3. Hücre Kültürü
3.6. Hücre Kültür Mediumları
3.6.1. Fizikokimyasal Özellikleri
Hidrojen İyonu (pH): Hücrelerin kültür ortamında yaşatılabilmesi için hidrojen iyonu konsantrasyonu oldukça önemlidir. Hücrelerin birçoğu pH 7.4’ te iyi bir şekilde büyürler. Bununla beraber hücre hattına göre çeşitli pH değerlerinden de söz edilebilir.
Mediumların birçoğunun içinde pH indikatörü olarak fenol kırmızısı bulunur. Medium rengi kırmızı iken pH 7.4 tür. Mediumun turuncuya dönüşmesi pH’ ın 7.0, sarıya dönüşmesi ise pH’ ın 6.5 civarlarında olduğunu gösterir. pH 7.6 gibi yüksek pH’ a sahip mediumlarda ise mediumun rengi koyu kırmızı-pembe bir renk alır [27].
Karbondioksit ve Bikarbonat: Karbondioksit HCO3
iyonlarıyla dengeyi kurmak için, gaz fazında iken medium içinde çözünür ve laktik asitin de artmasıyla mediumun pH’ ı düşer. Çözünmüş CO2, HCO3-
ve pH birbiriyle ilişkili olduğu için CO2’ in direk etkisini kontrol etmek zordur. Ortamın pH’ ının sabit kalabilmesi için CO2 ve H2CO3 tampon sistemleri kullanılır. Karbondioksitin H2CO3 oluşturduğu denklem şu şekilde gösterilebilir:
H2O + CO2 ↔H2CO3 ↔H+ + HCO3−
Mediumlara bu dengeyi korumak için CO2, NaHCO3 veya HEPES ilave edilir.
Bikarbonat tamponlarıyla karşılaştırıldığında daha ucuz ve daha az toksik olduğundan son yıllarda tamponların en iyilerinden birisi olarak kabul edilen HEPES‘ in kullanımı oldukça yaygındır [27].
Oksijen: Diğer bir önemli bileşen ise gaz formundaki oksijendir. Oksijen oranının artması hücrelerde toksik etki oluşturmasının yanısıra %95 oksijene ihtiyaç duyan hücreler olduğu gibi; %5’e kadar inen düşük oksijen seviyelerinde yaşayan insan mezenkimal kök hücreleri ve insan embriyonik akciğer fibroblastları gibi hücreler de mevcuttur [27].
Osmolarite: Birçok hücre osmotik basınca oldukça dayanıklıdır. İnsan plasması yaklaşık olarak 290 mOsm/kg’dır. Osmolaritedeki ± 10 mOsm/kg’lık bir değişim tolere edilebilir. Mediumun hazırlanmasında osmolarite oldukça önemlidir ve ölçümü için osmometre kullanılır [27].
Sıcaklık: Hücre kültürleri için sıcaklık hücrelerin elde edildiği organizmanın sıcaklığına bağlıdır. Bu yüzden sıcakkanlı hayvanlardan elde edilen hücrelerde optimum sıcaklık 37
°C’ dir. Memeli hücrelerinin kültürlerinde hücreler 4 °C’ de birkaç gün yaşayabilir ve kademeli olarak soğutulduklarında -196 °C’ de dondurulabilirler. Kuşlar gibi daha yüksek sıcaklığa sahip hayvanların hücreleri 38,5 °C’ de canlılıklarını sürdürürler.
Soğukkanlı hayvanların kültüre edilen hücreleri ise 15 -26 °C’ de yaşayabilirler [27].
Vizkozite: Vizkozite hücre kültürlerinde, hücrelerin çalkalanması veya hücrelerin tripsinizasyon sonrası ayrılmasında önemi bir rol oynar. Mediumlardaki vizkozite daha çok serum ile sağlanır [27].
3.6.2. PBS ( Fosfatla Tamponlanmış Tuz Solüsyonu )
İnorganik tuzlardan oluşan PBS, sodyum bikarbonat veya glukoz içerebilir. Genellikle tripsinizasyon öncesinde mediumun tripsin aktivitesini düşürmesini engellemek için hücreleri yıkamada kullanılır. İzotonik bir solüsyon olduğundan hücrelere zarar vermez.
3.6.3. Medium ve İçerikleri
Kültüre edilen hücreler besin ihtiyaçlarını mediumdan sağlarlar. Mediumlar hücre hatları için çeşitlilik gösterdiğinden mediumlara eklenen destekleyici içerikler de değişiklik gösterir. Bu yüzden mediumlar basal mediumlar ve tamamlanmış mediumlar
olarak ikiye ayrılırlar. Bazal mediumlarda hücrelerin yaşaması için gerekli bütünleyici içerikler olmadığından tek başına hücrelerin yaşatılabilmesi için uygun değildirler.
Tamamlanmış mediumlar ise hücre hattına göre değişen gerekli bütünleyici içerikleri ile hücrelerin yaşatılmasına yardımcı olurlar. Bütünleyici içerikler şu şekilde sıralanabilir:
Aminoasitler: Aminoasit konsantrasyonu hücrelerin yaşaması ve büyümesinde önemlidir. Hücre tipine göre değişse de genel olarak kullanılan zorunlu amino asitler sistein, arjinin, glutamin ve tirozindir. Hücre için en çok kulanılan amino asit ise glutamindir. Ancak glutaminin yarılanma ömrü kısadır ve ürettiği amonyak sebebiyle toksik bir etkiye neden olabilir. Çeşitli firmalarca glutamin yerine kullanılabilecek daha stabil bir yapıya sahip olan bileşikler de vardır [27].
Vitaminler: B grubu vitaminler, folik asit, inositol, biotin, nicotinamit, A, D, E, K vitaminleri ve kolin gibi çeşitli mediumlarda bulunan çeşitli vitaminler hücre canlılığının devamı için önemlidir [27].
Tuzlar: Na+, K+, Mg2+, Ca2+, Cl-, SO42
-, PO43
-, HCO3- tuzları mediumun osmolaritesine katkıda bulunan tuzlardır. Özellikle Ca+ sinyal iletiminde rol alıp, hücrelerin büyümesi ve çoğalmasında etkili olduğu için oldukça önemli bir tuzdur. Birçok medium orijinal olarak kendi tuz konsantrasyonuna sahiptir [27].
Glukoz: Enerji kaynağı olarak kullanılan glukoz, birçok mediumda kendiliğinden bulunur. Glikolizle laktata dönüşen pirüvat oluşumunu metabolize edebilir, sitrik asit döngüsüne katılarak CO2 ve su okside edebilir [27].
Organik Bileşenler: Hücre mediumunda bulunan diğer bileşenler ise protein, peptit, nükleosit, piruvat ve lipitlerdir. İçeriği indirgenmiş serumlarda bu organik bileşenler hücre devamlılığı açısından önem taşır [27].
Hormonlar ve Büyüme Faktörleri: Hormonlar ve büyüme faktörleri her medium için gerekli değildir, daha çok serum içermeyen mediumlarda kullanılır.
Antibiyotikler: Hücre kültürlerinde aseptik koşullar oldukça önemlidir. Kullanılan malzemeler ile ortamın sterilitesi ve çalışanların temizliği hücrelerin sağlıklı bir şekilde yaşamaları için elzemdir. Bu nedenle mediumların içerisine mikroorganizmaların üremesini engellemek için çeşitli antibiyotikler eklenir. Hücre kültür laboratuarlarında en çok görülen kontaminasyon sebebi bakterilerin özellikle de mikoplazmaların yol açtığı kontaminasyonlardır. Bunlar için de genelde streptomisin, penisilin ve gentamisin gibi antibiyotikler kullanılır.
Serum: Büyüme faktörleri içeren serumlar, hücre bölünmesinin indüklenmesini ve antitripsin özelliği ile de hücrelerin adezyonunu sağlarlar. Aynı zamanda birçok hormonun, lipitin ve mineralin kaynağıdır. Mediumlarda daha çok büyükbaş hayvanlardan elde edilen serumların kullanılmasının yanısıra atlardan ve nadiren insanlardan elde edilen serumlar da kullanılabilir. Ancak kullanılmadan önce bu serumların HIV ve Hepatit B gibi virüsler açısından kontrol edilmiş olması gereklidir.
Ayrıca bazı serumlar yine kullanımdan önce ısı ile inaktive edilerek mikoplazmalara karşı önlem alınmalıdır. Serumsuz olarak kullanılan mediumlar da vardır.