Disk Difüzyon Metodu - Antimikrobiyal Aktivite Testleri

4. Echinops orientalis Bitkisinin Sınıflandırılması

2.5. Antimikrobiyal Aktivite Testleri

2.5.1. Disk Difüzyon Metodu

Mikroorganizmaların ilk inkübasyonu, -80 °C’ de muhafaza edilen stok suşlardan tek koloni oluşturulacak şekilde petrilere ekilmesiyle yapıldı. Organizmalar 37 °C’ de 24 saat inkübe edilerek üretildi. Suşların üretiminde için bakterilerde Triptik Soy Agar (TSA-Acumedia) maya için ise Yeast Pepton Dekstroz Agar (YPDA-Acumedia) besiyerleri kullanıldı. Katı besiyerinde inkübe edilen organizmalardan tek koloni alınarak sıvı besiyerine ekim yapıldı. Bakteriler için Triptik Soy Broth (TSB-Acumedia), maya için ise Yeast Pepton Dekstroz Broth (YPDB-Acumedia) besiyerleri kullanıldı. Çalkalayıcıda (GFL 3031) 16-20 saat süren inkübasyonun ardından 200 µl alınarak tekrar aynı sıvı besiyerlerinde 4-5 saat süren bir inkübasyon daha yapıldı.

Bunun amacı disk difüzyon ve MİK testlerinde kullanılacak mikroorganizmaların mümkün olduğunca genç bireylerden oluşmasını ve spektrofotometre ile yapılan ölçümlerde ölü organizma sayısının en aza düşürülmesini sağlamaktır.

Ekstraktların antimikrobiyal aktiviteleri National Commitee for Clinical Laboratory Standarts tarafından önerilen yönteme göre disk difüzyon tekniği ile yapılmıştır.

Organizmaların petrilere eşit sayıda düşmesini sağlamak için laboratuvarımızda yapılan mikroorganizma çalışmaları için daha önceden belirlenen bakteri seyreltme katsayıları kullanıldı. Bu işlem için CFU (colony forming unit/ml) testi yapıldı. CFU testinde sıvı besiyerinde ikinci inkübasyondan sonra mikroorganizmaların optik dansiteleri 0,1’e (Hitachi U-1800) ayarlandı. Sonuçlar değerlendirilerek her bir mikroorganizma için optimum seyreltme katsayıları belirlendi ve sonraki denemelerde bu seyreltmeler

13 Corynebacterium renale ATCC 19412

14 Proteus mirabilis ATCC 25933

15 Candida albicans ATCC 90028

kullanılarak ekimler yapıldı [15]. Belirlenen seyreltme katsayıları Tablo 2.2.’ de görüldüğü gibidir.

Sıvı besiyerinde üretilip seyreltmeleri yapılan mikroorganizmalar bakteriler için hazırlanan Müller Hinton Agar (MHA- Acumedia) ve maya için hazırlanan YPDA besiyerlerine ekildi. Ekim işlemi yapılırken mikroorganizmalar petri üzerine pipetlenip steril eküvyon çubuğu ile eşit miktarda yayılıp 10–15 dakika laboratuvar koşullarında bekletildi.

Tablo 2.2. Mikroorganizmalar ve seyreltme katsayıları

Her bir diske emdirilecek bitki ekstraktları ise DMSO’ da (Merck) çözdürülerek hazırlandı. Metanol esktraktı 24 mg/ml, kloroform ve hekzan esktraktları ise 12 mg/ml olacak şekilde hazırlanarak disklere 30 µl emdirildi. Disklerin ekstraktları tamamen

MİKROORGANİZMA SEYRELTME

KATSAYISI

1 Bacillus cereus 1/8

2 Bacillus subtilis 1/16

3 Enterobacter aerogenes 1/16

4 Enterococcus faecalis 1/16

5 Escherichia coli 1/16

6 Klebsiella pneumonia 1/8

7 Pseudomonas aeruginosa 1/16

8 Staphylococcus aureus 1/8

9 Staphylococcus epidermidis 1/8

10 Listeria monocytogenes 1/16

11 Micrococcus luteus 1/8

12 Pseudomonas fluorescens 1/8

13 Corynebacterium renale 1/8

14 Proteus mirabilis 1/16

15 Candida albicans 1/2

emmesi beklendikten sonra ekim yapılan petrilere aseptik olarak yerleştirilerek 37 °C’

de 24 saat inkübe edildi. Antimikrobiyal aktivite; bakteri ya da maya üremesinin az olduğu daha şeffaf olan zon çapı kumpas yardımıyla ölçülerek kaydedildi. Her bir örnek için, iki ayrı bağımsız set düzenlendi. Negatif kontrol olarak sadece örneklerin çözeltilerinin hazırlandığı çözücü (DMSO) kullanıldı. Ayrıca pozitif kontrol olarak laboratuvarımızda daha önce yapılan standart pozitif kontrol testleri tekrarlandı. Bunun için 50 µg /disk ampisilin, 30 µg /disk tetrasiklin, 30 µg /disk trimetoprim, 30 µg /disk nistatin, ve 40 µg /disk mikanozol (Sigma), kullanıldı. Nistatin ve mikanozol uygulaması yalnızca maya için kullanıldı. Antibiyotik denemeleri tek set olarak gerçekleştirildi.

2.5.2. Mikrodilüsyon Metodu

Ekstraksiyonu yapılan bitkilerin Minumum İnhibisyon Konsantrasyonu (MİK) mikro dilüsyon yöntemiyle çalışıldı. Ekstraktlar DMSO’da çözülerek metanol esktraktı için 8 mg/ml, kloroform ve hekzan esktraktları için ise 4 mg/ml’ lik ara stoklar hazırlandı. 96 kuyucuk içeren U tabanlı ELISA kaplarının ilk kuyucuklarına belirlenen ekstraktlardan 200 µl, geri kalan bütün kuyucuklara ise 100 µl besiyeri eklendi. Ardından stok konsatrasyonlarının eklendiği ilk kuyucuktan 100 µl alınarak ikinci kuyucuğa eklendi ve bu işlemler son kuyucuğa gelene kadar bu şekilde devam ettirilerek her kuyucuktaki konsantrasyonun bir öncekinin yarısı olacak şekilde seyreltilmesi sağlandı. Böylece metanol ekstraktı için kullanılan konsantrasyonlar 4 mg/ml, 2 mg/ml, 1 mg/ml, 0,5 mg/ml, 0,25 mg/ml, 0,125 mg/ml ve 0,062 mg/ml olurken; kloroform ve hekzan için kullanılan konsantrasyonlar 2 mg/ml, 1 mg/ml, 0,5 mg/ml, 0,25 mg/ml, 0,125 mg/ml, 0,062 mg/ml, 0,031 mg/ml oldu. Bu işlemin ardından her kuyucuğa 90 µl besiyeri eklendi ve son olarak da her kuyucuğa 10 µl organizma (optik densiteleri ayarlanmış ve seyreltmeleri yapılmış) pipetlenerek 24 saat 37 °C’ lik inkübasyonun ardından değerlendirmeler yapıldı. Aynı ELISA pleytinde pozitif ve negatif kontroller de denendi. Ayrıca ampisilin, tetrasiklin ve trimetaprim antibiyotikleri bakteriler üzerinde, nistatin ve mikanozol ise maya üzerinde denenerek MİK değerleri belirlendi ve karşılaştırmaları yapıldı.

2.6. Hücre Kültürü

2.6.1 Hücrelerin Temini

Çalışmada kullanılan MCF-7 ve PC-3 hücreleri Gülhane Askeri Tıp Akademisi Sağlık Bilimleri Enstitüsü Araştırma Geliştirme Merkezi, Kanser ve Tıbbi Laboratuar Araştırma Kısmı’ ndan, fibroblast hücreleri ise Erciyes Üniversitesi, Hücre Kültür Bankasından temin edildi.

2.6.2. Hücrelerin Büyütüleceği Mediumun Hazırlanması

Çalışmada kullanılan MCF-7 ve PC-3 kanserli hücre hatları için RPMI-1640 (Biological Industries), sağlıklı fibroblast hücre hattı içinse %1 glukoz içeren DMEM (Biological Industries) mediumu kullanıldı. Bazal mediumlara %10 FBS (Biological Industries), %1 L-glutamin (Biological Industries) ve %1 penisilin-streptomisin (Invitrogen) antibiyotik karışımı eklenerek tamamlanmış medium elde edildi.

2.6.3. Hücrelerin Kültür Basamakları

Sıvı azot tankından çıkarılan kryo tüp içerisinde donmuş haldeki hücreler su banyosunda hafifçe sallanarak çözüldü. Hücrelerin DMSO’nun (Sigma) zararlı etkisinden kurtulması için steril bir santrifüj tüpüne alınıp üzerine medium eklenerek 800 rpm’de 5 dakika santrifüj edildi. Santrifüj sonrası tüpün içindeki süpernatant atılıp pellet üzerine 5 ml medium eklenerek pellet süspanse hale getirildi ve büyümesi için T25 flaska ekilerek 37 °C’, %5 CO₂’li inkübatöre (Sanyo) kaldırıldı. Hücreler her gün düzenli olarak kontrol edilerek büyümeleri gözlendi. Hücre yoğunluğunun %80 konflüense ulaşmasını takiben flask yüzeyi PBS (Biological Industries) ile yıkanarak hücreler 5 dakika boyunca tripsine (Biological Industries) maruz bırakıldı.

Tripsinizasyon sonrası flask yüzeyinden ayrılan hücreler üzerlerine medium eklenerek santrifüj tüpüne alındı ve yine 800 rpm’de 5 dakika santrifüj edildikten sonra pellet süspanse edilerek hücrelerin çoğalması için daha büyük bir alana sahip başka bir flaska ekildi. Devam edecek işlemler için gerekecek hücreler ise kryo tüpe alınarak azot tankında saklandı. Bu işlem için tripsinizasyon sonrası hücreler her kryo tüpte

1.000.000 hücre olacak şekilde ayarlandı ve santrifüj edildi. Pellet üzerine %90 FBS ve

%10 DMSO içeren dondurma mediumu eklenerek hücreler süspanse edildi ve kryo tüpe alındı. Kryo tüpler ise dondurma kabına (Nalgene-Mr. Frosty) yerleştirilerek -80 °C’ ye kaldırıldı. 24 saat sonra -80 °C’ de bekletilen hücreler azot tankına yerleştirildi.

2.6.4. Hücrelerin Sayımı

Çalışmada kullanılacak hücrelerin sayımı “Thoma lamı” adı verilen, üzerinde mikroskobik enine ve boyuna çizgilerin bulunduğu özel bir lam kullanılarak yapıldı.

Bunun için bir ependorf tüpün içine 0,9 ml santrifüj sonrası süspanse edilen hücreler ve 0,1 ml tripan mavisi (Sigma) eklenerek oda sıcaklığında 5 dakika bekletildi. Ardından üzerine lamel kapatılan Thoma lamına ependorf tüp içindeki karışımdan 10 µl alınırak sayım yapıldı. Hücrelerin mililitredeki sayısı;

“Hücre sayısı/ml= (Sayılan hücre miktarı X Dilüsyon oranı X 10⁴)/9” formülü kullanılarak hesaplandı.

2.6.5. Hücrelerin ELISA Pleytlerindeki Optimizasyonu

Çalışmada kullanılan hücrelerin morfolojileri, hücre- hücre etkileşimi ve dolayısıyla ELISA pleytlerindeki herbir kuyucukta kapladıkları alan sayısı çalışmanın sağlıklı olarak değerlendirilmesinde çok büyük bir önem taşır. Bu yüzden santrifüj sonrası süspanse edilen hücreler sayılarak belirli oranlarda seyreltilip ELISA pleytlerinin her bir kuyucuğuna ekildi. Hücrelerin ilaç etkileşimi ve normal büyüme hızları göz önüne alınarak MCF-7 için 10.000, PC-3 için 6.000 ve fibroblast için 8.000 hücre sayısı hücrelerin her bir kuyucukta büyüyebileceği optimum sayılar olarak belirlendi.

2.6.6. Hücreler Üzerindeki Etkisi İncelenecek Ekstraktların Optimizasyonu

Hücrelere etkisinin araştırılacağı bitki ekstraktlarının optimizasyonu yapılırken benzer çalışmalarda kullanılan dozlar denendi. Bunun için bitki ekstraktları DMSO’ da çözülerek 20 µg/ml, 200 µg/ml ve 1000 µg/ml olacak şekilde ara stoklar hazırlanarak 24, 48 ve 72 saatlik MTT deneyi yapıldı. Bu deney sonucunda elde edilen sonuçlara göre 20 µg/ml’lik ara stok konsantrasyonunun hücreler üzerinde bir etkisi olmadığı

görüldüğünden metanol ekstraktından 2000 µg/ml, 1800 µg/ml, 1600 µg/ml, 1400 µg/ml ve 1200 µg/ml’lik; kloroform ve hekzan ekstraktlarından ise 1400 µg/ml, 1200 µg/ml, 1000 µg/ml, 800 µg/ml ve 600 µg/ml’lik ara stoklar hazırlandı. Bu ara stoklar hücrelere verilmeden önce 0,22 µm‘ lik filtrelerden geçirilerek steril edildi.

2.6.7. MTT Test Metodu

MTT (Serva) testinin yapılması için gereken toplam hücre sayısı belirlendi ve hücreler bu sayıya ulaşana kadar flasklarda çoğaltıldı. Hücrelerin istenilen toplam sayıya ulaşmasından sonra tripsinizasyonla ekili oldukları flask yüzeyinden kaldırıldı ve santrifüjlendi. Santrifüj sonrası elde edilen pellet süspanse edilerek F tabanlı, ELISA pleytlerine ekim yapıldı. Hücre ve ilaç etkileşiminin sonuçlarını görmek için 24, 48 ve 72 saatlik düzenekler hazırlandı. 100 µl hücre her bir kuyucuğa ekildikten 24 saat sonra bütün kuyucuklara, belirlenen konsantrasyondaki ekstraktlardan 100 µl eklendi.

İlaçların eklenmesinden sonraki 24, 48 ve 72. saatlerde hücrelere herbir kuyucuktaki son konsantrasyon 0,5 mg/ml olacak şekilde ayarlanan 5 mg/ml konsantrasyonuna sahip MTT solüsyonu eklendi. Bu işlemden sonra invert mikroskop altında incelenen hücrelerin formazan kristalleri oluşturduğu gözlendi. Bu formazan kristallerini de çözmek için 100 µl isopropil alkol (Merck) kullanıldı ve formazan kristallerinin çözülmesiyle oluşan mor rengin absorbansı 570 nm’ de ELISA okuyucuda (Mikroquant-Biotek) okundu. Her bir deney birbirinden bağımsız bir set olarak 3 tekrarlı yapıldı. Deney düzeneğinde negatif kontrol olarak, belirlenen bazı kuyucuklara bitki ekstraktı eklenmedi. Elde edilen absorbans sonuçları değerlendirilirken, ekstrakt eklenerek ekstrakt etkileşimine bakılan kuyucuklardan elde edilen absorbans değerinin, ekstrakt eklenmeyen hücrelerin ekili olduğu kuyucuklardan elde edilen absorbans değerine oranı alındı. İlaçla etkileşime girmeyen negatif kontrolde kullanılan hücrelerin absorbansı %100 canlılık değeri olarak kabul edilirken, diğer kuyucuklardaki absorbansın bu absorbansa oranı o kuyucuktaki hücrelerin yüzde canlılığını verdi.

Çalışmalardan elde edilen veriler SPSS istatistik analiz programı kullanılarak standart hatalar belirlenmiştir. Elde edilen verilerin anlamlılığını belirlemek için ANOVA ve Tukey testi kullanılmıştır.

3. BÖLÜM

BULGULAR

3.1. Ekstraksiyon Verimi

Echinops orientalis türüne ait örneklerin kök kısımlarının ekstraksiyonu için metanol, kloroform ve hekzan olmak üzere üç değişik çözücü kullanılmıştır. Ekstraksiyon işlemi Soksolet cihazı ile yaklaşık 6 saat boyunca çözücünün rengi sabitlenene kadar gerçekleştirilmiştir. Kurutma işlemi vakum altında yapılmıştır. Metanol ekstraktından en yüksek miktarda kuru madde eldesi sağlanmıştır. Elde edilen verimlilik sonuçları Tablo 3.1.’ de gösterilmiştir.

Tablo 3.1. Ekstraktların verimlilik sonuçları

Kuru madde miktarı (gr)

Elde edilen özüt miktarı (gr)

Elde edilen özüt yüzdesi (%)

Metanol 12 1,15 9,5

Kloroform 12 0,277 2,3

Hekzan 12 0,117 0,9

3.2. Bitki Ekstraktlarının Antimikrobiyal Aktiviteleri

Echinops orientalis türüne ait metanol, kloroform ve hekzan ekstraktlarının disk-difüzyon denemeleri sonucunda elde edilen veriler değerlendirildiğinde bitki ekstraktlarının test edilen konsantrasyonlarda test edilen organizmaya karşı etkili olmadıgı tespit edilmiştir. Sadece S. epidermidis ve B. cereus bakterilerinde,

ekstraktların emdirildiği disklerin etrafında daha şeffaf bir bakteri zonu gözlenmiştir.

Negatif kontrol olarak ekstraktların çözüldüğü dimetilsülfoksid emdirilen disklerin hiçbir organizma üzerinde inhibisyon zonu oluşturmadığı görülmüştür. Standart antibiyotiklerin oluşturduğu zon çapları inhibisyon zon çapından disk çapı çkarılarak hesaplanmıştır. Standart antibiyotiklerin oluşturduğu zonlar ise Tablo 3.2.’ de verilmiştir.

Tablo 3.2. Standart antibiyotiklerin oluşturduğu zonlar

a: etki gözlenmemiştir b: etki gözlenmiştir

3.3. Mikrodilüsyon Sonuçları

Minimum inhibisyon konsantrasyonu denemelerinde organizmanın üremesini engelleyen konsantrasyon belirlenmeye çalışılmıştır. Negatif kontrol sütununa organizma eklenmemiş; sadece ekstraktlarının seri dilüsyonları aktarılmıştır. Bu sayede özütlerden kaynaklanabilecek bulanıklığın kontrolü sağlanmıştır. H sütununa ise sadece besiyeri ve organizma ilave edilerek pozitif kontrol olarak değerlendirilmiştir. Ancak, yapılan denemelerde mikrodilüsyon sonuçlarından da organizmaları öldürmeye yetecek bir konsantrasyon bulunamamıştır. Standart antibiyotiklerin MİK sonuçları Tablo 3.3., 3.4., 3.5. ve 3.6.’ da verildiği şekildedir.

Tablo 3.3. Ampisilin MİK sonuçları

a: etki gözlenmemiştir b: etki gözlenmiştir

Tablo 3.4. Tetrasiklin MİK sonuçları

a: etki gözlenmemiştir b: etki gözlenmiştir

Tablo 3.5. Trimetoprim MİK sonuçları

a: etki gözlenmemiştir b: etki gözlenmiştir

Tablo 3.6. Nistatin ve mikanazol MİK sonuçları

3.4. Bitki Ekstraktlarının Kültür Hücreleri Üzerine Etkileri

Bitkisel ekstraktların in vitro şartlarda meme kanseri hücre hattı MCF-7, prostat kanseri hücre hattı PC-3 ve kansersiz, sağlıklı hat olarak kullanılan fibroblast hücre hattına etkilerini araştırmak amacıyla yapılan bu çalışmada kullanılan ekstraktlar ve konsatrasyonlarıyla ilgili sonuçlar şu şekilde bulunmuştur.

3.4.1. Bitki Ekstraktlarının MCF-7 Hücre Hattı Üzerine Etkisi

Echinops orientalis bitkisinden elde edilen metanol, kloroform ve hekzan ekstraktlarının meme kanseri hücresi MCF-7 üzerindeki etkileri 24, 48 ve 72 saatlik deney düzenekleri kurularak incelenmiştir. Ekstraktların hücreler üzerindeki etkisini sayısal olarak ölçmek için MTT testi yapılmış ve hücreler her aşamada morfolojik olarak da değerlendirilmiştir. Ekstraktların hücreler üzerindeki etkisi Tablo 3.7.’ de özetlenmiştir.

Tablo 3.7.’ deki değerlere bakıldığında MCF-7 hücrelerinin %50’sini öldüren değerlerin 24 saatlik etkileşimle 1000 µg/ml’ lik metanol ekstraktı (Şekil 3.2.) ve 600 µg/ml’ lik (Şekil 3.3.) kloroform ekstraktının olduğu gözlenmiştir. Uygulanan dozlardan hiçbirisi MCF-7 hücrelerini tamamen öldürmeye yeterli olmamıştır. Yapılan istatistiksel değerlendirmeler sonucu 24, 48 ve 72 saatlik denemeler arasında önemli bir fark bulunmuştur (p<0,05 ANOVA). Tukey testine göre ise (Şekil 3.4.) metanolün 24 saatlik denemede 800 µ g/ml ile 700µg/ml’lik konsatrasyonları arasında, 48 saatlik denemede 700 µg/ml ile 600 µg/ml’ lik konsatrasyonları arasında ve 72 saatlik denemede 900 µg/ml, 800 µg/ml ile 700 µg/ml’ lik konsatrasyonlar arasında; kloroform ekstraktının 24 saatlik denemede 700 µg/ml ile 600 µg/ml’ lik konsatrasyonlar arasında, 48 saatlik denemede 600 µ g/ml ile 500 µg/ml’ lik konsatrasyonlar arasında; hekzan ekstraktının ise 24 saatlik denemede 600µg/ml, 500 µg/ml, 400 µg/ml ile 300 µg/ml’ lik konsatrasyonlar arasında, 48 saatlik denemede bütün konsantrasyonlar arasında ve 72 saatlik denemede 600 µ g/ml, 500 µg/ml, 400 µg/ml ve 300 µg/ml’lik konsantrasyonları arasında önemli bir fark olmadığı belirlenmiştir.

Tablo 3.7. Ekstraktların MCF-7 hücreleri üzerindeki etkisi

Şekil. 3.1. MCF-7 hücrelerinin 24 saat sonraki mikroskobik görüntüsü a. MTT uygulamasından önce, b. MTT sonrası formazan kristalleri (x20)

Şekil 3.2. 1000 µg/ml’ lik metanol ekstraktı uygulanan MCF-7 hücrelerinin 24 saat sonraki mikroskobik görüntüsü a. MTT uygulamasından

önce, b. MTT sonrası formazan kristalleri (x20)

Şekil 3.3. 600 µg/ml’lik kloroform ekstraktı uygulanan MCF-7 hücrelerinin sonraki mikroskobik görüntüsü a. MTT uygulamasından önce,

b. MTT sonrası formazan kristalleri (x20)

Şekil 3.4. MCF-7 hücrelerinin Tukey testi sonuçları

3.4.2. Bitki Ekstraktlarının PC-3 Hücre Hattı Üzerine Etkisi

Echinops orientalis bitkisinden elde edilen metanol, kloroform ve hekzan ekstraktların prostat kanseri hücresi PC-3 üzerindeki etkileri 24, 48 ve 72 saatlik deney düzenekleri kurularak incelenmiştir. Ekstraktların hücreler üzerindeki etkisini sayısal olarak ölçmek için MTT testi yapılmış ve hücreler her aşamada morfolojik olarak da değerlendirilmiştir. Ekstraktların hücreler üzerindeki etkisi Tablo 3.8.’ de özetlenmiştir.

Tablo 3.8. değerlere bakıldığında PC-3 hücrelerinin %50’sini öldüren dozların 24 saatlik etkileşimle 900 µg/ml’lik metanol (Şekil 3.4.) ve 300 µ g/ml’ lik kloroform (Şekil 3.5.) ekstraktlarının olduğu söylenebilir. Hekzan ekstraktının ise 24 saatlik etkileşimle 700 µg/ml, 600 µg/ml, 500 µg/ml ve 400 µg/ml konsantrasyonlarının ve 48 saat etkileşimle 700 µg/ml, ve 600 µg/ml konsantrasyonları hücreleri tamamen öldürmeye yeterli bulunmuştur. Yapılan istatistiksel değerlendirmeler sonucu 24, 48 ve 72 saatlik denemeler arasında önemli bir fark bulunmuştur (p<0,05 ANOVA). Tukey testine (Şkeil 3.8.) göre ise metanolün 24 saatlik denemede 800 µg/ml, 700µg/ml ile 600 µg/ml’lik konsatrasyonları arasında, 48 saatlik denemede 900 µg/ml, 800 µg/ml, 700 µg/ml ile 600 µ g/ml’ lik konsatrasyonları arasında ve 72 saatlik denemede 1000 µg/ml, 900 µg/ml, 800 µg/ml ile 700 µg/ml’ lik konsatrasyonlar arasında; kloroform ekstraktının 24 saatlik denemede 600 µg/ml ile 500 µg/ml’ lik konsatrasyonlar arasında, 48 saatlik denemede 600 µg/ml, 500 µg/ml ile 400 µg/ml’ lik konsatrasyonlar arasında;

hekzan ekstraktının ise 24 saatlik denemede 700µg/ml, 600 µ g/ml, 500 µg/ml ile 400 µg/ml’ lik konsatrasyonlar arasında, 48 saatlik denemede 700 µ g/ml, 600 µg/ml ile 500 µg/ml’ lik konsatrasyonlar arasında ve 72 saatlik denemede 700 µg/ml, 600 µg/ml, 500 µg/ml ve 300 µg/ml’lik konsantrasyonları arasında önemli bir fark olmadığı belirlenmiştir.

Tablo 3.8. Ekstraktların PC-3 hücreleri üzerine etkisi

Metanol Ekstraktı Yaşama

yüzdeleri

Uygulanan konsantrasyonlar

1000 µg/ml 900 µg/ml 800 µg/ml 700 µg/ml 600 µg/ml

24 saat 37±0,6 48±0,3 62±2,4 70±0,6 72±0,6

48 saat 9±0,88 10±1,2 12±1,5 14±2,0 16±0,8

72 saat 3±0 4±0,3 5±0,6 10±0,5 15±1,15

Kloroform Ekstraktı Yaşama

yüzdeleri

Uygulanan konsantrasyonlar

700 µg/ml 600 µg/ml 500 µg/ml 400 µg/ml 300 µg/ml

24 saat 24±1,4 37±0,3 38±0,81 44±0,3 48±0,8

48 saat 1±0,57 15±0,8 16±0 17±0,6 34±0,3

72 saat 1±0 4±0,8 15±0,8 21±1,15 37±2,3

Hekzan Ekstraktı Yaşama

yüzdeleri

Uygulanan konsantrasyonlar

700 600 500 400 300

24 saat - - - - 17±0,3

48 saat - - 1±0,6 7±0,5 15±3,17

72 saat 1±0 3±1,0 3±0,6 10±0,3 16±1,0

Şekil 3.5. PC-3 hücrelerinin 24 saat sonraki mikroskobik görüntüsü a. MTT uygulamasından önce, b. MTT sonrası formazan kristalleri (x20)

Şekil 3.6. 900 µg/ml’ lik metanol ekstraktı uygulanan PC-3hücrelerinin 24 saat sonraki mikroskobik görüntüsü a. MTT uygulamasından

önce, b. MTT sonrası formazan kristalleri (x20)

Şekil 3.7. 300 µg/ml’ lik kloroform ekstraktı uygulanan PC-3 hücrelerinin 24 saat sonraki mikroskobik görüntüsü a. MTT uygulamasından

önce, b. MTT sonrası formazan kristalleri (x20)

Şekil 3.8. PC-3 Hücrelerinin Tukey testi sonuçları

3.4.3. Bitki Ekstraktlarının Fibroblast Hücreleri Üzerine Etkisi

Echinops orientalis bitkisinden elde edilen metanol, kloroform ve hekzan ekstraktlarının kansersiz hücre hattı olan fibroblast hücresi üzerindeki etkileri pozitif kontrol olarak 24, 48 ve 72 saatlik deney düzenekleri kurularak incelenmiştir.

Ekstraktların hücreler üzerindeki etkisini sayısal olarak ölçmek için MTT testi yapılmış ve hücreler her aşamada morfolojik olarak da değerlendirilmiştir. Ekstraktların hücreler üzerindeki etkisi Tablo 3. 9.’ da özetlenmiştir.

Tablo 3. 9. Ekstraktların Fibroblast hücreleri üzerine etkisi

Metanol Ekstraktı

Tablo 3.9.’ daki değerlere bakıldığında fibroblast hücrelerinin %50’ sini öldüren dozların 24 saatlik etkileşimle 800 µg/ml’ lik metanol (Şekil 5.6.) ve 700 µg/ml’ lik kloroform ekstraktlarının (Şekil 5.7.) olduğu gözlenmiştir. Metanol ekstraktının ise 72 saatlik etkileşimle 1000 µg/ml ve 900 µg/ml’ lik konsantrasyonları hücreleri tamamen öldürmeye yeterli bulunmuştur. Yapılan istatistiksel değerlendirmeler sonucu 24, 48 ve 72 saatlik denemeler arasında önemli bir fark bulunmuştur (p<0,05 ANOVA). Tukey testine (Şekil 3.12.) göre ise metanolün 24 saatlik denemede 1000 µ g/ml, ile 900 µg/ml’lik konsatrasyonları arasında, 48 saatlik denemede 900 µg/ml ile 800 µg/ml ve 700 µg/ml ile 600 µg/ml’ lik konsatrasyonları arasında ve 72 saatlik denemede 1000 µg/ml ile 900 µg/ml’ lik konsatrasyonlar arasında; kloroform ekstraktının 24 saatlik denemede 400 µg/ml ile 300 µg/ml’ lik konsatrasyonlar arasında, 48 saatlik denemede 600 µg/ml, 500 µg/ml ile 400 µg/ml’ lik konsatrasyonlar arasında önemli bir fark olmadığı belirlenmiştir.

Şekil 3.9. Fibroblast hücrelerinin 24 saat sonraki mikroskobik görüntüsü a. MTT uygulamasından önce, b. MTT sonrası formazan kristalleri (x20)

Şekil 3.10. 800 µg/ml’ lik metanol ekstraktı uygulanan fibroblast hücrelerinin 24 saat sonraki mikroskobik görüntüsü a. MTT uygulamasından önce, b.

MTT sonrası formazan kristalleri (x20)

Şekil 3.11. 700 µg/ml’ lik kloroform ekstraktı uygulanan fibroblast hücrelerinin 24 saat sonraki mikroskobik görüntüsü a. MTT uygulamasından önce, b.

MTT sonrası formazan kristalleri (x20)

Şekil 3.12. Fibroblast hücrelerinin Tukey testi sonuçları

Bütün tablolardaki değerler birlikte değerlendirildiğinde metanol ekstrakt konsatrasyonunun, kloroform ve hekzan ekstrakt konsantrasyonlarından fazla olmasına rağmen MCF-7 ve PC-3 hücrelerinin yaşama yüzdesinin daha yüksek olduğu görülmektedir. Fibroblast hücrelerinde ise tam tersi bir durum söz konusudur. Metanol ekstraktı fibroblast hücrelerini diğer hücreleri etkilediğinden daha fazla etkilemiştir.

Kloroform ve hekzan ekstraktları karşılaştırıldığında ise hekzan ekstraktının çalışılan üç hücre üzerinde de daha ölümcül bir etkiye sahip olduğu görülmektedir.

Ayrıca 24, 48 ve 72 saatlik sonuçlar karşılaştırıldığında hücrelerin ekstraktla etkileşim zamanının artmasıyla birlikte hücre ölümlerinin de arttığı söylenebilir.

Hücrelerin MTT uygulaması öncesi ve sonrası, formazan kristallerinin oluştuğu zaman, yapılan mikroskopik incelemede ise, ekstrakt etkileşimine bağlı olarak hücrelerin morfolojilerinin değiştiği ve daha yuvarlak bir hal aldıkları görülmüştür. Ayrıca metanol ekstraktının diğer ekstraktlara oranla hücre şeklerinin bozulmasında daha az etkili olduğu saptanmıştır.

4. BÖLÜM

TARTIŞMA–SONUÇ VE ÖNERİLER

İnsanların yüzyıllardır kullandıkları ve faydalı olduğunu düşündükleri bitkilerin gerçekten etkili olup olmadıklarını araştırmak, kullanılan sentetik ilaçların toksik etkisi, bakterilerin antibiyotik direnci geliştirmesi ve kanser hücrelerinin ilaçlara dirençlilik gösterebilmesi tıbbi bitkilerin tedavi edici özellikleri üzerindeki araştırmalara yoğunluk kazandırmıştır [15]. Literatürde Echinops cinsi üyelerinin antimikrobiyal ve antikanserojen aktiviteleri üzerine yapılmış çalışmalar sınırlı sayıdadır ve Echinops orientalis türü üzerine yapılmış bir çalışmaya rastlanmamıştır.

Yapılan bu çalışmada, Türkiye’ nin karasal bölgelerinde daha genel yayılışa sahip Echinops orientalis türüne ait örneklerin kök kısmından elde edilen ekstraktların, in vitro antimikrobiyal ve antikanserojen aktivitesi incelenmiştir.

4.1. Ekstraksiyon Verimi

Echinops orientalis örnekleriyle yapılan üç çözücü ekstraksiyon verimi karşılaştırıldığında metanol ekstraksyonu veriminin diğer organik çözücülerden en az 4-10 kat daha fazla olduğu gözlenmiştir. En düşük verim yüzdesi ise % 0.9 ile hekzan ekstraksyonlarında olduğu gözlemlenmiştir. Erdoğan ve ark. yaptıkları çalışmada da Echinops cinsi bitki türleri, aynı çözücülerle ekstrakte etmiş ve en düşük verim hekzanda, en yüksek verim ise metanolde bulmuşlardır. Metanol gibi alkol türevli bileşik, antosiyanin, terpenoid, saponin, tanin, ksantoksilin (xanthoxylline), totarol, kuassinoid, lacton, flavon, fenon ve polifenolleri; kloroform gibi klorlu bileşikler

Belgede ECHINOPS ORIENTALIS TRAUTV. BİTKİSİNİN KÖKÜNDEN ELDE EDİLEN EKSTRAKTLARIN ANTİMİKROBİYAL VE ANTİKANSEROJEN ETKİSİNİN İNCELENMESİ (sayfa 41-0)