokunun ana hücreleridir. Deriden izole edilmişlerdir. Optimum yaşama ortamı 37 °C’ sıcaklık ve %5 CO2’ li ortamdır. Tavsiye edilen subkültür oranı 1:2 veya 1:9 dur [43].
4. Echinops orientalis Bitkisinin Sınıflandırılması
Alem : Plantae (Bitkiler)
Şube : Magnoliophyta (Kapalı tohumlular, Angiosperms) Sınıf : Magnoliopsida (İki çenekliler, Dikotiledonlar) Takım : Asterales
Familya : Asteraceae (papatyagiller, Compositae) Tribus : Cardueae
Subtribus : Echinopsidinae Cins : Echinops
Tür : Echinops orientalis Trautv [44]
4.1. Asteraceae Familyasının Genel Özellikleri
“Asteraceae” ya da diğer adıyla “Compositae” çiçekli bitkilerin en büyük familyasıdır.
1100 genus ve 25000 civarında türe sahiptir. Papatyagiller familyasına ait taksonlar Dünyanın ekvatoral yağmur ormanları hariç, tamamına yakın kısmında görülebilirler.
Asterace familyasının çoğu üyesi rizomlu çok yıllık otsular, herdem yeşil çalılar ya da yarıçalılardır. Bunların yanında kazık köklü ya da tuberli çok yıllık, iki yıllık ya da bir yıllık otsulara da sıkça rastlanır. Epifitler, sucul ağaçsılar ve büyük ağaçlar nadirdir.
Bazıları gerçek tırmanıcı, sarılıcı ya da sukkulenttir [44].
4.2. Echinops Cinsinin Genel Özellikleri
Echinops L. cinsi Türkiye Florası’nın 5. cildinde Hedge tarafından yazılmıştır. 11. ciltte (ek cilt 2) bir tür daha ilave edilmiştir. Gövde dik, çoğunlukla sadece en uç kısımlarda seyrek dallı, tüylü, nadiren tüysüzdür. Yapraklar alternat, pinnat parçalı şekilde
bölünmüş, çoğunlukla dikenli, çoğunlukla üzeri yumuşak tüylü, hatta bazen salgı tüylü, nadiren neredeyse tüysüzdür. Kapitulumlar tek çiçeklidir. Korolla, beyaz ya da açık maviden maviye kadar renklerdedir. Beş lopludur. Stigma 2 parçalı, stillusun üst kısımlarında tüysü yapılar taşıyan bir şişkinlik bulunur. Akenler iğ şekilli, zayıf boyuna, yüzey üzerine paralel olarak yatık yoğun uzun tüylerle çevrili, papus kısa fırça şeklinde serrat tüylerden oluşmuş bir halkasal yapıdadır. Çok yıllık, çok nadiren iki yıllık ve çok ender olarak da tek yıllık otsulardır, step ve yarı-çöl bölgelerde dağılmış ve özellikle de dağların yarı-çöl ve step bölgelerinde yaşar, 125-130 civarında türe sahiptir [44].
4.3. Echinops orientalis’ in Genel Özellikleri
Endemik değildir. Kromozom sayısı 2n=28’dir. Çiçeklenmesi 6.-8. aylarda gerçekleşir.
Yaşama ortamları step alanları kayalık ve taşlık yamaçlar, tarla kenarları, Quercus ormanları, yol kenarlarıdır. Genel olarak Kafkasya, kuzey-batı, kuzey İran ve Türkiye’
de yayılış gösterir. İran-Turan elementidir. Türkiye’ de ise Anadolu da 32. boylamın doğusunda kalan alanlarda yayılış gösterir. IUCN Tehlike Kategorisine göre tehlike altında değildir.
Gövde çok sayıda, kahverengimsi, fazlaca dallanır, 40–120 cm, 6 -20 mm çaplarına kadar genişlemektedir. Taban yaprakları 28 – 39 cm arasında ortalama 34,87 ± 3,96 cm boyundadır. Çok sayıda değişik boylarda batıcı dikenler mevcut. Çiçekler küçük basit yapraklara sahip. Korolla koyu mavi, mavi ya da soluk mavidir [44].
Şekil 1.5. Echinops orientalis
4.4.Echinops Cinsine Ait Çalışmalar ve Kullanımı
Echinops cinsine ait türler hakkında çok geniş çapta bir çalışma yoktur. Bitkinin çok dikenli olup kolaylıkla toplanamaması, hakkında çok araştırma yapılamamasına neden olmuştur.
Kuete ve arkadaşları tarafından yapılan bir çalışmaya göre E. giganteus var. leyli türünün antimikrobiyal etkisi olduğu, kalp ve mide hastalıklarına karşı geleneksel olarak kullanıldığı belirtilmiştir [45].
Jaisval ve arkadaşlarının E. humilis türü üzerinde yaptıkları bir çalışmada UV’ ye karşı korumada etkili olduğu ve herbivorlar ile patojenleri bitkilerden uzak tutmaya yaradığı tahmin edilen hydroksicinnamat isimli ikincil metabolitler elde edilmiş ve profili çıkarılmıştır [46].
Yine Özüdoğru ve arkadaşları tarafından yapılan bir çalışmada E. ritro türüne ait yaprakların gıda maddesi olarak tüketildiği ortaya çıkarılmıştır [47].
E. sphaerocephalus hakkında Iglinski ve arkadaşları tarafından yapılan bir çalışma ise bu türün bal üretimini arttırmak için kullanıldığını kaydetmişlerdir [48].
Lamorde ve arkadaşları yaptıkları çalışmada E. amplexicaulis türünün Uganda’ da geleneksel olarak HIV’ e karşı kullanıldığını [17]; Wondimu ve arkadaşları E. hoehnelii türünün yılan sokması ve Malarya’ya karşı kullanıldığını belirtmişlerdir [49].
Lamberth tarafından yapılan bir çalışmada E. sphaerocephalus türünden elde edilen bithienil maddesinin mantarlara karşı etkili olduğu ortaya çıkarılmıştır [50].
Erdoğan ve arkadaşları tarafından yapılan bir çalışmada [15] Echinops cinsi bitki türlerinin ekstraktlarının antimikrobiyal etkisi olduğu bulunmuştur.
Jin ve arkadaşlarının E. grijiisi türüyle yaptıkları çalışmada kök kısmından elde edilen etanol ekstraktalarından izole ettikleri tiofeninin HepG2, K562, HL60 ve MCF-7 insan kanserli hücre hatlarına karşı sitotoksik özelliği olduğunu bulmuşlardır [51].
Singh ve arkadaşları ise E. echinatus türünün etanol ekstraktlarının Hindistan’ da iltihaplanmalara karşı kullanılan bir bitki türü olduğunu kaydetmişlerdir [52].
Teklehaymanot ve arkadaşları E. kebericho türünün Etiyopya’ da öksürük ve baş ağrısına karşı kullanıldığını göstermişlerdir [53].
Mhaske ve arkadaşları tarafından yapılan bir çalışmada E. echinatus türünden uyuşturucu, sakinleştirici, ağrı kesici, anti-konvülzan, antibakterial, antidiabetik, iltihap giderici, öksürük giderici ve anti tümör özellikleriyle bilinen kuinazolinonların alkaloidlerinden olan ekhinozolleri elde etmişlerdir [54]. Ayrıca kuinazolinonların E.
ritro ve E. shaerocephalus türlerinden elde edildiğini belirten çalışmalar da vardır [55- 58].
Hymete ve arkadaşları tarafından E. ellenbeckii ve E. longisetus üzerinde yapılan çalışmada, örneklerin metanol ekstratlarının bazı mikroorganizmalar üzerinde etkili olduklarını bulmuşlardır [58].
Barbour ve arkadaşları tarafından E. gaiilardoti türü üzerinde yapılan bir çalışmada bitkinin çiçeklerinin Escherichia coli, Proteus sp., Pseudomonas aeruginosa, Shigella dysenteriae, Salmonella enteritidis, Salmonella typhi, Staphylococcus aureus, Streptococcus faecalis, ve Canadida albicans organizmalarına karşı etkili olduğu bulunmuştur [59].
Sharma ve arkadaşlarının yaptığı çalışmada, Hindistan’ da fitoterapide geleneksel olarak kullanılan E. niveus türüne ait kök kısmının öksürük ve astıma karşı kullanıldığı belirtilmiştir [60].
Unny ve arkadaşları tarafından yapılan çalışmada E. echinatus türüne ait kök kısmının
%50 alkollü ekstraktının sperm hareketsizliğine yol açtığını belirtilmiştir [61].
Aburjai ve arkadaşları E. polyceras türünden elde ettikleri metanol ekstraktlarının P.
aeruginosa’ ya ait iki suş üzerindeki dirençliliğini araştırmışlardır [62].
Graham ve arkadaşlarının yapmış oldukları çalışmada E. grijisii türüne ait köklerin hepatomada, kanser tedavisinde ve kemik tümörlerinde; E. latifolius türüne ait kök örneklerinin ise kanser ve tümörü iyileştirmede kullanıldığını rapor etmişlerdir [63].
Merzouki ve arkadaşları Fas’ ta E. spinosus türünün hipoglisemiye karşı geleneksel olarak kullanıldığını kaydetmişlerdir [64].
Sharma ve Sharma tarafından yapılan bir çalışmada ise E. echinatus’un geleneksel tıpta Plasmodium falciparum’ a karşı kullanıldığını belirtilmiştir [65].
Nyman ve arkadaşları tarafından yapılan bir çalışmada ise E. echinatus’ a ait kök kısımlarının yılan sokmasına karşı kullanıldığı bildirilmiştir [66].
Sing ve arkadaşları tarafından yapılan bir çalışmada Echinops cinsi türlerinin flavanoid ve antihelmintik (bağırsak solucanı düşürücü) aktiviteye sahip olan tiyofen asetilen bileşenlerini içerdiği saptanmıştır [67, 68, 58].
Dawit ve Ahadu tarafından yapılan çalışmada Echinops cinsinin bazı türlerinin Etiyopya geleneksel tıbbında, migren, diare, kalp ağrısı, enfeksiyonların farklı formları, bağırsak kurdu istilası, hemoroid ve diğer bazı hastalıkların tedavisinde kullanıldığı ifade edilmiştir [69, 58].
Günümüze kadar yapılan çalışmalar incelendiğinde E. orientalis türüne ait bir çalışmaya rastlanmamıştır. Bu nedenle bu çalışmada, E. orientalis türüne ait örneklerin kök kısımlarının metanol, kloroform ve hekzan ekstraktlarının antimikrobiyal ve in vitro MCF-7, PC-3 ve fibroblast hücre kültürlerindeki sitotoksik etkilerinin araştırılması amaçlanmıştır. Bu amaçla çalışmamızda, antimikrobiyal aktivitenin incelenmesi için disk difüzyon ve MİK testleri ile sitotoksisite araştırması için günümüzde en çok kullanılan MTT testi gerçekleştirilmiştir.
2. BÖLÜM
GEREÇ VE YÖNTEM
2.1. Bitkisel Materyal
Bu çalışmada Echinops orientalis türüne ait örneklerin kök kısımları kullanıldı.
2.2. Bitkilerin Toplanması
Çalışmada kullanılan bitkiler Kayseri Tavlusun Köyü yakınındaki habitatlarından toplandı (CV4806 numaralı kayıtlı örnek). Bitkiler Erciyes Üniversitesi Biyoloji Bölümü Öğretim Üyesi Doç. Dr. Cem VURAL tarafından teşhis edildi.
2.3. Bitki Ekstraktlarının Hazırlanması
Toplanan örneklere ait kök kısımları temizlenerek üzerinden toprak vb. maddelerin uzaklaştırılması sağlandı. Bahçe makasıyla küçük parçalara ayrılan kökler mutfak robotu yardımıyla toz haline getirildi. Toz halindeki bu örneklerden 10-12 gr tartılarak 250 ml metanol, kloroform ve hekzanın kullanıldığı üç çözücü ile ekstrakte edildi.
Çözücü olarak metanol, kloroform ve hekzan (Merck) kullanıldı. Soksolet cihazı (Şekil 2.1.) yardımıyla en az 6 saat (ekstrakt sabit bir renk alana kadar) ekstraksiyon yapıldı.
Bu ekstrakttan evoporasyon cihazı (Heidolph, laborota 4000) yardımıyla çözücülerin uçması sağlanarak sadece bitki materyaline ait ekstrak edildi ve sonraki uygulamalar için +4 °C’ de muhafaza edildi.
Şekil 2. 1. Soksolet cihazı
2.4. Antimikrobiyal Testlerde Kullanılan Mikroorganizmalar
Antimikrobiyal testlerde 14 bakteri türü ve 1 fungus türü olmak üzere toplam 15 standart organizma ile çalışıldı. Kullanılan suşlara ait kod numaraları Tablo 2.1.’ de sunulduğu gibidir.
Tablo 2.1. Kullanılan organizmalar ve kültür koleksiyon merkezi (ATCC) kodları
MİKROORGANİZMA ORGANİZMA KODU
1 Bacillus cereus ATCC 11778
2 Bacillus subtilis ATCC 6633
3 Enterobacter aerogenes ATCC 13048 4 Enterococcus faecalis ATCC 29212
5 Escherichia coli ATCC 25922
6 Klebsiella pneumonia ATCC 13883
7 Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853
8 Staphylococcus aureus ATCC 25923
9 Staphylococcus epidermidis ATCC 12228 10 Listeria monocytogenes ATCC 19115
11 Micrococcus luteus ATCC 10240
12 Pseudomonas fluorescens ATCC 49838
2.5. Antimikrobiyal Aktivite Testleri
Ekstratların antimikrobiyal aktiviteleri disk difüzyon testi ve mikrodilüsyon yöntemi (MİK) kullanılarak değerlendirildi.
2.5.1. Disk Difüzyon Metodu
Mikroorganizmaların ilk inkübasyonu, -80 °C’ de muhafaza edilen stok suşlardan tek koloni oluşturulacak şekilde petrilere ekilmesiyle yapıldı. Organizmalar 37 °C’ de 24 saat inkübe edilerek üretildi. Suşların üretiminde için bakterilerde Triptik Soy Agar (TSA-Acumedia) maya için ise Yeast Pepton Dekstroz Agar (YPDA-Acumedia) besiyerleri kullanıldı. Katı besiyerinde inkübe edilen organizmalardan tek koloni alınarak sıvı besiyerine ekim yapıldı. Bakteriler için Triptik Soy Broth (TSB- Acumedia), maya için ise Yeast Pepton Dekstroz Broth (YPDB-Acumedia) besiyerleri kullanıldı. Çalkalayıcıda (GFL 3031) 16-20 saat süren inkübasyonun ardından 200 µl alınarak tekrar aynı sıvı besiyerlerinde 4-5 saat süren bir inkübasyon daha yapıldı.
Bunun amacı disk difüzyon ve MİK testlerinde kullanılacak mikroorganizmaların mümkün olduğunca genç bireylerden oluşmasını ve spektrofotometre ile yapılan ölçümlerde ölü organizma sayısının en aza düşürülmesini sağlamaktır.
Ekstraktların antimikrobiyal aktiviteleri National Commitee for Clinical Laboratory Standarts tarafından önerilen yönteme göre disk difüzyon tekniği ile yapılmıştır.
Organizmaların petrilere eşit sayıda düşmesini sağlamak için laboratuvarımızda yapılan mikroorganizma çalışmaları için daha önceden belirlenen bakteri seyreltme katsayıları kullanıldı. Bu işlem için CFU (colony forming unit/ml) testi yapıldı. CFU testinde sıvı besiyerinde ikinci inkübasyondan sonra mikroorganizmaların optik dansiteleri 0,1’e (Hitachi U-1800) ayarlandı. Sonuçlar değerlendirilerek her bir mikroorganizma için optimum seyreltme katsayıları belirlendi ve sonraki denemelerde bu seyreltmeler
13 Corynebacterium renale ATCC 19412
14 Proteus mirabilis ATCC 25933
15 Candida albicans ATCC 90028
kullanılarak ekimler yapıldı [15]. Belirlenen seyreltme katsayıları Tablo 2.2.’ de görüldüğü gibidir.
Sıvı besiyerinde üretilip seyreltmeleri yapılan mikroorganizmalar bakteriler için hazırlanan Müller Hinton Agar (MHA- Acumedia) ve maya için hazırlanan YPDA besiyerlerine ekildi. Ekim işlemi yapılırken mikroorganizmalar petri üzerine pipetlenip steril eküvyon çubuğu ile eşit miktarda yayılıp 10–15 dakika laboratuvar koşullarında bekletildi.
Tablo 2.2. Mikroorganizmalar ve seyreltme katsayıları
Her bir diske emdirilecek bitki ekstraktları ise DMSO’ da (Merck) çözdürülerek hazırlandı. Metanol esktraktı 24 mg/ml, kloroform ve hekzan esktraktları ise 12 mg/ml olacak şekilde hazırlanarak disklere 30 µl emdirildi. Disklerin ekstraktları tamamen
MİKROORGANİZMA SEYRELTME
KATSAYISI
1 Bacillus cereus 1/8
2 Bacillus subtilis 1/16
3 Enterobacter aerogenes 1/16
4 Enterococcus faecalis 1/16
5 Escherichia coli 1/16
6 Klebsiella pneumonia 1/8
7 Pseudomonas aeruginosa 1/16
8 Staphylococcus aureus 1/8
9 Staphylococcus epidermidis 1/8
10 Listeria monocytogenes 1/16
11 Micrococcus luteus 1/8
12 Pseudomonas fluorescens 1/8
13 Corynebacterium renale 1/8
14 Proteus mirabilis 1/16
15 Candida albicans 1/2
emmesi beklendikten sonra ekim yapılan petrilere aseptik olarak yerleştirilerek 37 °C’
de 24 saat inkübe edildi. Antimikrobiyal aktivite; bakteri ya da maya üremesinin az olduğu daha şeffaf olan zon çapı kumpas yardımıyla ölçülerek kaydedildi. Her bir örnek için, iki ayrı bağımsız set düzenlendi. Negatif kontrol olarak sadece örneklerin çözeltilerinin hazırlandığı çözücü (DMSO) kullanıldı. Ayrıca pozitif kontrol olarak laboratuvarımızda daha önce yapılan standart pozitif kontrol testleri tekrarlandı. Bunun için 50 µg /disk ampisilin, 30 µg /disk tetrasiklin, 30 µg /disk trimetoprim, 30 µg /disk nistatin, ve 40 µg /disk mikanozol (Sigma), kullanıldı. Nistatin ve mikanozol uygulaması yalnızca maya için kullanıldı. Antibiyotik denemeleri tek set olarak gerçekleştirildi.
2.5.2. Mikrodilüsyon Metodu
Ekstraksiyonu yapılan bitkilerin Minumum İnhibisyon Konsantrasyonu (MİK) mikro dilüsyon yöntemiyle çalışıldı. Ekstraktlar DMSO’da çözülerek metanol esktraktı için 8 mg/ml, kloroform ve hekzan esktraktları için ise 4 mg/ml’ lik ara stoklar hazırlandı. 96 kuyucuk içeren U tabanlı ELISA kaplarının ilk kuyucuklarına belirlenen ekstraktlardan 200 µl, geri kalan bütün kuyucuklara ise 100 µl besiyeri eklendi. Ardından stok konsatrasyonlarının eklendiği ilk kuyucuktan 100 µl alınarak ikinci kuyucuğa eklendi ve bu işlemler son kuyucuğa gelene kadar bu şekilde devam ettirilerek her kuyucuktaki konsantrasyonun bir öncekinin yarısı olacak şekilde seyreltilmesi sağlandı. Böylece metanol ekstraktı için kullanılan konsantrasyonlar 4 mg/ml, 2 mg/ml, 1 mg/ml, 0,5 mg/ml, 0,25 mg/ml, 0,125 mg/ml ve 0,062 mg/ml olurken; kloroform ve hekzan için kullanılan konsantrasyonlar 2 mg/ml, 1 mg/ml, 0,5 mg/ml, 0,25 mg/ml, 0,125 mg/ml, 0,062 mg/ml, 0,031 mg/ml oldu. Bu işlemin ardından her kuyucuğa 90 µl besiyeri eklendi ve son olarak da her kuyucuğa 10 µl organizma (optik densiteleri ayarlanmış ve seyreltmeleri yapılmış) pipetlenerek 24 saat 37 °C’ lik inkübasyonun ardından değerlendirmeler yapıldı. Aynı ELISA pleytinde pozitif ve negatif kontroller de denendi. Ayrıca ampisilin, tetrasiklin ve trimetaprim antibiyotikleri bakteriler üzerinde, nistatin ve mikanozol ise maya üzerinde denenerek MİK değerleri belirlendi ve karşılaştırmaları yapıldı.
2.6. Hücre Kültürü
2.6.1 Hücrelerin Temini
Çalışmada kullanılan MCF-7 ve PC-3 hücreleri Gülhane Askeri Tıp Akademisi Sağlık Bilimleri Enstitüsü Araştırma Geliştirme Merkezi, Kanser ve Tıbbi Laboratuar Araştırma Kısmı’ ndan, fibroblast hücreleri ise Erciyes Üniversitesi, Hücre Kültür Bankasından temin edildi.
2.6.2. Hücrelerin Büyütüleceği Mediumun Hazırlanması
Çalışmada kullanılan MCF-7 ve PC-3 kanserli hücre hatları için RPMI-1640 (Biological Industries), sağlıklı fibroblast hücre hattı içinse %1 glukoz içeren DMEM (Biological Industries) mediumu kullanıldı. Bazal mediumlara %10 FBS (Biological Industries), %1 L-glutamin (Biological Industries) ve %1 penisilin-streptomisin (Invitrogen) antibiyotik karışımı eklenerek tamamlanmış medium elde edildi.
2.6.3. Hücrelerin Kültür Basamakları
Sıvı azot tankından çıkarılan kryo tüp içerisinde donmuş haldeki hücreler su banyosunda hafifçe sallanarak çözüldü. Hücrelerin DMSO’nun (Sigma) zararlı etkisinden kurtulması için steril bir santrifüj tüpüne alınıp üzerine medium eklenerek 800 rpm’de 5 dakika santrifüj edildi. Santrifüj sonrası tüpün içindeki süpernatant atılıp pellet üzerine 5 ml medium eklenerek pellet süspanse hale getirildi ve büyümesi için T25 flaska ekilerek 37 °C’, %5 CO2’li inkübatöre (Sanyo) kaldırıldı. Hücreler her gün düzenli olarak kontrol edilerek büyümeleri gözlendi. Hücre yoğunluğunun %80 konflüense ulaşmasını takiben flask yüzeyi PBS (Biological Industries) ile yıkanarak hücreler 5 dakika boyunca tripsine (Biological Industries) maruz bırakıldı.
Tripsinizasyon sonrası flask yüzeyinden ayrılan hücreler üzerlerine medium eklenerek santrifüj tüpüne alındı ve yine 800 rpm’de 5 dakika santrifüj edildikten sonra pellet süspanse edilerek hücrelerin çoğalması için daha büyük bir alana sahip başka bir flaska ekildi. Devam edecek işlemler için gerekecek hücreler ise kryo tüpe alınarak azot tankında saklandı. Bu işlem için tripsinizasyon sonrası hücreler her kryo tüpte
1.000.000 hücre olacak şekilde ayarlandı ve santrifüj edildi. Pellet üzerine %90 FBS ve
%10 DMSO içeren dondurma mediumu eklenerek hücreler süspanse edildi ve kryo tüpe alındı. Kryo tüpler ise dondurma kabına (Nalgene-Mr. Frosty) yerleştirilerek -80 °C’ ye kaldırıldı. 24 saat sonra -80 °C’ de bekletilen hücreler azot tankına yerleştirildi.
2.6.4. Hücrelerin Sayımı
Çalışmada kullanılacak hücrelerin sayımı “Thoma lamı” adı verilen, üzerinde mikroskobik enine ve boyuna çizgilerin bulunduğu özel bir lam kullanılarak yapıldı.
Bunun için bir ependorf tüpün içine 0,9 ml santrifüj sonrası süspanse edilen hücreler ve 0,1 ml tripan mavisi (Sigma) eklenerek oda sıcaklığında 5 dakika bekletildi. Ardından üzerine lamel kapatılan Thoma lamına ependorf tüp içindeki karışımdan 10 µl alınırak sayım yapıldı. Hücrelerin mililitredeki sayısı;
“Hücre sayısı/ml= (Sayılan hücre miktarı X Dilüsyon oranı X 104)/9” formülü kullanılarak hesaplandı.
2.6.5. Hücrelerin ELISA Pleytlerindeki Optimizasyonu
Çalışmada kullanılan hücrelerin morfolojileri, hücre- hücre etkileşimi ve dolayısıyla ELISA pleytlerindeki herbir kuyucukta kapladıkları alan sayısı çalışmanın sağlıklı olarak değerlendirilmesinde çok büyük bir önem taşır. Bu yüzden santrifüj sonrası süspanse edilen hücreler sayılarak belirli oranlarda seyreltilip ELISA pleytlerinin her bir kuyucuğuna ekildi. Hücrelerin ilaç etkileşimi ve normal büyüme hızları göz önüne alınarak MCF-7 için 10.000, PC-3 için 6.000 ve fibroblast için 8.000 hücre sayısı hücrelerin her bir kuyucukta büyüyebileceği optimum sayılar olarak belirlendi.
2.6.6. Hücreler Üzerindeki Etkisi İncelenecek Ekstraktların Optimizasyonu
Hücrelere etkisinin araştırılacağı bitki ekstraktlarının optimizasyonu yapılırken benzer çalışmalarda kullanılan dozlar denendi. Bunun için bitki ekstraktları DMSO’ da çözülerek 20 µg/ml, 200 µg/ml ve 1000 µg/ml olacak şekilde ara stoklar hazırlanarak 24, 48 ve 72 saatlik MTT deneyi yapıldı. Bu deney sonucunda elde edilen sonuçlara göre 20 µg/ml’lik ara stok konsantrasyonunun hücreler üzerinde bir etkisi olmadığı
