FEBR‹L NÖTROPEN‹L‹ HASTALARDA KAND‹DAYA ÖZGÜL TAQ-MAN PZR'IN ‹NVAZ‹V FUNGAL ‹NFEKS‹YON TANISINDAK‹ DE⁄ER‹*,**

(1)

ÖZET

Kocaeli Üniversitesi T›p Fakültesi Hastanesi'nde izlenen, 3 gün antibakteriyel tedaviye yan›t vermeyen, European Or- ganisation for Research and Treatment of Cancer/Mycosis Study Group (EORTC/MSG) kriterlerine göre olas› ve yüksek ola- s›l›kl› fungal infeksiyonu düflünülen febril nötropenik hastalarda, Taq-Man Polimeraz Zincir Reaksiyonu yöntemi (Taq-Man PZR) ile Candida türlerinin varl›¤› araflt›r›lm›flt›r. 2002-2004 y›llar› aras›nda 33 hastadan, 8'i pediatrik olmak üzere 34 serum örne¤i al›nm›flt›r. Tüm mantar türlerinde ortak olan 5.8S ve 28S rDNA'ya yönelik primerler ve tüm Candida türlerini saptamaya yönelik probe (All-CAN-TET) kullan›lm›flt›r. Serum örnekleri, primer ve SYBR Green I boyas› kullan›larak ger- çek zamanl› PZR metodu ile tekrar edilmifltir.

Bu yöntem ile sadece bir (% 2.9) rabdomiyosarkomlu çocuk hastada Candida DNA's› saptanm›flt›r. Hiç bir hastan›n kan kültüründe üreme olmam›flt›r.

‹nvaziv kandidozun tan›s›nda kültür ve serolojik testler ile birlikte hastal›¤›n erken döneminde yap›lan Candida özgün PZR testi prognoz ve tedavide yol gösterici olacakt›r.

Anahtar sözcükler: Candida albicans, febril nötropeni, polimeraz zincir reaksiyonu, Taq-Man PZR

SUMMARY

The Value of Candida Specific Taq-Man PCR in Diagnosis of Invaziv Fungal Infections of Febrile Neutropenic Patients

In the febrile neutropenic patients who were not responsive to antibiotic therapy for three days and suspicious of pro- bable and high risk fungal infection were investigated for the presence of Candida spp. by Polimerase Chain Reaction (PCR) according to European Organisation for Research and Treatment of Cancer/Mycosis Study Group (EORTC/MSG). Totally 34 serum samples (8 pediatric) from 33 febrile neutropenic patients followed in the University Hospital of Kocaeli University were collected from 2002 to 2004. Candida DNA was investigated by Taq-Man PCR using common fungal primers that de- tect 5.8S and 28s rDNA and a probe (ALL CAN-TET) that detects all Candida spp. All serum samples were also studied by real-time PCR using primer and SYBR Green I dye. Candida DNA was positive only in one (2.9 %) pediatric patient with rabdomyosarcoma. There was no growth in blood cultures of patients. In the diagnosis of invasive candidiasis, Candida spe- sific PCR tests which were carried out at early stages with culture and serologic tests will be helpful in prognosis and treatment.

Keywords: Candida albicans, febrile neutropenia, polymerase chain reaction, Taq-Man PCR

FEBR‹L NÖTROPEN‹L‹ HASTALARDA KAND‹DAYA ÖZGÜL TAQ-MAN PZR'IN ‹NVAZ‹V FUNGAL ‹NFEKS‹YON TANISINDAK‹ DE⁄ER‹*,**

Fatma BUDAK*, Sema KEÇEL‹ ÖZCAN*, Birsen MUTLU**, Haluk VAHABO⁄LU**

*Kocaeli Üniversitesi T›p Fakültesi, Mikrobiyoloji ve Klinik Mikrobiyoloji Anabilim Dal›, Umuttepe, KOCAEL‹

**Kocaeli Üniversitesi T›p Fakültesi, Klinik Bakteriyoloji ve ‹nfeksiyon Hastal›klar› Anabilim Dal›, Umuttepe, KOCAEL‹

Yaz›flma adresi: Fatma Budak. Kocaeli Üniversitesi T›p Fakültesi, Mikrobiyoloji ve Klinik Mikrobiyoloji Anabilim Dal›, Umuttepe Kampüsü, KOCAEL‹

Tel.: (0262) 303 75 42, GSM: (0505) 593 97 85 e-posta: fatma.budak@isbank.net.tr Al›nd›¤› tarih: 21.12.2006, revizyon kabulü: 31.01.2007

*Bu çal›flma Kocaeli Üniversitesi T›p Fakültesi Bilimsel Araflt›rmalar Merkezi (Proje no.2003/41) taraf›ndan desteklenmifltir.

**XII. Türk Klinik Mikrobiyoloji ve ‹nfeksiyon Hastal›klar› (KL‹M‹K 2005) Kongresi'nde sunulmufltur (16-20 Kas›m 2005, Antalya)

(2)

G‹R‹fi

‹nvaziv mantar infeksiyonlar›, özellikle transplant ve hematolojik kanser hastalar› olmak üzere önemli morbidite ve mortalite nede- nidir. ‹nvaziv mantar infeksiyonu etkeni olarak nötropenik hastalarda en s›k Candida türleri gözlenmektedir^(8,13). ‹nvaziv Candida infeksiyonlar›n›n tan›s› kan kültürü, serolojik olarak Candida mannan antijenin gösterilmesi, histopa- tolojik preperatlarda Candida'ya ait hif, psödohif veya blastokonidiumlar›n görülmesi, radyolojik olarak özgül görüntülerin saptanmas› ve klinik bulgular›n varl›¤› ile konmaktad›r. Candida tür- leri kan kültürlerinin % 8-15'inden izole edilmektedir. Son y›llarda, kültürde üretilemeyen mantar infeksiyonu etkenlerinin moleküler yön- temler kullan›larak gösterilmesi önemli avantaj- lar getirmifltir.

Bu çal›flmada, hastanemizde yatan invaziv mantar infeksiyonu flüphesi olan febril nötrope- nili hastalarda bir gerçek zamanl› Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PZR) yöntemi olan Taq-Man PZR ile Candida DNA's›n›n gösterilmesi amaç- lanm›flt›r.

GEREÇ VE YÖNTEM

Olgular: Vücut ›s›s› oral veya aksiller tek sefer 38.3°C ve üstü veya bir saat süreyle 38°- 38.2°C aras› olarak ölçülen ve nötrofil düzeyi 500/mm³alt›nda olan hastalar febril nötropenik olarak kabul edilmifltir. Çal›flmaya al›nan hastalar European Organisation for Research and Treatment of Cancer/Mycosis Study Group (EORTC/MSG) rehberine göre s›n›fland›r›lm›fl- t›r⁽²⁾. Buna göre; en az›ndan bir konak kriteri ve infeksiyon ile iliflkili bir klinik kriteri (mikrobi- yolojik kriter yok) olan hastalar olas› veya dü- flük olas›l›kl› invaziv fungal infeksiyon (‹F‹) olarak de¤erlendirilmifltir. Bunlardan toplam 34 serum örne¤i al›nm›flt›r. Kocaeli Üniversitesi Etik Kurul Onay› al›nm›flt›r.

Kocaeli Üniversitesi T›p Fakültesi Hasta- nesi Çocuk Hematoloji-Onkoloji Servisi'nde 2002-2004 y›llar› aras›nda izlenen, febril nötro- penik atak geçiren ve antibiyotik tedavisine ya-

n›t vermeyen 7 hastadan, birinden iki olmak üzere, 8 kan örne¤i al›nm›flt›r. Yedi hastam›z›n 3'ünde akut lenfoblastik lösemi (ALL), 2'sinde rabdomiyosarkom, birinde akut miyeloblastik lösemi (AML), birinde non-Hodgkin lenfoma tan›s› konmufltur. Hastalar›n ataklar› s›ras›nda sefepim, karbapenem ve seftazidim, gerekti¤inde glikopeptid ve antifungal kombinasyonlar›

uygulanm›flt›r.

Kocaeli Üniversitesi T›p Fakültesi Hasta- nesi ‹ç Hastal›klar› Anabilim Dal› Hematoloji Servisinde 2002-2004 y›llar› aras›nda izlenen febril nötropenik atak geçiren 26 hastadan kan örne¤i al›nm›flt›r. Hastalar›n 20'sine hematolojik malignensi, 6's›na AML tan›s› konmufltur. Yir- mialt› hastaya febril nötropeni ata¤› s›ras›nda piperasilin/tazobaktam+amikasin, gerekti¤inde glikopeptid ve antifungal kombinasyonlar›

uygulanm›flt›r.

Kan kültürü: Üç gün antibiyotik tedavisi sonunda, atefli halen düflmeyen hastalardan antifungal tedaviye bafllamadan kan örne¤i al›na- rak BACTEC (9050 B-D, Maryland, ABD) kan kültür fliflelerine ekim yap›lm›flt›r. Al›nan kan›n 5 ml'si 15000 g'de 10 dak. santrifüj edilerek serumu ayr›l›p çal›flma yap›lana kadar -80°C'de sak- lanm›flt›r. Hemolizli serum örnekleri çal›flma d›- fl› b›rak›lm›flt›r.

DNA izolasyonu: Serumlardan ve pozitif kontrollerden fenol/kloroform yöntemi ile DNA izolasyonu yap›lm›flt›r⁽¹⁴⁾. Serum miktar›- na eflit hacimde lizis tampon [6 M guanidyum siyanat 50 mM Tris-HCl (pH:8), % 20 sarkosil, 5 M sodyum asetat] konularak 10 dak. kaynar su banyosunda tutulmufltur. Üzerine fenol kloroform/izoamil alkol konmufl ve 10 dak. 14000 g'de santrifüje edilmifltir. Daha sonra süperna- tant al›nm›fl ve üzerine izopropanolol eklenerek 15 dak. oda ›s›s›nda beklenmifltir. Tekrar 10 dak.

14000 g'de santrifüj iflleminden sonra süperna- tant at›lm›flt›r. Pelet üzerine % 70 alkolden 1 ml konularak 5 dak. 14000 g'de santrifüje edilmifl ve süpernatant at›lm›flt›r. Pelet oda ›s›s›nda 5 dak. kurutularak 30 µl TE tamponu ile çözül- müfltür .

Taq-Man PZR yöntemi: Tüm mantar tür- lerinde ortak olan 5.8S ve 28S rDNA'ya yönelik primerler ITS3 (5'GCATCGATGAAGAACG-

(3)

CAGC-3') ve ITS4 (5'TCCTCCGCTTATTGA- TATGC-3')⁽¹⁸⁾ ve tüm Candida türlerini saptamaya yönelik prob All-CAN-TET (5'TET-AGG- GCATGCCTGTTTGAGCGTC3'-P-TAMRA)⁽¹⁵⁾ kullan›larak Taq-Man PZR (Techne, Quantica) yöntemi ile Candida DNA's› araflt›r›lm›flt›r. Her kuyucu¤a 5 µl örnek DNA's›, 25 µl Taq-Man PZR kar›fl›m› konmufltur. Her reaksiyonda C.albicans ATCC 90028, C.krusei ATCC 6258 ve C.pa- rapsilosis ATCC 22019 sufllar› 10⁶hücre/ml'den, 10¹ hücre/ml'e kadar seri suland›r›lm›fl ve bu suland›r›mlardan izole edilen DNA'lar standart olarak kullan›lm›flt›r. Sa¤l›kl› kiflilerin serumu- na, kontrol sufllar›n›n dilüsyonlar› direkt olarak konmufltur. Her reaksiyonda negatif kontrol ek- lenmifltir. Tüm örnekler, primer ve SYBR-Green I boyas› kullan›larak gerçek zamanl› PZR metodu ile tekrar çal›fl›lm›flt›r. PZR sonuçlar› kan kültür sonuçlar› ile karfl›laflt›r›lm›flt›r.

BULGULAR

Çal›flmam›za al›nan hastalar›n 34'ü EORTC/MSG rehberine göre olas› ‹F‹ olarak de¤erlendirilmifltir. Rabdomiyosarkomlu bir ço- cuk hastada Taq-Man PZR ve SYBR-Green ile gerçek zamanl› PZR yöntemiyle Candida DNA's›

saptanm›flt›r (% 2.9). Bu hastada mutlak nötrofil say›s› 10/mm³olarak bulunmufl, akci¤er maye- nesinde raller duyulmufl ve Streptococcus pneumo- niae bakteriyemisi saptanm›flt›r. Hasta teikopla- nin ve lipozomal amfoterisin-B tedavisi görerek flifa ile taburcu edilmifltir. Taq-Man PZR ile kontrol sufllar›n›n dilüsyonlar› direkt kondu¤unda 10³ hücre/ml'ye kadar pozitiflik gözlenirken, DNA izolasyonu sonras› 10⁴ hücre/ml'e düfl- müfltür.

Hiçbir hastan›n kan kültüründe üreme saptanmam›flt›r.

TARTIfiMA

‹nvaziv mantar infeksiyonlar›, ba¤›fl›kl›k sistemi bask›lanm›fl hastalarda morbidite ve mortaliteyi artt›rmaktad›r. Bu nedenle, bu hasta grubunda mantar infeksiyonlar›n›n erken tan›

ve tedavisi hayat kurtar›c› olmaktad›r. ‹nvaziv mantar infeksiyonlar›n›n etkeni olan mantarlar, s›kl›k s›ras›na göre Candida ve Aspergillus ve dimorfik mantar türleridir. ‹nvaziv mantar infeksiyonlar›n›n tan›s›nda geleneksel yöntemler olan mikroskobik inceleme, kan kültürü, antijen veya antikor tayini gibi yöntemler kullan›lmaktad›r^(4,12). Ayr›ca, bütün infeksiyon hastal›klar›- n›n tan›s›nda oldu¤u gibi mantar infeksiyonla- r›nda da moleküler yöntemler kullan›larak önemli geliflmeler kaydedilece¤i vurgulanm›fl- t›r⁽¹⁾. Bununla birlikte, moleküler yöntemler geleneksel yöntemleri tamamlay›c› teknikler olarak kabul edilmektedir. Candida PZR yöntemi tan› amaçl› olarak az say›da baz› üniversite has- tanelerimizde kullan›lmaktad›r.

1990'lar›n bafl›ndan itibaren, immunsüpre- se hastalarda Candida infeksiyonlar›n tan›s›nda kullan›lan moleküler yöntemler araflt›rma labo- ratuvarlar›n deneyimi olarak sunulmaya bafl- lanm›flt›r. Yap›lan bir çal›flmada, pozitif kan kültür fliflelerinde uygulanan PZR-EIA (Enzim Immun Assay) yöntemi ile Candida pozitifli¤i % 42.4 oran›nda bulunmufltur⁽¹⁵⁾. Hematolojik maligniteli hastalar›n febril nötropenik ataklar›

s›ras›nda al›nan serum örneklerinde restriksi- yon enzim analizine dayanan PZR yöntemi ile

% 43 oran›nda Candida pozitifli¤i bulunmufltur⁽¹³⁾. Bu yöntemin yüksek negatif prediktif de¤eri bulunmufltur (% 97.5). Baflka bir çal›flmada ise invaziv mantar infeksiyonu olan 36 hasta- n›n 214 serum örne¤inde % 14.9 oran›nda Candi- da gerçek zamanl› PZR pozitifli¤i (duyarl›l›¤›

% 95, özgüllü¤ü % 97) bulunmufltur⁽¹⁷⁾. Einsele ve ark.⁽⁵⁾ Candida ile kolonize olan hastalarda, 28S rRNA'ya yönelik moleküler prob kullan›larak PZR ile % 1.5 oran›nda pozitiflik saptam›fl- lard›r. Bu yöntemin duyarl›l›¤› % 100, özgüllü-

¤ü % 98 olarak belirlenmifltir. Gerçek zamanl›

PZR yöntemleri k›sa sürede sonuç vermesi ve fungal yükün saptanmas› ile tedavinin izlenme- si aç›s›ndan önemlidir⁽¹⁰⁾. Ayr›ca gerçek zaman- l› PZR ile yap›lan bir çal›flmada Candida spp. için amplifikasyonun % 100 spesifik oldu¤u belirtil- mifltir⁽⁹⁾. Ülkemizde yap›lan bir çal›flmada ger- çek zamanl› PZR ile ba¤›fl›kl›k sistemi bask›lan- m›fl 50 hasta serumunun % 26's›nda fungal pa- tojen pozitifli¤i saptanm›flt›r⁽⁶⁾. Ifl›k ve ark.⁽⁷⁾

(4)

gerçek zamanl› PZR yöntemi kullanarak SYBR- Green I boyas› ile hastalar›n % 25'inde DNA miktar›n›n artt›¤›n› gözlemifllerdir.

Çal›flmam›zda Candida'ya özgün prob ve mantarlara yönelik primerler ile Taq-Man PZR yöntemi çal›fl›ld›ktan sonra primerlerle SYBR- Green I boyas› kullan›larak örnekler tekrar çal›- fl›lm›flt›r. Her iki yöntemle de rabdomiyosarkom tan›l› febril nötropenili bir (% 2.9) pediatrik hastada pozitiflik bulunmufltur. Çal›flmam›zda- ki bu düflük pozitiflik oran›, belki hasta say›m›- z›n az oluflu; hastalar›m›zdan do¤ru zamanda örnek al›namamas› veya antifungal tedaviye erken bafllanmas› veya kültür pozitifli¤inin olma- mas› nedeniyle olabilir. Ayr›ca hasta say›s›n›

artt›rmak özellikle yüksek olas›l›kl› ‹F‹ hasta grubunu çal›flmaya almak bize yol gösterici olacakt›r. Düflük pozitifli¤in bir baflka nedeni de, örnek olarak serumun tercih edilmesi olabilir.

Yap›lan bir çal›flmada, kandidemi tan›s›nda kullan›lacak klinik örne¤in serum veya kan m› ola- ca¤› konusunda farkl› görüfller bulunmakta- d›r⁽³⁾. Buna göre, yap›lan baz› çal›flmalarda; tam kan örne¤inde, hücre içeren pelet haz›rlanarak mantar DNA's›n›n araflt›r›lmas›n›n daha duyar- l› oldu¤u gösterilmifltir⁽¹⁶⁾. Bunun d›fl›nda hastam›zda örnek al›nmas› s›ras›nda deriden kon- taminasyon, laboratuvarda çal›fl›lan ortamda kullan›lan laboratuvar malzemelerinden dolay›

yalanc› pozitiflik de söz konusu olabilir. Morace ve ark.⁽¹³⁾'n›n çal›flmas›nda bu oran % 25 olarak bulunmufltur. Bunun için negatif kontrol say›s›- n› art›rmak ve malzemeleri ultraviyoleye tut- mak gereklidir.

Günümüzde moleküler yöntemlerin kullan›m›nda baz› standardizasyon sorunlar› ya- flanmaktad›r. Bunlar›n ilki uygulanan yöntemin do¤rudan kendisinin zay›f yönlerinden, di¤eri ise Candida'n›n genom yap›s›ndan kaynakla- n›r⁽¹¹⁾. Gerçek zamanl› PZR yöntemi, ancak ta- n›sal moleküler biyoloji laboratuvar›nda yap›la- bilmektedir ve bu konuda e¤itim alm›fl eleman- lara gereksinim vard›r. Ayr›ca, ökaryotlarda gö- rülen do¤al rekombinasyonlardan dolay› olu- flan allelik de¤iflkenlikler sonucu ve Candida'la- r›n dimorfik yap›da olmalar›ndan kaynaklanan sorunlar vard›r. Bunun yan›nda gerçek zamanl›

PZR yöntemi ile uyumlu olan çeflitli ticari man-

tar DNA izolasyon yöntemleri vard›r⁽¹¹⁾. Erken tan› ve tedavinin prognoza etkisini izlemek invaziv mantar infeksiyonu olan hastalarda hayat kurtar›c›d›r. Tan›n›n erken yap›lma- s› sonucu toksik yan etkileri olabilen antifungal tedaviye karar vermek daha gerçekçi olacakt›r.

‹nvaziv kandidozun tan›s›nda kültür ve serolojik testler ile birlikte hastal›¤›n erken dönemin- de yap›lan Candida özgün PZR testi prognoz ve tedavide yol gösterici olacakt›r.

KAYNAKLAR

1. Alexander BD: Diagnosis of fungal infection: new technolo- gies for the mycology laboratory, Transplant Infect Dis 2002;4(Suppl 3):32-7.

2. Ascioglu S, Rex JH, de Pauw B et al and Invasive Fungal In- fections Cooperative Group of the European Organization for Research and Treatment of Cancer; Mycoses Study Gro- up of the National Institute of Allergy and Infectious Disea- ses: Defining opportunistic invasive fungal infections in im- munocompromised patients with cancer and hematopoie- tic stem cell transplants: an international concensus, Clin Infect Dis 2002;34(1):7-14.

3. Bougnoux M, Dupont C, Mateo J et al: Serum is more sui- table than whole blood for diagnosis of systemic candidiasis by nested PCR, J Clin Microbiol 1999;37(4):925-30.

4. Brandt ME, Warnock DW: Laborator aspects of medical mycology, “Dismukes WE, Pappas PG, Sobel JD (eds): Cli- nical Mycology” kitab›nda s.1-22, Oxford University Press, New York (2003).

5. Einsele H, Hebart H, Roller G et al: Detection and identification of fungal pathogens in blood by using molecular probes, J Clin Microbiol 1997;35(6):1353-60.

6. Ifl›k N, A¤açfidan A, A¤›rbafll› H ve ark: Ba¤›fl›kl›k sistemi bask›lanm›fl hastalarda real time polimeraz zincir reaksiyonu ile mantar infeksiyonlar›n›n tan› ve takibi, ‹nfeksiyon Derg 2004;18(1):79-84.

7. Ifl›k N, Mills K: Using PCR and Real-Time PCR (Light Cycler) for diagnosis and follow up of invasive fungal infections in patients with hematological malignancies and transplantation, Turk J Haematol 2003;20(2):63-8.

8. Jones ME, Fox AJ, Barnes AJ et al: PCR-ELISA for the early diagnosis of invasive pulmonary aspergillosis infection in neutropenic patients, J Clin Pathol 1998;51(9):652-6.

9. Klingspor L, Jalal S: Molecular detection and identification of Candida and Aspergillosis spp. from clinical samples using real time PCR, Clin Microbiol Infect 2006;12(8):745- 53.

10. Loeffler J, Hebart H, Henke N, Schmidt K, Einsele H: Qu- antification and specification of fungal DNA in clinical spe- cimens using the light cycler instrument, “Reischl U, Witter C, Cockerill F (eds): Rapid Cycle Real-Time PZR. Methods and Applications” kitab›nda s.179-86, Springer Verlag,

(5)

New York (2002).

11. Maaroufi Y, Ahariz N, Husson M, Crokaert F: Comparison of different methods of isolation DNA of commonly enco- untered Candida spp. and its quantitation by using a real- time PCR-based assay, J Clin Microbiol 2004;42(7):3159-63.

12. McLintock LA, Jones BL: Advances in the molecular and serological diagnosis of invasive fungal infection in haema- to-oncology patients, Br J Haematol 2004;126(3):289-97.

13. Morace G, Pagano L, Sanguinetti M et al: PCR-restriction enzyme analysis for detection of Candida DNA in blood from febrile patients with hematological malignancies, J Clin Microbiol 1999;37(6):1871-5.

14. Sandhu GS, Kleine BC, Stockman L, Roberts GD: Molecu- lar probes for diagnosis of fungal infections, J Clin Microbi- ol 1995;33(11):2913-9.

15. Shin JH, Nolte FS, Morrison CJ: Rapid identification of Can- dida species from blood culture using a clinically useful PCR method, J Clin Microbiol 1997;35(6):1454-9.

16. Taylor JW, Geiser DM, Burt A, Koufopanou V: The evolu- tionary biology and population genetics underlying fungal strain typing, Clin Microbiol Rev 1999;12(1):126-46.

17. White PL, Archer AE, Barnes R: Comparison of non-culture based methods for detection of systemic fungal infections, with an emphasis on invasive Candida infections, J Clin Microbiol 2005;43(5):2181-7.

18. White TJ, Burns TD, Lee SB, Taylor JW: Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics, “Innis MA, Helfand DH, Sninsky JJ, White TJ (eds): PCR Protocols” kitab›nda s.315-22, Academic Press Inc, San Diego (1990).