Tokat ve Ordu çevresindeki sert kenelerde (acari: ixodidae) kene-kökenli ensefalit virüsü varlığının tespiti

TOKAT VE ORDU ÇEVRESĐDEKĐ SERT KEELERDE (ACARI: IXODIDAE)

KEE-KÖKELĐ ESEFALĐT VĐRÜSÜ VARLIĞII TESPĐTĐ

Tünay KARA Yüksek Lisans Tezi Biyoloji Anabilim Dalı Doç. Dr. Şaban TEKĐ

2010 Her hakkı saklıdır.

TEZ BEYAI

Tez yazım kurallarına uygun olarak hazırlanan bu tezin yazılmasında bilimsel ahlak kurallarına uyulduğunu, başkalarının eserlerinden yararlanılması durumunda bilimsel normlara uygun olarak atıfta bulunulduğunu, tezin içerdiği yenilik ve sonuçların başka bir yerden alınmadığını, kullanılan verilerde herhangi bir tahrifat yapılmadığını, tezin herhangi bir kısmının bu üniversite veya başka bir üniversitedeki başka bir tez çalışması olarak sunulmadığını beyan ederim.

i ÖZET

Yüksek Lisans Tezi

TOKAT VE ORDU ÇEVRESĐNDEKĐ

SERT KENELERDE (ACARI: IXODIDAE)

KENE-KÖKENLĐ ENSEFALĐT VĐRÜSÜ

VARLIĞININ TESPĐTĐ

Tünay KARAN Gaziosmanpaşa Üniversitesi

Fen Bilimleri Enstitüsi Biyoloji Anabilim Dalı Danışman: Doç. Dr. Şaban TEKĐN

Kene Kökenli Ensefalit Virüsü (TBE) Flaviviridae familyasına ait olan Flavivirüs genusu üyesidir. TBE Avrupa’dan Asya’ya kadar uzanan bir kuşakta endemik olarak görülmektedir. Hastalığın üç büyük formu vardır; Merkez Avrupa, Uzak Doğu ve Sibiryan alt tipi. TBE insanlara genellikle Ixodes ricinius, Ixodes persulcatus ve

Haemphysalis concinna türü kenelerin ısırmasıyla bulaşır. Türkiye’deki kene türlerinde

Kene Kökenli Ensefalit Virüsü (TBEV) varlığıda dair yeterli bilgi bulunmamaktadır. Bu çalışmada, Tokat, Ordu merkez ve Fatsa ilçelerinden toplanan değişik sert kene türlerinde TBEV’ünün varlığı RT-PCR ile test edilmiştir. RT-PCR sonuçlarına göre çalışmamız da toplanan sert kene türlerinde TBEV varlığına rastlanmamıştır. Bu sonuç, en azından çalışma bölgemizde toplanan kene türlerinin TBEV ile bulaşık olmadığını ve TBEV bulaştırma riski taşımadıklarını göstermektedir.

2010, sayfa 33

ii ABSTRACT

Master Thesis

DETERMINATION OF TICK-BORNE ENCEPHALITIS VIRUS IN

IXODES TICKS (ACARI: IXODIDAE) FROM TOKAT AND ORDU

VICINITY

Tünay KARAN Gaziosmanpaşa University

Graduate School of Natural and Applied Sciences Department of Biology

Supervisor: Assoc. Prof. Dr. Saban TEKĐN

Tick-borne encephalitis virus (TBEV) is a member of the genus Flavivirus in the family of Flaviviridae. TBE is an endemic disease from Europe to Asia. TBE is an infectious disease involving the central nervous system, which may result in death. There are three major forms of the disease; Central European, Far Eastern and Siberian subtypes. TBEV is tranmitted to humans by ixodid tick species such as Ixodes ricinius, Ixodes

persulcatus and Haemphysalis concinna. There are no evidence for the presence of

TBEV in ticks species in Turkey. In the present study, presence of TBEV in hard ticks from Tokat and Ordu and Fatsa provinces were tested using revers transcriptase-polimerase chain reaction (RT-PCR). According to RT-PCR results, no TBEV detected in ticks collected in this study. This result indicated that hard ticks of the region tested were not harbored TBEV and have no potential for transmission of TBEV.

2010, pages 33

iii Ö!SÖZ

Bu tez çalışmasının belirlenmesinde, yürütülmesinde ve çalışmalarımın yönlendirilmesinde her zaman yardımcı olan, danışman hocam Doç. Dr. Şaban TEKĐN’e ve sayın Yrd. Doç. Dr. Ahmet BURSALI’ya teşekkür ederim. Yüksek lisans eğitimim boyunca beni destekleyen, yönlendiren, bilimsel ve sosyal katkılarını esirgemeyen bölüm başkanımız sayın Prof. Dr. Zekeriya ALTUNER’e ve bilgi ve deneyimlerinden faydalandığım Biyomühendislik Fakültesi öğretim üyesi sayın Prof. Dr. Đsa GÖKÇE’ye tüm içtenliğimle teşekkür ederim.

Çalışmalarım süresince her zaman yanımda olup, hiçbir emeği ve desteği benden esirgemeyen sevgili aileme ve arkadaşlarım Aşiyan KARABULUT, Şule KÜÇÜKYAĞCI ve Uzman Adem KESKĐN’e destekleri için teşekkür ederim.

Ayrıca, çalışmalarımızda tez örneklerimin sağlanmasında katkıda bulunan Tokat Devlet Hastanesi, Ordu Devlet ve Fatsa Devlet Hastanesi Başhekimleri ve personeline de teşekkür ederim.

iv ĐÇĐ!DEKĐLER Sayfa ÖZET………. i ABSTRACT………... ii TEŞEKKÜR………... iii SĐMGE VE KISALTMALAR DĐZĐNĐ……….. Vi ŞEKĐLLER DĐZĐNĐ………... Vii ÇĐZELGELER DĐZĐNĐ………. Đx 1.GĐRĐŞ ve LĐTERATÜRÖZETĐ……….. 1 1.1 Tarihçe………... 1

1.2.1. Kene kökenli Ensefalit Hastalığı’nın Dünyada ve Türkiye’deki Epidemileri……… 1

1.2.1. Dünya’daki Epidemileri……… 1

1.2.2. Türkiye’de TBE Epidemileri……… 6

1.3. TBE Virüsünün Yapısı, Özellikleri ve Taşınımı………... 7

1.3.1. TBE Virüsünün Yapısı ……… 7

1.3.1.1. Flaviviriade Ailesindeki Virüslerin Replikasyonu………... 9

1.3.2 . TBE Virüsünün Özellikleri……….. 10

1.3.3. Kene Kökenli Ensefalit Virüsünün Taşınımı………... 11

1.4. TBE Hastalığında Enfeksiyon Oluşumu, Klinik Yol,Tanısı,Tedavisi ve Korunma Yolları………... 13

1.4.1. TBE Hastalığında Enfeksiyon Oluşumu……….. 13

1.4.2. Klinik Yol ve Hastalığın Ortaya çıkması………. 14

1.4.3. TBE Hastalığının Tanısı………... 15

1.4.4. TBE Hastalığından Korunma Yolları………... 17

1.4.4.1. TBE Aşısı………. 17

2. MATERYAL VE YÖ!TEM……… 19

2.1. Materyal ………... 19

2.1.1. Kullanılan Kimyasal madde ve Malzemeler……… 20

2.1.2. Cihazlar……… 20

2.1.3. Tampon ve solisyonların Hazırlanışı………... 20

2.1.3.1. 0.5 M EDTA Solisyonu………... 20

2.1.3.2. 50X Tris Aceteta EDTA (TAE) Tamponu ………... 21

2.1.3.3. 1X TE Tamponu ………... 21

2.1.3.4. 3M Sodyum Asetat Solüsyonu………...……... 21

2.1.3.5. Etidium Bromür………. 21

2.1.3.6. 6X Bromophenol Blue……….. 21

2.1.1.3.7. Çalışmada Kullanılan Primerler………... 22

2.2. Yöntem………..……… 23

2.2.1. Kene Dokularının Ayrılması………. 23

2.2.2. Viral RNA Ekstrasyonu……….………... 23

2.2.3. One – Step Reverse Transkripsiyon Polimeraz Zincir Reaksiyonu (RT-PCR)….24 2.2.3.1. Thermal cycler’ın Program Ayarı ………. 25

2.2.4. Agaroz Jel Elektroforezi……… 25

v

ĐÇĐ!DEKĐLER Sayfa

2.2.5. DNA Dizi Analizi……….

25

3. BULGULAR……….... 25

3.1. Tokat ve Amasya Bölgesi Kenelerinde TBEV Varlığı………... 26

3.2. Ordu Merkez ve Fatsa Bölgesi Kenelerinde TBE Varlığı……… 26

4. TARTIŞMA ve SO!UÇ……… 28

KAY!AKLAR ……… 30

ÖZGEÇMĐŞ ………... 33

vi SĐMGE ve KISALTMALAR DĐZĐ!Đ Simgeler Açıklama oC Santigrat Derecesi g Gram L Litre M Molar % Yüzde o Derece Kısaltmalar Açıklama Ark. Arkadaşları

TBE Kene Kökenli Ensefalit Bç Baz çifti

cDNA Komplementer DNA dk Dakika

DNA Deoksiribonükleik asit

dNTP Deoksiribonükleosit Trifosfat DTT Ditiotrietol

EDTA Etilendiamintetraasetik Asit ELISA Enzim Bağlı Đmmün Assay HCL Hidrojen Klorür

IgG Đmmunoglobulin G IgM Đmmunoglobulin M Kb Kilobaz

KKKA Kırım Kongo Kanamalı Ateşi CNS Merkezi Sinir Sistemi

vii mA Miliamper

mg Miligram ml Mililitre

TBEV Kene Kökenli Ensefalit Virüsü mM Milimolar

MW Moleküler Ağırlık nmol Nanomolar

ppm part per million

PCR Polimeraz Zincir Reaksiyonu RNA Ribonükleik asit

RNAase RNAaz

RSHM Refik Saydam Hıfzısıhha Merkezi

RT-PCR Reverse Transkripsiyon Polimeraz Zincir Reaksiyonu TAE Tris-Asetat EDTA

TE Tris-EDTA UV Ultraviyole Pmol Pikomol µl Mikrolitre µl Mikromol

viii ŞEKĐLLER DĐZĐ!Đ

Şekil Sayfa

Şekil 1.1 Kene Kökenli Ensefalit Hastalığı’nın Dünya’daki yayılışı…...4

Şekil 1.2 Mevsimsel kene aktivitesi ile TBE insidansı arasındaki ilişki………5

Şekil 1.3 Arbovirüs ailesi………...7

Şekil 1.4 TBE virüsünün yapısı ve elektron mikroskoptaki görünümü…………....8

Şekil 1.5 TBE Virüsü’nün yapısal ve yapısal olmayan proteinleri………8

Şekil 1.6 Flaviviridae ailesindeki virüslerin replikasyonu………10

Şekil 1.7 TBE Virüsü'nü taşıyan bazı kene türleri………...12

Şekil 1.8 TBE hastalığının real-time PCR ile tanısı………..16

Şekil 3.1 RT-PCR sonrası PCR ürününün agaroz jel görüntüsü...27

ix

Çizelge 1.1 2001-2003 yılları arasında çeşitli ülkelerde TBE'li vaka sayısı………..3

Çizelge 1.2 2005-2009 yılları arasında TBE hastalık sıklığının arttığı ülkeler……..6 Çizelge 1.3 TBE virüsünü kene dışında bulaştıran diğer hayvanlar………11

Çizelge 1.4 TBEV suşlarının görüldüğü kene türleri……….. 13 Çizelge 1.5 TBE aşısının içeriği……….. 18 Çizelge 2.1 Bu çalışmada TBEV varlğını test etmek için toplanan kene cinsleri….19 Çizelge 2.2 Bu çalışmada TBEV varlığını test etmek için kullanılan primerler…...22

1

1. GĐRĐŞ ve LĐTERATÜR ÖZETĐ

Tick-borne encephalit (TBE), Avrupa’dan Asya’ya kadar birçok ülkede görülen ve insanların merkezi sinir sistemini etkileyen önemli viral enfeksiyon hastalıklarından biridir. Enfeksiyon, farklı zamanlarada değişik isimlerle anılmıştır. Frühsommermeningoenzephalitis, Western subtype (FSME), Kumlinge’s disease, Western subtype (Central European encephalitis), ve Russian Spring and Summer Encephalisitis, Eastern subtype (RSSE) olarakta adlandırılan enfeksiyon son zamanlarda TBE olarak isimlendirilmektedir (Gritsun ve ark., 2003).

1.1 Tarihçe

Enfeksiyon klinik olarak ilk kez 1931 yılında Avusturyalı Schneider tarafından bildirilmiş, 1937 yılında Rus Lev Zilber kene ısırması ile ilişkili akut ensefalitis olgularını, 1947 yılında da Rusya’dan Pavlovsky kene ve insanlar arasındaki zoonotik bulaşmayı tanımlamıştır. Bu hastalığa, kene ile bulaşan kene kökenli ensefalit virüsünün (TBEV) yol açtığı ise 1937 yılında Zilber tarafından bulunmuştur (Dumpis ve Crook, 1999).

1.2. Kene Kökenli Ensefalit Hastalığı’nın Dünya’da ve Türkiye’ki Epidemileri 1.2.1. Dünyada’ki Epidemileri

TBEV enfeksiyonu Avusturya, Beyaz Rusya, Bosna, Hırvatistan, Çin, Çek Cumhuriyeti, Danimarka, Estonya, Finlandiya, Fransa, Almanya, Yunanistan, Đtalya, Japonya, Macaristan, Kazakistan, Letonya, Litvanya, Norveç, Polonya, Romanya, Rusya, Sırbistan, Slovak Cumhuriyeti, Slovenya, Đsveç, Đsviçre ve Ukrayna gibi birçok ülkede görülmüş ve virüs serolojik olarak tanımlanmıştır. Çizelge 1.1’de bazı ülkelerdeki TBE epidemileri verilmiştir (Süss, 2003). Avusturya TBE’in en çok görüldüğü ülkelerden biri olup, 2003 yılında 87 TBE vakası bildirmiştir (insidans:100.000’de 1.9). Kene kaynaklı ensefalit vakaları daha çok

2

Avusturya’nın güneyinde görülmektedir. Bütün bu vakalar aşılanmayan veya bildirilen aşı takvimine uymayan kişilerden oluşmaktadır. Geçen 5 yılda aşılanma oranı %79’dan %87’ye çıkmıştır. Aşılanma oranı küçük çocuklarda ve 65 yaş üstü grupta %70’lerde kalmıştır. Yaşlılardaki bu düşük aşılanma oranı Avusturya’daki TBE’ e karşı mücadeleyi zorlaştırmaktadır (Kunz, 2003). Finlandiya’da 1990' lı yıllarda ve 2001 yılında kene kaynaklı ensefalit vakaları bildirilmiştir. 2001 yılında vaka sayısı yıllık 40’ın üzerine ulaşmıştır.

TBE Almanya’da da görülen bir hastalıktır. 2003’de 276 vaka bildirilmiştir. Bu vakalar özellikle Almanya’nın güneyinde Baden-Württemberg (%42) ve Bavaria’da (%38) görülmüştür. Almanya TBE riski açısından üç bölgeye ayrılmıştır. Bir bölgede 1984-2003 yılları arasındaki 5 yıllık periyotta en az 25 TBE vakası varsa “yüksek riskli alan”, bir yılda iki veya daha az vaka ya da 1984-2003 yılları arasındaki 5 yıllık periyotta 5 veya daha az vaka varsa “riskli alan” olarak sınıflandırılmıştır. Aşılanmamış orman işçilerinde yapılan çalışmalarda kene kaynaklı ensefalit seroprevelansının yüksekliğine dayanılarak bazı bölgeler endemik olarak kabul edilmiştir. 2003 yılında üç yeni riskli alan tanımlanmıştır. Keneyle temas riski yüksek olan ve riskli alanlarda yaşayan kişilere aşılama önerilmektedir (Roggendorf, 1996).

Macaristan’da 1977’den beri TBE bildirimi zorunludur ve tüm veriler “National Center for Epidemiology” tarafından toplanmaktadır. Aseptik menenjit ve ensefalitli hastaların TBE için tek tanı laboratuvarı olan merkezin viroloji bölümünde 1977’den beri düzenli olarak test edilmektedir. 1977-1996 yılları arasında ortalama yıllık insidans 2.5/100.000 (range 1.8-3.8) olup 1981-1990 yılları arasında en yüksek düzeyde saptanmıştır. 1997’den 2000’e kadar tanı konulan TBE vakalarında önemli bir düşüş görülmüş, 2000’de insidans 100.000’de 0.5 olmuştur. 2001’den itibaren insidansda tekrar artış görülmüştür. Son 3 yılda yıllık ortalama rapor edilen vaka sayısı, 63’dür. Yüksek risk grubundakiler (çiftçi, orman işçileri vb.) için aşılama yapılmaktadır.

Norveç’te TBE de dahil bütün ensefalit vakalarının bildirimi zorunludur. 2003’de bir vaka bildirilmişke, Norveç’te toplam 8 vaka rapor edilmiştir. Bir sağlık merkezinde düzenli takip edilen hastalar arasında yapılan küçük ölçekli bir seroprevalans çalışmasında %24 oranında TBE virus antikorları saptanmıştır. Norveç’teki düşük insidansdan dolayı ülkelerarası yayılıma karşı aşılama son zamanlarda tavsiye edilmiştir (Scarpaas, 2004). TBE Polonya’ da 30 yıldan beri endemiktir ve bildirimi yapılmıştır.

3

1933’ ten beri ülkede rapor edilen vaka sayısı 100 ile 350 arasındadır. 2002 yılında bu sayı 126 (insidans 100.000’de 0.33) ve 2003 yılında 339 (insidans 100.000’de 0.89)dur. Vakaların %8’i Polonya’nın Litvanya ve Belarus’a komşu iki güney batı ilinde gözlemlenmiştir. Polonya’nın Çek Cumhuriyeti’ne komşu olan kuzey doğu bölgeleri bu hastalığın ikincil merkezidir.

TBE’nin Slovakya’da bildirimi zorunludur. Son on yılda rapor edilen vaka sayısı her yıl 54 ile 101 arasındadır. 2002’de 62 vaka (insidansı 100 000’de 1.15) ve 2003’de 74 vaka (insidansı 100 000’de 1.38) rapor edilmiştir. Rapor edilen bazı vakalar çiğ olarak tüketilen keçi ve koyun sütünden (ev yapımı) kaynaklanmıştır (Gresikova, 1968). TBE ve Lyme hastalıkları, Slovenya’nın güneyinde endemik ve bildirimi yapılan hastalıklardır. 2003 yılında 272 vaka rapor edilmiştir (insidansı 100 000’de 13.6). 2002 yılında (262 vaka) ve 2001 yılında (260 vaka) rapor edilen vaka sayıları yaklaşık olarak aynıdır. TBE Đsveç’te isteğe bağlı olarak laboratuvar bildirimine dahil olan bir enfeksiyon hastalığıdır. 1980’lerin sonunda ve 1990’ların başında yıllık yaklaşık 50-70 kadar vaka rapor edilmiştir. 2003 yılında 75’i erkek, 32’si kadın 107 TBE vakası bildirilmiştir. Endemik bölgelerde yaşayanlar veya buraları ziyarete gidenler gibi yüksek risk grubuna aşılama, tavsiye edilir (Gustawson, 1993).

Çizelge 1.1 2001-2003 Yılları arasında çeşitli ülkelerde TBE’li vaka sayısı ve insidansı (Süss, 2003)

Ülke Yıl

Rapor edilen vaka (S) Đnsidans (100.000) Avusturya 2003 87 1.09 Çek Cumhuriyeti 2003 - 5.9 Danimarka - - - Finlandiya 2001 >40 - Almanya 2003 276 - Macaristan 2001-2003 63 - Litvanya 2003 - 15.7 Letonca 2003 763 22 Norveç 2003 1 - Polonya 2003 339 0.89

4

TBE virüsü (kenelerde ve omurgalı konaklarda) tropik olmayan Avrupa orman kuşaklarının tüm güney kısmında, Batıda Alsae – Lorraine de ve doğuda Çin’in kuzey ve güneye ait bölgelerinde dağılım göstermektedir (Şekil1.1). 1988’de Japonya’da izole edilmiş endemik bir virüs Hokkoida’da belirlenmiştir. Norveç ve Đsveç’in güneye ait kısmında bilinen risk bölgelerine ek olarak yeni risk bölgeleri oluştuğu bildirilmiştir (Scarpaas, 2004).

Şekil 1.1 Kene kökenli ensefalit hastalığının Dünya’daki yayılımı (Takeda, 2004)

TBE Uluslar arası bilimsel çalışma grub(ISW TBE), TBE hastalığının Avrupa’ da bir sağlık sorunu olduğu bildirilmiştir (Kunze, 2006). TBE insidansının, son yıllarda Avusturya hariç hemen hemen TBE riskli tüm Avrupa ülkelerinde arttığı ve bunun sebebinin küresel ısınmaya bağlı olarak değişen kene biyolojisi olduğu düşünülmektedir. TBE endemik bölgelere artan seyehat, seyehat sezonunun kene aktivitesinin yüksek olduğu periyoda uyması, koruyucu giysilerin kullanılmaması ve aşılanmama neticesinde TBE vakalarıda son zamanlarda artış rapor edilmiştir. Çizelge1.2’de görüldüğü kadarıyla özellikle Almanya, Güney Kore, Çek Cumhuriyeti, Đsveç, Đsviçre de hastalık vakalarında artış görülmüştür (Kim ve ark., 2009).

5

Çizelge 1.2 2005-2009 yılları arasında TBE hastalık sıklığının arttığı ülkeler (Kim ve ark., 2009) Ülke Prevalans (%) Çek Cumhuriyeti 15-54 Almanya 12-35 Güney Kore 14-25 Đsveç 10-22 Đsviçre 10- 18

TBE hastalığı artan ülkelerde kene aktivitesi ilkbahar ve sonbahar aylarında olmak üzere 2 mevsimsel zirvesi göstermektedir ve TBE klinik vakaları özellikle mevsimsel kene aktivitesinin yaklaşık 4 haftasında ortaya çıkmaktadır (Şekil1.2).

6

1.2.2. Türkiye’de TBE Epidemileri

Diğer ülkelerin aksine, ülkemizde TBEV ile ilgili ve özellikle keneleri ihtiva eden çalışmalar çok sınırlıdır. Ülkemizde özellikle Karadeniz bölgesinde TBEV bulaşmasına sebep olabilecek kene türlerinin bulunması bu virüsün de kenelerle bulaşma ihtimalini güçlendirmektedir. Avrupa ülkelerinde aşılama proğramlarında bulunmasına rağmen, ülkemizde bu hastalık çoğunlukla asemptomatik seyretmesi ve düşük mortaliteye sahip olması nedeniyle fazla dikkat önemsenmemektedir. Hastalığın kalıcı ve yıllar sonradan çıkan etkileri insanlarda değişik sağlık sorunlarının oluşmasına ve hayat kalitesinin düşmesine neden olduğu göz ardı edilmektedir.

Türkiye’de TBE virüsü seroprevalansı ile ilgili çeşitli veriler bulunmakla birlikte bunların çoğundaki seropozitiflikler viral nötralizasyon ile doğrulanmamıştır. Bununla birlikte özellikle Türkiye’nin Güneydoğu Anadolu bölgesinde yapılan bir seroprevalans çalışmasında olguların % 9.5’ğunda TBE virus seropozitifliği viral nötralizasyon yöntemi ile doğrulanmıştır (Ergunay ve ark., 2007). Türkiye’de KKKA’nin endemik olduğu bir bölgede, 39 KKKA şüpheli serumun birinin TBEV IgM pozitif olduğu bulunmuştur (Eser ve ark., 2007).

1.3. TBE Virüsünün Yapısı, Özellikleri ve Taşınımı 1.3.1. TBE Virüsünün Yapısı

TBE virüsü tek zincirli pozitif RNA genomuna sahip, zarflı virüslerdir. Ortalama 50 nanometre (nm) çapında virionları vardır. 11 kb büyüklüğünde bir RNA olan genomu tek bir büyük açık okunan bölge içerir (Şekil 1.4). Açık okunan bölge yaklaşık 3400 amino asit büyüklüğünde bir polipeptidi kodlar (Heinz and Collet, 2000).. Bu polipeptid konak hücresi ve viral proteaz enzimleri tarafından çeşitli bölgelerden kesilerek işlemlendikten sonra virüsün yapısal (C, E ve M) ve yapısal olmayan proteinleri (NA1, NS2A,NS2B, NS3, NS4A, NS4B ve NS5) açığa çıkar. E protein, hücre reseptörüne bağlanma, füzyon ve nötralizan antikor yanıtı için önemlidir (Chambers,1990). Açık okunan bölgenin 3' ve 5' uçlarında virüsün genom replikasyonu, translasyon ve paketlenmesinde önemli rol oynayan özelleşmiş yapılarını içeren kodlamayan bölgeler bulunur (Şekil1.5). Bu virüsler Uluslararası Virüs Taksonomi Komitesinin sınıflandırma

7

tablosunda Flaviviridae Ailesinin Flavivirus cinsi içerisinde tek tür olarak sınıflandırılmış (Şekil 1.3) ve Avrupa, Sibirya ve Uzak Doğu olmak üzere üç alt tipe ayrılmıştır (Heinz and Collet, 2000).

8

Reoviridae

•dsRNA segmentli,zarfsız •Coltivirüs

Kene vektörü

Colarado kene ateşi

Arbovirüs

Bunyaviridae

• Zarflı

• 3 helikal nükleotid

• Negatif sens, segmentli RNA Grup A

Togaviridae ailesi

• Zarflı • İkosohedral • ss+RNA

• Sitoplazmik membradan zarflı

Rubivirüs genusu

• Rubella

Alfavirüs genusu

• EEE

• WEE

Grup B Flaviviridae ailesi_Zarflı • İkosohedral • ss+RNA

•Sitoplazmik membrandan zarflı

Flavivirüs genusu

•Denque ateşi • Japon ensefalit virüsü • St Louis Ensefaliti • Batı Nil Virüs

Bunyavirüs genusu • Kalifornia Ensefalit Grubu La Crosse Virüs • Toscana virus

Arbovirus ailesi

TBE

8

Şekil 1.4 TBE Virüsü’nün yapısı ve elektron mikroskoptaki görünümü (Chambers,1990)

9

1.3.1.1. Flaviviridae Ailesindeki Virüslerin Replikasyonu

Viral glikoproteinlerin, duyarlı hücrelerdeki reseptör bölgelerini tanımaktan sorumlu olduğuna inanılmaktadır. Bu hücrelerdeki reseptörlere bağlanan virüsler, endositoz ile hücre içine alınırlar. Sitoplazmaya alınan virüsler, replike olduktan sonra tomurcuklanarak endoplazmikretikulumdan ayrılırlar ve Golgi bölgesinde sitoplazmik veziküller içerisine alınırlar. Bu bölgeden de füzyon işlemi ile virüs en dıştaki zarını da alarak hücre dışına çıkar (Şekil 1.6) (Heinz,1991).

1.3.2. TBE Virüsünün Özellikleri

TBEV, lipid zarfından dolayı organik solventler ve deterjanlarla inaktif olur. Zarf, çıplak nükleokapsiti ve hücresel nükleazdan da genomu korur. RNA’nın farelere intracerebral injeksiyonu ile enfeksiyöz olduğu gösterilmiştir. Flavivirusların infektivite ve viral hemaglutininleri pH 8.4-8.8 arasında stabil olmasına karşın, TBEV geniş bir pH’da (pH 1.42-9.19) canlı kalabilmektedir. Virusun E proteini asidik pH ile infektivitesini kaybetse de, virionlar süt ve mide sıvısında infektivitesini korurlar, bu durum TBEV’nin oral yolla da infektivitesini açıklamaktadır. TBEV, 50°C’de 10 dakikada infektivitesinin %50’sini kaybederler, tam bir inaktivasyon için 56°C’de 30 dak. yeterlidir. Sıvı arerosol süspansiyonlardaki virusler oda ısısı %23-80 nem oranında 6 saat, dondurularak kurutulduğunda ise yıllarca stabil kalırlar. Pasterizasyon, Ultraviole ve gama ışınları, %3-8’lik formaldehid, %2’lik gluteraldehid, %2-3’lük hidrojen peroksit, 500-5000 ppm chlorine, alkol, %1’lik iyot ve fenol ile inaktive olurlar(Rey, 1995).

10

11

1.3.3. Kene Kökenli Ensefalit Virüsünün Taşınımı

TBE virüsleri doğadaki yaşam döngüsü keneler ile omurgalılar arasında gerçekleşir. Kan emici keneler omurgalı konaklardan beslenme sırasında aldıkları virüsle enfekte olurlar ve yaşamları boyunca enfekte kalarak virüsü taşırlar (Süss 1992). Doğada özellikle Avrasya bölgesinde Ixodes ricinus, Ixodes persulcatus, Haemaphysalis

concinna türü kenelerle taşınırlar (Şekil 1.6). Bu kene türleri ülkemizde de

bulunmaktadır (Ozkan ve ark., 1987). Keneler haricinde Apodemus cinsi fareler virüsün en belirgin taşıyıcı konakları olarak bildirilmiştir. Đnsan ise tıpkı dana, keçi, koyun, geyik, kuğu gibi diğer büyük omurgalılarla birlikte yanlışlıkla konak olabilmektedir (Çizelge 1.3).

Çizelge 1.3 TBE virüsünü kene dışında bulaştıran diğer hayvanlar (Bodemann, 2000)

Konak Sıklık (%)

Sarı boyunlu tarla faresi 47.9

Kırmızı astarlı köstebek 29.4 Tilki 18.0 Geyik 83 Köpek 2.0- 5.6 Keçi 44.0 Sığır 35.5-91.0

12

Ixodes sp. (dişi) Haemaphysalis sp. Ixodes ricinius

dorsal görüntüsü (Erkek) dorsal görüntüsü (dişi) ventral görüntüsü Şekil 1.7 TBE virüsünü taşıyan bazı kene türleri (Anonim,2006)

TBE virüsü insanlara veya larva, nimf ve yetişkin keneler tarafından diğer konaklara taşınır. Sıcaklık kene kökenli hastalık dinamiklerinin belirleyicisidir. Kene aktivitesi Mart-Nisan ayında toprak sıcaklığı 5-7 oC derece arttığında başlar ve ortalama hava sıcaklığı Ekim veya Kasım’da yaklaşık aynı değerde azaldığı zamanda yılın sonlarına doğru sonlanır. Kene aktivitisi aynı zamanda toprak nemliliği ve ilişkili nemlilik üzerine dayanır. Ixodes ricinius Avrupada TBEV bulaşında rol oynayan başlıca kene türü olup TBEV’nün yayılması için esas sorumludur (batı alt tipi). TBE virüsünün Uzak Doğu alt tipi Ural Dağlarının ötesinde bulunmuştur ve temel vektörü Ixodes persulcatus’ tur (Çizelge 1.4).

13

Çizelge 1.4 Kene kökenli ensefalit virüsü suşlarının görüldüğü kene türleri

TBEV suşu Taşıyıcı Kene Türü Referans

Avrupa Ixodes ricinius Ixodes nipponensis Haemaphysalis concinna Haemaphysalis longicornis Haemahysalis flava

(Kim ve ark., 2009)

Uzak Doğu Ixodes persulcatus Haemaphysalis japonica

(Ternovi, 2003)

Sibiryan Ixodes persulcatus Haemaphysalis concinna

(Kunze, 2006)

1.4. TBE Hastalığında Enfeksiyon Oluşumu, Klinik Yol, Tanısı, Tedavisi ve Koruma Yolları

1.4.1. TBE Hastalığında Enfeksiyon Oluşumu

Enfekteli kenenin insanı ısırmasından sonra, virüs kene ısırığının olduğu bölgedeki dermal hücrelerde replike olur. Kenenin salyası ile immün sistemin baskılanması nedeniyle virüs nötrofilik granülositlerin yanında Langerhans hücrelerinde de replike olur. TBE virüsü replikasyon için sadece Langerhans hücrelerini ve granülositleri kullanmaz, aynı zamanda lenf kapilerleri yolu ile bölgesel lenf bezlerine ulaşır. Böylece virüs lenfatik sistem yolu ile yayılır ve birkaç gün sonra, kan dolaşımı (viremi) safhasına ulaşır. Daha sonra diğer duyarlı organ ve dokulara istila eder, özellikle retiküloendotelyal sistemde (timus, dalak, karaciğer) etkili olarak replike olur. Bu basamaktan sonra virüs merkezi sinir sistemine ulaşmak için, beyin kapiler endotelyum hücrelerini enfekte eder. Beyin kapiler endotelyum hücrelerinin enfekte olması yüksek

14

virüs miktarına bağlıdır. Endotel hücreler istila edildikten sonra virüs replike olur ve beyin dokusu içerisinde beyindeki kapiler endotelyum hücrelerinden merkezi sinir sistemine geçer. TBE virüsü ayrıca sinir fibrilleri boyunca da yayılabilir. Bu durum özellikle laboratuar enfeksiyonlarında havadan virüs alındığında görülebilir.

1.4.2. Klinik Yol ve Hastalığın Ortaya Çıkması

Hastalık dört periyodluk bir seyir gösterir:

Đnkübasyon Periyodu: Çoğu vakalarda ilk basamağın saldırı öncesi, inkübasyon periyodu 7-14 gün veya 2-28 gün sürebilen periyodudur.

Đlk Basamak: Ortalama ilk basamak 2-4 gün sürer (1-8 gün devam süresi nadir olarak incelenir) ve viremik fazla karşılaşır. Karakteristik olmayan grip benzeri semptomları ve çoğu vakada 38 oC bir artışla ilişkilidir. Bazen istisna olarak yüksek baş sıcaklıklar oluşabilir.

Aseptomatik Aralık: Đlk basamak yaklaşık 8 gün süren aseptomatik aralık tarafından takip edilir. Bu periyod esnasında hastalar genelde septomsuzdur.

Đkinci Faz: Enfeksiyondan sonra yaklaşık 2-4 hafta içinde hastaların üçte birinde hastalığın ikinci basamağı görülebilir ki, bu faz merkezi sinir sistemi (CNS) ile ilişkisi tarafından karakterize edilir. Klinik resmi meninjit, ensefalit, meningoenfalomyelitis, veya meningoensefaloradikulustur. Avrupa’da yetişkin hastalarda ölüm oranı yaklaşık % 1’dir ve meningoensefalit, meningoensefalomyelitis ve otonom sinir sisteminin disfonksiyonu dahil TBE’li hastalarda yaklaşık % 3’e çıkar. (Radda, 1983).

Meninjitin asıl septomları ciddi baş ağrısı, mide bulantısı, kusma, ense sertliği, ve yüksek ateştir. Ensefalit, bilinçsizlik, uyuşukluktan derin uyku haline değişen ve bazı nadir durumlarda, koma gibi rahatsızlıklarla karakterize edilir. Hastalığın ileriki safhalarında vücutta bir takım değişiklikler görülebilir. Bunlardan bazıları karakterize edilmiştir. Özellikle merkezi sinir sistemini etkileyecek septomları vardır. Beyin bariyerini geçtikten sonra omurilik ve ensefalit sonrası septomlar olası. Diğer septomları uykusuzluk, kolların ve yüz kasının aşırı hareketliliği, dil titremesi, kasılma, baş dönmesi, konuşma bozukluklarıdır. Kranial (kafatasına ait) sinirleri içerdiğinde, esas olarak göz merceği, yüz kısmı ve boğaz kasları etkilenir. Bazı durumlarda nöropsiyatrik septomlar hakim olur ve hastalar psikiyatrik gözetime yollanır. TBE’li nörolojik

15

anormalliklerin en büyük uzantısı hastalığın ortaya çıkan meningoensefalomyelitikte bulunur ki bu durum öncelikle ekstremitelerin zayıf paralizi tarafından karakterize edilir. Paraliz genellikle üst kolları, omuz eklem miyelitini ve baş kaslarını etkiler (Mickiene, 2005).

1.4.3. TBE Hastalığının Tanısı

TBE virüsünün tanısı için değişik yöntemler kullanılmaktadır. Bunlardan bazıları aşağıda özetlenmiştir (Haglund, 2000).

BOS (Beyin omurilik sıvısı) incelemesi: BOS’ta orta derecede pleositozis (100-300 hücre/µl), segmentli granülositler % 60-70, lenfositler %30-40 görülmektedir. Kan – BOS bariyeri orta derecede bozulmuş olup, BOS / Serum albumin oranı artmıştır ve IgM ön planda olmak üzere intratekal antikor üretimi artmıştır. Nadiren ölümcül vakalarda beyin dokusunda elektron mikroskobu ile virus gösterilebilmiştir.

Hücre kültüründe izolasyon: TBEV, hastalara ait serum ve / veya BOS örneklerinin memeli hücre kültürü ortamlarına (Vero, BHK-21, PK, RH, 293 veya A549 hücreleri) veya fare beynine inokülasyonundan sonra yapılabilmektedir.

Serolojik tanı: 1980’lerden önce, tanıda kompleman fiksasyonu veya hemaglütinasyon inhibisyon testi kullanılmıştır. Hızlı tanı için, hemaglütinasyon inhibisyon testinde 2-merkaptoetanol ile muamele sonrası TBEV spesifik IgM antikorları saptanabilir. Bu testte erken akut dönem serumunda 0.05M 2-ME ile muameleden önce ve sonra serum Hemaglutinasyon inhibisyonu (HI) ile test edilmelidir (Allwinn, 2002).

Günümüzde, TBE tanısında Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) serum ve BOS’da serolojik tanı için oldukça iyi ve kullanışlı bir yöntemdir. “Capture” ELISA yöntemiyle, romatoid faktör veya heterofil antikorların interferansı nedeniyle oluşabilecek yalancı pozitifliklerden uzaklaşılarak TBEV-IgM çalışılabilmektedir. ELISA yöntemi ile IgM’in gösterilmesi oldukça güvenilir bir serolojik testtir. Ancak, erken dönemde antikoru saptayamaması ile aşı sonrası ve doğal vakalarda 10 aya kadar devam eden IgM antikor varlığı bazen tanıda sorun oluşturabilmektedir. Bu nedenle TBEV spesifik IgG ELISA testi veya seronötralizasyon testleri ile konfirmasyon yapılması önerilmektedir (Sonnenberg, 2004).

16

Moleküler tanı: Hastalığın ilk fazı boyunca, hem kan hem de BOS örneğinden RT-PCR tekniği ile TBEV genomu saptanabilmektedir. Buna rağmen, bu teknikler pratikte tanıda minör derecede önemlidir, çünkü hastaların çoğu hastalığın ikinci fazında hekim muayenesine başvurmaktadır ve bu dönemde zaten kan ve BOS’tan virüs temizlenmiş olmaktadır. Bu nedenle, RT-PCR tekniği TBE’nin laboratuar tanısında hastalığın birinci faz dönemi hariç kullanılışlı değildir. Yeni real-time RT-PCR yöntemleri TBEV tanısında daha başarılıdır. Omurgalılarda vireminin araştırılması ve kenelerde virüs prevalansının epidemiyolojik surveyinde TBEV RNA’sının RT-PCR ile taranması ile başarılı sonuçlar alınmıştır (Şekil 1.8). Ancak, TBE’nin rutin tanısında virus izolasyonu ve moleküler yöntemlerin önemli bir rolü yoktur, genellikle ikinci fazın başlamasıyla beraber spesifik antikorların saptanmasıyla tanı konmaktadır (Puchhammer-Stock and Kunz, 1995).

Şekil 1.8 TBE hastalığının real-time PCR ile tanısı (Schwaiger, 2003)

1.4.4. TBE Hastalığından Korunma Yolları

Genel olarak diğer kene kökenli hastalıklarda uyulması gereken korunma yolları (Kenelerle mücadele, keneli alanlara girmeme, kene kovucu veya ilaçlı elbise kullanma, aşılanma) burada da gecerlidir.

17

1.4.4.1. TBE Aşısı

TBE hastalığını önlemede en etkili yol aktif aşılamadır. TBE için halen çok sayıda aşı bulunmakta ve birçok ülkede rutin, bazı ülkelerde ise isteğe bağlı kullanılmaktadır. Örneğin, Avrupada Baxter firması tarafından TBE’ye karşı kullanılmak üzere formaldehitle inaktive edilmiş sükroz gradienti ile saflaştırılmış TBEV antijeni içeren FSME-IMMUN adlı bir aşı yoğun olarak kullanılmaktadır (Baxter 2007). Bu aşının içeriği Çizelgede verilmiştir (Kunz 2003). Bu aşı üç dozda kullanılmakta ve yaşlara göre farklı dozda uygulanmaktadır. Avusturya’da özellikle bu aşının uygulanmasıyla TBEV vakalarında çarpıcı bir şekilde azaldığı ispat edilmiştir. Diğer bir şekilde ticari olarak elde edilen aşı Encepur (Behringwerke AG, Marburg, Almanya ) piyasaya sunulmuştur. Bu aşı ile Almanya’da TBEV’ ünün yüksek riskli bölgelerinde yaşayan bebek ve çocuklarda yaygın bir şekilde kullanılmıştır. Üçüncü olarak Rusya’da üretilerek kullanılan aşı da rapor edilmiştir. Endemik TBE bölgelerine ziyaret eden ve kene ısırma riskinde olan kişilere TBE aşısı alması önerilir (Baxter 2007).

18

Çizelge 1.5 TBE aşısının içeriği (Kunz, 2003)

FSME-Đmmün 0.5 ml FSME-Đmmün0.25ml (Genç)

Aktif madde: inaktive edilmiş Formaldehit, saflaştırılmış Sukroz gradienti, TBE virüs antijeni 2.4 µg (hedef) 2- 2.75 µg (aralık) 1.2 µg (hedef) 1-1.375 µg (aralık) Adjuvant: sulandırılmış Alüminyum hidroksit 0.35 mg Al 0.17 mg Al Tampon sistem: Sodyum klorit 3.45 mg 1.725 mg

Sukroz Max. 15 mg Max. 7.5 mg

Formaldehit Max. 5 µg Max. 2.5 µg

Protamin sülfat Az miktar Az miktar

Neomisin ve gentamisin Az miktar Az miktar

Dengeleyici 0.5 mg 0.25 mg

19

2. MATERYAL ve YÖ>TEM 2.1. Materyal

Çalışmada, 2007-2008 yılları arasında Tokat, ve çevresinden yapılan arazi çalışmaları sonucunda ve sağlık kuruluşlarından kene ısırığı olan insanlardan toplam 690 kene örneği toplanmış ve TBEV varlığı için test edilene kadar -80oC de muhafaza edilmiştir. Ayrıca 2010 yılı Temmuz-Ağustos ayları arasında Ordu Merkez ve Fatsa ilçelerinde insanlardan toplanan 228 kene (özellikle Ixodes ricinius) bu çalışmada kullanılmıştır (Çizelge 2.1).

Çizelge 2.1 Bu çalışmada TBEV varlğını test etmek için toplanan kene cinsleri ve sayıları

Keneler Tokat- Amasya Đlleri Ordu-Fatsa Bölgesi

Hyalomma sp 630 _

Haemaphysalis sp 20 _

Ixodes sp 40 228

TOPLAM 690 228

Tokat ve Amasya ili için 630 adet Hyalomma cinsine kene örneği, 40 adet Ixodes cinsi kene örneği ve 20 adet Haemaphysalis cinsi kene örneği kullanılarak 10 keneden oluşan 69 adet kene havuzu oluşturulmuştur. Ayrıca Ordu merkez ve Fatsa ilçelerinden 205 adet ergin Ixodes ricinus örneği, 20 adet Ixodes cinsi nimf ve 3 adet larva 5’li gruplar halinde gruplanarak 46 adet kene havuzu oluşturulmuştur. Bu kene havuzları viral RNA izolasyonu için kullanılmıştır.

2.1.1. Kullanılan Kimyasal Madde ve Malzemeler

Agaroz, Etidium bromür, Bromophenol blue (Sigma), Etanol, Glasiyal asetik asit (Merck), Sodyum asetat, HCI (Carlo Erba), Tris, EDTA, Gliserol, Xylene cyanol, Đsopropanol (Amresco), Sıvı azot, Moleküler ağırlık standartı (Vivantis), TBENC5'R-OF, TBEN5'CR-OR, TBENS4B-NS5-TBENC5'R-OF, TBENS4B-NS5-OR, TBENS4B-NS5-IF,

20

TBENS4B-NS5-IR, TBE913F, TBE1739R, TBE1192F TBE1669R (Đontek) primer seti, Viral RNA izolasyon kiti (Roche), RT-PCR kiti (Roche), Erlen, Beher, Cam Şişeler (100 ml, 500 ml, 1000 ml’ lik), Mezür, Bistüri, Forcep, Enjektör, Petri kapları (Isolab), Pipet uçları (Corning, Neptune, Eppendorf), Mikrosantrifüj ve PCR tüpleri (Axygen) ile diğer laboratuvar malzemeleri kullanıldı.

2.1.2. Cihazlar

Thermal cycler (Peqlab), Santrifüjler (Eppendorf, Hettich), UV transillüminatör (Syngene), Yatay elektroforez (Scie-plas), Güç kaynağı (Consort), Hassas terazi (Acculab), pH metre (Hanna), Otomatik pipetler (Eppendorf, Brand), Manyetik karıştırıcılar, Vorteks (Ika), Buz makinesi (Scotsman), Otoklav (Hiclave), Etüv (Memmert), Mikrodalga fırın (Arçelik), 4, -20 ve -80 oC’deki buzdolapları (Uğur, Arçelik, U410 premium), Fotoğraf makinesi (Sony) ve Saf su cihazları (Mes mp minipure, Millipore) kullanıldı.

2.1.3. Tampon ve Solüsyonların Hazırlanışı

2.1.3.1. 0.5 M EDTA Solüsyonu

16.81 g EDTA 90 ml H20 içerisinde manyetik karıştırıcı yardımı ile partiküller

tamamen çözününceye kadar karıştırıldı. pH:8.0’e ayarlandıktan sonra hacim 100 ml.’ye tamamlandı. Otoklavda 121 oC’de 20 dk. steril edildikten sonra, +4 oC’deki buzdolyaplarında muhafaza edildi.

2.1.3.2. 50X Tris Asetat EDTA (TAE) Tamponu

242 g Tris, 57.1 ml Glasiyal asetik asit ve 100 ml 0.5 M EDTA (pH:8) manyetik karıştırıcı yardımı ile partüküller çözününceye kadar karıştırıldı. Hazırlanan çözeltinin pH’ı Glasiyal asetik asitle 8.5’e ayarlandı ve toplam hacim distile su iL’ye tamamlandı. Steril edildikten sonra +4 oC’deki buzdolaplarında muhafaza edildi.

21

2.1.3.3. 1X TE Tamponu

1.2 g 10 mM Tris HCI ile 0.37 g 1 mM EDTA, 900 ml distile su içerinde manyetik karıştırıcı yardımı ile çözüldü. pH:8’e ayarlandıktan sonra hacim 1000 ml’ye tamamlandı. Hazırlanan tampon steril edildikten sonra +4 oC’deki buzdolaplarında muhafaza edildi.

2.1.3.4. 3M Sodyum Asetat Solüsyonu

41 g Sodyum asetat, 90 ml distile su içerisinde çözüldü. pH:5.0’a ayarlandıktan sonra hacim 100 ml’ye tamamlanır. Otoklavda steril edilerek +4 oC’de muhafaza edildi.

2.1.3.5. Etidyum Bromür

10 mg Etidium bromür, 10 ml steril distile su içerinde hazırlandı ve 4 oC’de muhafaza edildi.

2.1.3.6. 6X Bromophenol Blue

15 ml Gliserol, 0.25 g Bromophenol blue ile 0.25 g Xylene cyanol; 100 ml distile su içerisinde çözününceye kadar karıştırılarak hazırlandı.

22

2.1.3.7. Çalışmada Kullanılan Primerler

Çizelge 2.2 Bu çalışmada TBEV varlığını test etmek için kullanılan primerler (Melik, 2007, Ternovi 1999)

Primerler Sekans TBEV bölge (nt)

5'NCR-OF 5'NCR-OR (5'-AGA TTT TCT TGC ACG TGC AT-3') (5'-CTC TTT CGA CAC TCG TCG AGG-3') 1-20( +sense) 195-175(-sense) (195 bp) NS4B-NS5-OF NS4B-NS5-OR (5'-ATG AGT GGT GTG GTC AGG GGG-3')

(5'-TGC ATG CTG AAC ACG TCC ATT CC-3') 7582-7601(+sense) 8072-8050 (-sense) (490 bp) NS4B-NS5-IF NS4B-NS5-IR (5'-GGG GTT TTT GCC TCT TGG GC-3') (5'-CCC AGG CTT GTT ACC ATC TTT GG-3') 7611-7630 (+sense) 8024-8002(-sense) (413 bp) TBE1738R TBE1192F 5'-TGG CCA CTT TTC AGG TGG TAC TTG GTT CC-3') (5'-CAG AGT GAT CGA GGC CTG GGG GYA A-3') 1709-1738 (-sense) 1192-1217 (+ sense) (546 bp) TBE1669R TBE913F

(5'-AAC ACT CCA GTC TGG TCY CCT AGG TTG TA-3') (5'-TGC AAA TGC CAG GGA-3')

1640-1669 (-sense)

913-928 (+sense) (756 bp)

23

2.2. Yöntem

2.2.1. Kene Dokularının Ayrılması

Keneler -80 °C’den çıkarılarak petri kabı içine koyulduktan sonra, 400 µl RNAlater içinde steril bir bistüri yardımı ile boşaltım açıklığının hemen üst kısmından enine olarak ikiye kesildi, bütün dokuları dış iskelet kalacak şekilde dışarıya çıkarıldı. Dışarı çıkarılan dokular enjektör yardımı ile toplanıp ependorf tüplerine alındı. Enjektörün iğnesinden geçirilen dokuların tamamen parçalanması sağlandı. Oluşan bu homojenat 14000 rpm’de 5 dk. santrifüj edilerek süpernatantı pelletinden ayrıldı.

2.2.2. Viral R>A Ekstraksiyonu

Kenenin ayrılan dokularından viral RNA izolasyonu için Roche’un ‘High Pure Viral RNA’ kiti kullanılmıştır. Đzolasyon, kit prosedürüne uygun olarak şu şekilde yapılmıştır:

1. Poly(A) carrier RNA içerisine 400 µl Elution Buffer, Inhibitor Removal Buffer’a 20 ml, Wash Buffer’a ise 40 ml etanol ilave edilerek solüsyonlar hazırlandı. 2. 12 numune için, 5 ml Binding Buffer’a (4.5 M guanidine-HCI, 50 mM Tris-HCI, %30 Triton X-100, pH: 6.6) 50µl carrier RNA eklendi. Akabinde filtreli kolonlara her bir numune için 200 µl serum ile 400 µl Binding Buffer+carrier RNA ilave edildi.

3. 8 000 x g’de 15 s santrifüj edildi ve sonrasında collection tüpleri atılırak yeni tüpler kullanıldı.

4. Sonra, filtreli kolonlara 500 µl Inhibitor Removal Buffer (5 M guanidine-HCI, 20 mM Tris-guanidine-HCI, pH: 6.6) ilave edildi.

5. 8 000 x g’de 1 dk. santrifüj edildi ve collection tüpleri atılarak yerlerine yeni tüpler yerleştirildi

6. Sonrasında her bir tüpe 450 µl Wash Buffer (20 mM NaCI, 2 mM Tris-HCI, pH: 7.5) eklendi ve 8 000 x g’de 1 dk. santrifüj edildikten sonra collection tüpleri atılırak yeni tüpler yerleştirildi.

7. Tekrar 450 µl Wash Buffer eklenerek 8 000 x g’ de 1 dk. santrifüj edildi. 8. Sonrasında 10 s kadar tekrar santrifüj yapıldıktan sonra collection tüpleri atıldı ve yerine eppendorf tüpleri yerleştirildi.

24

9. Filtreli kısıma 50 µl Elution Buffer (Nükleaz saf su) eklenerek, 8 000 x g’de 1 dk. santrifüj edildi.

10. Son aşamada ise, filtreli kolonlar atıldı ve eppendorf tüplerindeki ekstraksiyon ürünleri etiketlenerek -80 ° C‘de saklandı.

2.2.3. One-Step Reverse Transkripsiyon Polimeraz Zincir Reaksiyonu (RT-PCR)

RNA ekstraksiyonu sonucunda elde edilen örnekler, Roche transcriptor one-step RT-PCR kiti kullanılarak, RT-RT-PCR’ı yapıldı. Kit içeriğine göre:

RNase free su (Vial 3) 13.5 µl 5X RT-PCR buffer (Vial 2) 5 µl

Upstream primer 1 µl Downstream primer 1 µl Transcriptor Enzim mix (Vial 1) 0.5 µl Templete RNA 4 µl

Bu işlemler sonucunda numunelerin toplam hacmi 25 µl olacak sekilde hazırlanmıştır.

2.2.3.1. Thermal cycler’ın Program Ayarı

Thermal cycler’ın programı; Denatürasyon için 94 °C’de 2dk.’ya, 50-60 °C’de 15 s (annealing), 72 °C’de 1dk.’ya (extension) ve Final extension için ise 72 °C’de 5 dk.’ya ayarlandı.

2.2.4. Agaroz Jel Elektroforezi 2.2.4.1. Agaroz Jelin Hazırlanması

1 gr agaroz ve 5 ul etidyum bromid eklendikten sonra bir mikro dalga fırında jel haline getirildi. Agaroz jel eletroferez tankına döküldü ve jelin soğuyup katılaşması beklendi.

25

Katılaşan jelin üzerine TAE tamponu döküldü, tarak çıkarıldı ve yükleme yapmak için jel hazır hale getirildi.

2.2.4.2. Örneklerin Agaroz Jele Yüklenmesi ve Yürütülmesi

PCR sonrasında elde edilen ürünler %1’lik agaroz jel elektroferezi kullanılarak görüntülendi. Kısaca her bir tüpe 2 µl bromfenol mavisi (BFB) ile 5 µl DNA örneği eklenerek kısa süreli spin yapıldı. Đlk kuyucuğa 2-4 µl DNA MW standardı diğerlerine de PCR ürünleri koyuldu. Güç kaynağı 100 ampere ayarlandı ve yaklaşık 30 dakika koşturuldu. Jeller jel dökümantasyon cihazında ultraviyole ışık altında görüntülendi ve jel görüntüleri bilgisayara kaydedildi

2.2.5. D>A Dizi Analizi

Jel elektroforezi sonucunda elde edilen şüpheli DNA bantları veren örneklere ait PCR ürünleri DNA dizisinin belirlenmesi için REFGEN (Ankara) firmasına gönderildi. Elde edilen sekanslar NCBI BLAST proğramı kullanılarak bilinen viral sekanslarla karşılaştırıldı.

26

3. BULGULAR

Bu çalışmada Tokat, Amasya, Ordu ve Fatsa bölgelerinden toplanan kenelerde kene kökenli ensefalit virüsünün varlığı RT-PCR yöntemiyle araştırılmıştır. Çalışmamızda, Tokat, Amasya, Ordu ve Fatsa bölgelerinden toplanan toplam 918 kene örneği TBEV varlığı için RT-PCR yöntemiyle test edilmiştir.

3.1. Tokat ve Amasya Bölgesi Kenelerinde TBE Varlığı:

Bu çalışmada, 2007-2009 yılları arasında arazi çalışmaları sonucunda toplanmış 690 kene örneği TBEV spesifik primerler setleri kullanılarak RT-PCR’ı yapılmıştır. Test edilen kenelerden RT-PCR ürünleri pozitif bant veren 4 şüpheli örnek DNA dizi analizi yaptırılmış ve bunlarında nonspesisfik bantlar olduğu anlaşılmıştır (Şekil 3.1.a). Dolayısyla RT-PCR sonuçlarına göre Tokat bölgesinde test edilen kene örneklerinde TBEV varlığı saptanamamıştır.

3.2. Ordu Merkez ve Fatsa Bölgesi Kenelerinde TBE Varlığı:

Bu çalışmada, 2010 yılı yaz aylarında Ordu Merkez ve Fatsa ilçelerinde insanlardan toplanan 228 adet Ixodes ricinus kene örneği TBEV spesifik primerler setleri kullanılarak RT-PCR ile test edilmiştir. Test edilen keneler arasında RT-PCR ürünleri pozitif bant veren 6 şüpheli örnek DNA dizi analizi yaptırılmış ve fakat bunlarında nonspesisfik bantlar olduğu anlaşılmıştır (Şekil 3.1.b). Sonuç olarak RT-PCR sonuçlarına göre Ordu ve Fatsa bölgesinde test edilen kene örneklerinde de TBEV varlığı saptanamamıştır.

27 b. ) STD K39

Şekil 3.1 RT-PCR sonrası dizi analizine giden PCR ürününün agaroz jel elektroforezi (%1’lik) yöntemi kullanarak görüntülenmesi a.) TBENS4B-NS5-IF ve-NS5-IR primer setleri b.) TBENS4B-NS5-OF ve TBE-NS4B-NS5-OR primer setleri kullanılmıştır.

500 bp 350 bp

28

4. TARTIŞMA ve SO>UÇ

Ülkemizde en az 39 sert kene türü bulunmakta (Bursalı et al. 2011) ve bunların bir kısmının kene kökenli patojenleri taşıdığı gösterilmiştir (Güner, 2003, Tekin et al. 2009). Örneğin Tokat ve Amasya bölgesinden hayvan ve insanlardan toplanan kenelerde Kırım Kongo Kanamalı ateşi virüsü (KKKAV) varlığı daha önce gösterilmiştir (Tekin 2009; Bursalı et al. 2011). Ayrıca kenelerde Borrelia burgdoferi varlığı da Güner (2003) tarafından rapor edilmiştir (Güner, 2003).

Ülkemizde kenelerde KKKAV varlığı test edilmesine rağmen, TBEV ve diğer kene kökenli virüslerin varlığı konusunda çok fazla bilgi bulunmamaktadır. Ülkemizde daha önce yapılan çalışmalarda TBE virüs varlığı daha çok prevalans çalışmalarında serolojik olarak incelenmiştir ve pozitif sonuçlar alınmasına rağmen, çoğu seropozitifler viral nötralizasyon ile tam olarak doğrulanmamıştır (Nuhoğlu, 2008). Bu hastalık çoğunlukla asemptomatik seyretmesi ve düşük mortaliteye sahip olması nedeniyle fazla dikkatle önemsenmemektedir.

Çalışmamızda test ettiğimiz örneklerden özellikle Tokat ve Amasya bölgelerinden toplananlarda TBEV olmaması çok şaşırtıcı değildir. Çünkü bu bölgelerde özellikle Hyalomma cinsi kene türleri test edilmiş olup bunlar arasında TBEV vektörü olarak bilinen kene türleri çok az miktarda bulunmaktadır. Buna karşılık Ordu ve Fatsa’dan toplanan ve başlıca TBEV vektörleri olarak bilinen kene türlerinden biri olan I. ricinus türü kenelerde test ediliş olmasına rağmen bu kenelerde RT-PCR sonuçlarına göre TBEV varlığı bulunamamıştır. Bu negatif sonucun alınmasında örnek sayısının az olması ve örneklerin özellikle yaz sonuna doğru toplanmasının etkili olduğu tahmin edilmektedir. Ayrıca klasik RT-PCR hassasiyeti real time PCR’a göre düşük olduğundan, özellikle Avrupaya daha yakın olan Trakya ve Batı Karadeniz Bölgesinden toplanacak yeni örneklerin real time RT-PCR yöntemiyle test edildiği takdirde daha farklı sonuçlar alınması mümkün görülmektedeir.

Sonuç olarak bu çalışma da ülkemizde özellikle Orta Karadeniz Bölgesi’nde TBEV varlığı moleküler yöntemler kullanılarak ilk kez test edilmiştir. RT-PCR ve DNA sekans analiz sonuçları Tokat, Amasya, Ordu ve Fatsa bölgelerindeki sert kenelerde TBEV bulunmadığını ve dolayısıyla bölge kenelerinin test edildiği kadarıyla TBEV

29

bulaştırma riski taşımadıklarını göstermiştir. Trakya ve Karadeniz bölgesinde daha geniş bir alanda ve daha çok örneğin test edilmesi bölge kenelerinin TBEV taşıma potansiyellerinin kesin olarak ortaya konmasını sağlayacaktır. Ayrıca bu çalışma, ileride kenelerde TBEV varlığını ortaya koymak için yapılması muhtemel çalışmalara ışık tutacak olması açısından önemlidir.

KAYAKLAR

Anonim, 2006. http://webpages lincoln.ac.uk/fruedisueli/Fwebpages/parasitology, (06.04.2004).

Anderson, JF., 2008. Biology of ticks. Infect Dis Clin North Am 22(3), 195-215.

Allwinn, R., Doerr H.W., Emmerich, P., Schmitz, H., Preiser W., 2002. Cross-reactivity in Flavivirus serology new implications of an old finding. Med Microbiol

Immunol(Berl), 34-35.

Blaskovic, D., 1958. Epidemiologische und immunologische Problemebei Zeckenenzephalitis Wiener klin. Wschr 70(7),742–749.

Bock, H., Klockmann U., Jungst C., 1990. A new vaccine against tick borne encephalitis: Including a dose-response study. 8(1), 22-24.

Bodemann, H.H., Pausch J., Schmitz H., Hoppe-Seyler G., 2000. Die Zeckenzephalitis (FSME) als Labor-Infektion Med, 78-89.

Bursali, A., Ozkan M.,, and Tekin S., 2008. Tokat ve Civarı Sert kenelerini Sistematik Yönden incelenmesi, 19. Ulusal Biyoloji Kongresi 23-27 Haziran, Trabzon. Bursali, A., Tekin S.,, Orhan, M., Keskin, A., and M. Ozkan. 2009. Geographical distribution, species diversity, and seasonal activity of ixodid ticks infesting humans in Turkey. In Proceedings, 5 SOVE Congress, 11-16 October, 2009 Belek, Antalya, Turkey

Bursali, A., Tekin S., Orhan, M., Keskin, A., M. Ozkan. 2010. Ixodid ticks (Acari: Ixodidae) infesting humans in180-186.Tokat province of Turkey: species diversity and seasonal activity. J Vector Ecol. 35.

Chambers, T.J., Hahn, C.S, Galler, R., Rice, C.M., 1999. Flavivirus genome organization, expression and replication. Annu. Rev. Microbiol: 649–688. Dumpis, U., Crook, D., Oksi J., 1999. Tick-borne encephalitis. Clin Infect Dis, 28: 882-890.

Gallia F., Rampas, J., Hollender L., 1949. Laboratorni infekce encefalitickym virem. 224-229.

Gresikova, M., Kozuch, O., Nosek, J., 1968. Die Rolle von Ixodes ricinus als Vektor Zeckenenzephalitisvirus in verschiedenen mitteleuropäischen Naturherden.

Zbl. Bakt. Parasit. 207: 423–429.

Gunther, G., Hanglund, M., Lindquist, L., Forsgren, M., Sköldenberg, B., 1997. Tick-borne encephalitis in Sweden in relation to aseptic meningoencephalitis

of other etilogy: a prospective study of clinical course and outcome: 230-238. Gustavson, R., Forsgren, M., Gardulf, A., Granstrom, M., Svenungsson, B.,1993.

Clinical manisfestations and antibody prevalence of Lyme borreliosis and

tick-borne encephalitis in Sweden a study in five endemic areas close to

Stockholm. Scand J. Infect Dis., 25(5), 595-603.

Haglund, M., Göran, G., 2003. Tick-borne encephalitis-pathogenesis, clinical course and longterm follow-up. Vaccine 2003, 21:S1/11–18.

Heinz, F.X., 1999. Sequence analysis and genetic classification of tick-borne viruses. from Europe and Asia. J. Gen. Virol, 80(2), 179–185.

Heinz, F.X., Collett, M.S., Purcell, R.H., 2000. Virus taxonomy: the classification and nomenclature of viruses. The seventh report of the Đnternational

Commitee for the Taxonomy of Viruses. San Diego: Academic Press, 858-8. Heinz, F.X., 2003. Molecular aspects of TBE virus research. Vaccine 21: S1/3–S1/10.

Heinz, F.X., Mandl, C.W, Holzmann, H., Kunz, C., Harris, B.A, Rey Ret al., 2005. The flavivirusenvelope protein E: Isolation of a soluble dimeric form from tick- borne encephalitis virus and its crystallization. 291-298.

Holzmann, H., Vorobyova, M.S, Landyzhenskaya, I.P, Ferenczi, E., Kundi, M., Kunz, C., et al., 1992. Molecular epidemiology of tick-borne encephalitis virus: cross protection between European and Far-Eastern subtypes. 345–349. Kim, S., Jeong, Y., Yun, M., 2009. Division of Arbovirus, Center for Immunoloji and pathology. 23(5), 15-20.

Kozuch, O., Chunikhin, S.P., Gresikova, M., Nosek J., Kurenkov, V.B., Lysy, J.,1981. Experimental characteristic of viraemia caused by two strains of

tick-borne encephalitis virus in small rodents. Acta Virol 25(3), 219-224.

Kunz, C., 2003. TBE vaccination and the Austrian experience. Vaccine 21: S2/50–55.

Labuda, M., Austyn, J.M., Zuffova, E., 1996. Đmportance of localized skin infection

in tick-borne encephalitis virus transmission. Virology 219(4), 357-366. Labuda, M., Eleckova, E., Lickova, M., Sabo, A., 2002. Tick-borne encephalitis virus. foci in Slovakia. Int J Med Microbiol. 291 Suppl 33 (43–7).

Lindgren, E., Talleklint, L., Polfeldt, T., 2000. Impact of climatic change on the northern Latitude limit and population density of the disease-transmitting European tick Ixodes ricinius. Environment Health Perspect 108(7), 119-123.

Mickiene, A., et al., 2005. TBE-clinical course and outcome. Review of literature in Progress.

Mutluay, N., 2009. Tokat ve çevresindeki sert kenelerde kırım kongo kanamalı ateşi virüsünün real tıme RT-PCR yöntemi ile teşhisi (Yüksek Lisans Tezi), Gaziosmanpaşa Üniversitesi. Biyoloji Bölümü, Tokat.

Nuhoğlu, 2008. TAF Preventive Medicine Bulletin, Derleme/Review Article TAF Prev Med Bull 2008; 7(5):461-468.

Pogodina, V.V., Frolova, M.P., Erman, B.A., 1986. Chronic tick –borne encephalitis. Moscow: Nauka, 234.

Radda, A.C., Kunz, C., 1983. Die Frühsommer-Meningoenzephalitis in

Mitteleuropa. Kinderarzt 1983; 14: 714–724.

Rey, F.A, Heinz, F.X, Mandl, C., Kunz, C., Stephen, C., 1995. The envelope glycoprotein from tick-borne encephalitis virus at 2A resolution. Nature; 375: 292-298.

Roggendorf, M.E., 1996. Epidemiologyo tick-bore encephalitis virusi n Germany. Infection, 24:465-6.

Saijo, M., Tang, Q., Shimayi, B., 2005. Recombinant nucleoprotein-based serological diagnosis of Crimean-C5ttongo hemorrhagic fever virus infections. J Med Virol,75, 295-299.

Saijo, M., Tang, Q., Shimayi, B., Han, L., Zhang, Y., Asiguma, M., Tianshu, D., Maeda, A., Kurane, I., Morikawa, S., 2004. Possible horizontal transmission of Crimean-Congo heamorrhagic fever virus from a mother to her child. Jpn J Infect Dis, 57, 55-57.

Sanchez, A., Vincent, M.J., Nichol, S.T., 2002. Characterization of the glycoproteins of Crimean-Congo haemorhagic fever, Viral, 76, 7263-7275.

Schmaljohn, C.S, Hooper, J.W., 2001. Bunyaviridae: the viruses and their replication. Fields Virology. Ed: Knipe, D.M., Howley, P.M., Philadelphia, 1581-160.

Schneider, H., 1931. Über epidemische akute “Meningitis serosa”. Wiener klin. Wschr. 44(1), 350–352.

Schwaiger, M., Cassinotti, P., 2003. Development of a quantitative real-time RT-PCR

assay with internal control for the laboratory detection of TBEV RNA. 27(2), 136-45.

Skarpaas, T., Ljostad, U., Sundoy, A., 2004. First human cases of tick- borne encephalit Norway. Emerg Infect Dis./248-12

Sonnenberg, K., Niedrig M., Steinhagen K., Rohwader E., MeyerW., Schlumberger W.,

Stocker W., 2004. State-ofthe-art serological techniques for detection of

antibodiesagainst tick-borne encephalitis virus. Int J Med Microbiol. 293 Suppl 37(2), 148-51.

Swanepoel, R., Shepherd, A.J., Leman, P.A., Shepherd, S.P., Miller, G.B., 1985. A commonsource outbreak of Crimean-Congo haemorrhagic fever on a dairy farm. S Afr Med J, 68, 635-637.

Swanepoel, R., 1995. airovirus infections. Exotic viral infections. Ed: Porterfield, J.S., Chapman & Hall, London, pp. 285- 293.

Süss, J., Sinnecker, H ., Sinnecker, R., Berndt, D., Zilske, E ., Dedek, G., 1992. Epidemiology and ekology of tick-borne encephalitis in the eastern part of Germany between 1960 and 1990 and studies on the Dynamics of a natural focus of tick-borne encephalitis, 224-235. Nuttall PA, Labuda M: Dynamics of

infection in tick vectorsnand at the tick-host interface. Adv Virus Res, 233–7. Takeda, T., Ito, T., Osada, M., Takahashi, K., Takashima, I., 1999. Isolation of tick-

borne encephalitis virus from wild rodents and a seroepizootiologic survey in

Hokkaido, Japan. Am- J Trop Med Hyg. 60 (1), 287–291.

Tekin, S., A. Bursali, Mutluay, N., Ozkan, M., 2009. A molecular survey on ticks for Crimean-Congo haemorrhagic fever virus (CCHFV) in Turkey. In Proceedings, 5SOVECongress, 11-16 October, Belek, Antalya, Turkey.

Vaisviliene, D., Kilciauskiene, V., Zygutiene, M., Asokliene, L., Caplinskas, S., 2002. TBE in Lithuania: epidemiological aspects and laboratory diagnosis. Int J Med Microbiol. 291 Suppl 33-181.

Virus Taxonomy, 2000. Seventh Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses.

Waldvogel, K., Bossart, W., Huisman, T., Boltshauser, E., Nadal, D., 2000. Severe tick-

borne encephalitis following passive immunization.

Watts, D.M., Ussery, M.A., Nash, D., Peters, C.J., 1989. Inhibition of Tick-borne. encephalitis viral infectivity yields in vitro by ribavirin. Am J Trop Med Hyg, 41, 581-585.

ÖZGEÇMĐŞ

Kişisel Bilgiler

Adı Soyadı : Tünay KARAN

Doğum Tarihi ve Yeri :08.10.1984 TOKAT-MERKEZ Medeni Hali : Bekar

Yabancı Dili : Đngilizce Telefon : 0541 214 75 05

e-mail : biyo_tunay@hotmail.com

Eğitim

Derece Eğitim Birimi Mezuniyet Tarihi Lisans Cumhuriyet Üniversitesi / SĐVAS 2007 Lise Gaziosmanpaşa Lisesi / TOKAT