T.C. ANKARA ÜNİVERSİTESİ BİLİMSEL ARAŞTIRMA PROJESİ
KESİN RAPORU
Allojeneik Kök Hücre Naklinden Sonra Atopik Durumun Değerlendirilmesi
Proje Yürütücüsü: Günhan Gürman, Prof.Dr.
Yardımcı Araştırmacılar:
Klara Dalva Yrd. Doç. Dr., Pervin Topçuoğlu Doç. Dr.
Dilşad Mungan, Prof. Dr., Zeynep Mısırlıgil Prof. Dr.
Mübeccel AkdişDoç. Dr., Cezmi AkdişProf. Dr.
Proje Numarası: 09B3330001
Rapor Tarihi: Temmuz 2012
Ankara Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Ankara" 2012 "
T.C. ANKARA ÜNİVERSİTESİ BİLİMSEL ARAŞTIRMA PROJESİ
KESİN RAPORU
Allojeneik Kök Hücre Naklinden Sonra Atopik Durumun Değerlendirilmesi
Proje Yürütücüsü: Günhan Gürman, Prof.Dr.
Yardımcı Araştırmacılar:
Klara Dalva Yrd. Doç. Dr., Pervin Topçuoğlu Doç. Dr.
Dilşad Mungan, Prof. Dr., Zeynep Mısırlıgil Prof. Dr.
Mübeccel AkdişDoç. Dr., Cezmi AkdişProf. Dr.
Proje Numarası: 09B3330001
Başlama Tarihi : 01/02/2009
Bitiş Tarihi: 01/02/2011(+1 yıl)
Rapor Tarihi: Temmuz 2012
Ankara Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Ankara" 2012 "
I. Projenin Türkçe ve İngilizce Adı ve Özetleri
Allojeneik Kök Hücre Naklinden Sonra Atopik Durumun Değerlendirilmesi Evaluation of Atopic Status After Allogeneic Stem Cell Transplantation
Özet: Allojeneik kök hücre nakli, günümüzde hematolojik maliniteler, bazı genetik hastalıklar ve immün yetmezlik hastalıklarının tedavisinde giderek yaygınlaşan bir tedavi yöntemidir. Bu amaçla kemik iliği, çevre kanı ya da kordon kanındaki öncü hücreler kullanılabilir. Allojeneik Hematopoietik Kök Hücre Nakli (AlloHKHN) öncesinde uygulanan tedavi ile alıcının kemik iliği etkin bir şekilde baskılanmakta ve HKHN sonrası tamamen verici kaynaklı bir immünite oluşmaktadır. Hematopoietik kök hücre naklini takiben gelişen atopik reaksiyonlar hakkında genellikle vaka sunumları olarak raporlanmış çeşitli çalışmalar bulunduğu gibi, atopik olmayan donörlerden atopik hastalara HKHN uygulandıktan sonra alıcıda allerjik belirtilerin ortadan kaybolduğu olgular da bildirilmiştir.
Günümüzde otoimmün hastalıklar ve allerjik hastalıkların tedavisine yönelik birçok yöntemler geliştirilmiş olsa da henüz bu hastalıkları tamamen ortadan kaldıracak bir tedavi söz konusu değildir. Allojeneik HKHN, mortalite ve morbiditesi yüksek olduğundan henüz sözü edilen bu hastalıkların tedavisi için uygun bir yöntem olarak kullanılmamaktadır.
Bu çalışmada HKHN ile alıcılardaki atopinin transfer edilebilirliği yanı sıra, atopik olmayan vericilerle mevcut allerjinin ortadan kaldırılıp kaldırılamayacağına hem klinik hem de hücresel değerlendirmelerle bir yanıt aranması hedeflenmiştir.
Şubat 2010-2012 tarihleri arasında Ankara Üniversitesi Tıp Fakültesi Hematoloji Bilim Dalı’nda kök hücre nakli uygulanması planlanmış olan (nakil başarısı beklenen) 20 çiftten 17 alıcı ve verici çifti çalışmaya dahil edilebilmiştir(Tablo1). Halen takip edilen hasta sayısı onüçtür. Nakil olmuş olan hastaların dördü nakilden sonraki 1 yıllık kontrolleri yapılmadan kaybedilmiştir. İki hasta nakil sürecinden çok kısa bir süre önce kaybedildiği, bir hasta kendi isteği ile nakilden vazgeçtiği için çalışma dışında kalmıştır.
Çalışmaya alınan 20 hasta ve vericiye ait cilt testlerinin sonucuna göre sadece 4 hastada, herbirinde farklı alerjenlere karşı olmak üzere pozitif reaksiyon gözlenmiştir. Hiçbir vericide cilt reaksiyonu gözlenmemiştir (Ek-c , Tablo 2). Nakil öncesinde 3 farklı antijene pozitif reaksiyon gösteren bir hastanın nakil sonrası kontrolünde hiçbir allerjene reaksiyon göstermediği gözlenmiştir. Reaktif olan diğer 3 hastanın kontrole gelerek cilt testlerini yaptırması ve kan örneği vermesi süreci devam etmektedir. Hasta-vericilerin serum örnekleri IgE ölçümleri için dondurularak saklanmıştır. Vaka sayısının artması ile atopik reaksiyon gösteren birey sayısının biraz daha artması sağlandığında IgE ölçümleri topluca yapılacak ve seçilecek antijenlerin titrasyon çalışmalarını takiben dondurularak saklanmış olan kısıtlı sayıdaki hücrelerin uyarılmasını takiben hücre proliferasyonları değerlendirilecektir. Bu süreç içerisinde yöntem ile ilgili optimizasyon çalışmaları yapılarak hücrelerin kontamine olmadan yaşamlarının sürdürülebildiği kanıtlanmıştır.
HKHN öncesinde atopik olan 4 hastanın tespit edilmesi ve kontrol verisi olan bir hastada nakil sonrasında atopik reaksiyonların kaybolması olgu sayısını arttırarak, istatistiksel bir değerlendirmeye fırsat verecek düzeye çıkarmamız gerektiğini destekler niteliktedir.
Summary: Allogeneic Hematopoietic Stem Cell Transplantation(AlloHSCT) is a widely used therapeutic approach for the treatment of several hematological malignancies, immunodeficiences and for some genetic abnormalities. By the application of a conditioning regimen, the immun system of the recipient is suppressed effectively to be able to rebuild a donor originated immunity. There are some publications that report an atopic reaction following a AlloHSCT. Also there are some reports that inform about disapparence of the atopic reaction after AlloHSCT from an non-atopic donor. Currently insipite of several therapeutic approaches for the treatment of otoimmune diseases and severe allergic reactions there is not a complete cure chance for these patients. The high morbidity and mortality rates restrict the use of AlloHSCT as a therapeutic approach.
The aim of this study is to evaluate the transfer of an atopic reaction and also the disappearence of an atopic reaction following AlloHSCT using clinical and cellular techniques.
A total of 20 patients with a median age of 41 planning for alloHCT from their HLA- matched siblings were enrolled in the study between 2010-2012 (Table 1). AlloHSCT was performed to 17 of them. Two of them died before HSCT and one patient decided to try other therapeutical approaches. Four of the patients were excluded because of transplant related mortality within 3-6 months. Thirteen of the patients are being monitored for the evalauation of atopic reactions. According to the first results of 20 patient-recipients, there were only four patients that gave a reaction (min:1, max:4 antigen, table 2). There was not a reactive donor. One of the patients that was reactive to 3 antigens was completly non reactive for this antigens following AlloHSCT. The monitoring process of 3 patients are in progress.
The serum samples collected and freezed for the measurement of specific IgE responces, the measurements will be completed upon the increase of reactive cases at least to 6-10, all in once. Following the titration studies with the specific antigens the cellular responces will be evaluated by the using of cryopreserved cells. During this period, in 3 sets of cells we tested for the CSFE content of the cells and the CD69 expression following a 5 day culture with 2 randomly selected allegens and confirm the viability of the cells and could not detect any proliferation or activation signal as expected.
The disappearance of the atopic reaction in one of the patients following AlloHSCT is stimulating us to increase the number of the cases to be able to make an evaluation.
II. Amaç ve Kapsam:
Allojeneik kök hücre nakli, günümüzde akut ve kronik lösemiler, aplastik anemi, miyelodisplastik sendromlar, multiple miyelom, lenfomalar gibi hematolojik maliniteler, bazı genetik hastalıklar ve immün yetmezlik hastalıklarının tedavisinde giderek yaygınlaşan bir tedavi yöntemidir. Hematopoietik kök hücre naklini(HKHN) takiben gelişen atopik reaksiyonlar hakkında genellikle vaka sunumları olarak raporlanmış çeşitli çalışmalar bulunmaktadır. Bunu açıklayabilecek mekanizmalardan biri, vericiden alıcıya transfer edilen
“olgun hafıza B” hücreleridir. Bu hücrelerin görülen atopik reaksiyonlardan tek başlarına sorumlu olup olmadıklarına dair ise yeterli kanıt bulunmamaktadır.
Kök hücre naklini takiben alıcıya verici hücreleri ile aktarılan enfeksiyon, otoimmun hastalık, maliniteler yanı sıra nakil sonrasında raporlanan egzema ve gıda-ilaç alerjisi, astım benzeri reaksiyonlar da bildirilmiştir. Nakil sonrasında alıcıların serumunda yüksek IgE değerleri tesbit edilse de yarılanma ömrünün kısa olması nedeniyle, bu reaksiyonların vericiden taşınan yüksek IgE düzeyleri ile açıklanması mümkün değildir. Allerjene özgün olan verici lenfositlerinin olgun hücreler ya da öncü hücreler olarak aktarılmaları daha büyük bir olasılıktır. Bir çalışmada nakil öncesi ve sonrasında uygulanan deri testleri ile alıcıda nakil sonrasında vericidekine benzer bir reaksiyon profili oluştuğu tesbit edilmiş, bazı olgularda alerjik rinit ve astım ortaya çıkmıştır. Bu bulgular, HKHN ile özgün IgE hafızasına sahip
“olgun” hücrelerin transferi ile açıklanmıştır.
Allojeneik HKHN öncesinde uygulanan tedavi ile alıcının kemik iliği etkin bir şekilde baskılanmakta ve HKHN sonrası tamamen verici kaynaklı bir immünite oluşmaktadır.
Yukarıda da belirtildiği gibi atopik bir vericiden allerjen spesifik IgE sentezleme yeteneğine sahip B lenfosit klonlarının nonatopik alıcıya transferi mümkün olmaktadır. Eğer HKHN sonrası vericinin immün hücreleri alıcıda egemen hale geçiyorsa; atopik olmayan bir vericiden atopik bir alıcıya HKHN uygulanması sonucu alıcıdaki atopinin ortadan kalkması da beklenebilir. Atopik olmayan donörlerden atopik hastalara HKHN uygulandıktan sonra alıcıda allerjik belirtilerin ortadan kaybolduğu olgular bildirilmiştir. Kronik myelositer lösemili ve atopik dermatitli bir olguda atopik olmayan vericiden uygulanan HKHN sonrası atopik dermatit bulgularının ortadan kalktığı rapor edilmiştir.
Günümüzde otoimmün hastalıklar ve allerjik hastalıkların tedavisine yönelik birçok yöntemler geliştirilmiş olsa da henüz bu hastalıkları tamamen ortadan kaldıracak bir tedavi söz konusu değildir. Allojeneik HKHN, mortalite ve morbiditesi yüksek olduğundan henüz sözü edilen bu hastalıkların tedavisi için uygun bir yöntem olarak kullanılmamaktadır. Ancak otoimmünite ve atopi üzerindeki etkilerinin araştırılması ile HKHN’nin immün sistemi yeniden yapılandırma mekanizmalarını daha iyi anlamak mümkün olacaktır.
Amaç: Bu çalışmada HKHN öncesinde verici ve alıcıda, HKHN sonrasında alıcılardaki atopik durumun hem klinik hem de hücresel olarak değerlendirilmesi planlanmıştır. Şimdiye kadar olgu bildirimleri ve az sayıdaki olguları içeren çalışmalarda öne sürülen hipotezin iki yönlü olarak incelenmesi ve atopinin transfer edilebilirliği yanı sıra, atopik olmayan vericilerle mevcut allerjinin ortadan kaldırılıp kaldırılamayacağına hem klinik hem de hücresel değerlendirmelerle bir yanıt aranması hedeflenmiştir. Özellikle atopinin ortadan kaldırılabileceğine dair verilerin oluşması halinde bu hastalıkların tedavisine yönelik yeni beklentilere temel oluşturacak ve araştırmalara ışık tutacaktır.
III. Materyal ve Yöntem
Kök Hücre naklinden sonra gelişen atopik yanıtın, atopik reaksiyonların sebeplerinin
aydınlatılması amacıyla çeşitli hematolojik maliniteler nedeni ile kök hücre nakli planlanmış olan 60 hastanın çalışma kapsamına alınması ve aşağıda özetlenmiş olan çalışmaların yapılması planlanmıştır
• Çalışma başlangıcında kök hücre verici ve alıcılarına, 12. ve 24. ayda sadece alıcılara hekim tarafından allerjik hastalıkların varlığına ilişkin “European Community of Respiratory Health Survey(ERCHS) anketleri doldurulması (AÜTF Alerjik Hastalıklar Bilim Dalı)
• Verici ve alıcılarda atopik durumun değerlendirilmesi için standart allerjen paneli ile deri prick testleri uygulanması. Deri testleri her hastaya ve vericisine nakilden önce ve sadece hastalara nakilden 1 ve 2 yıl sonra tekrar uygulanacktır (AÜTF Alerjik Hastalıklar Bilim Dalı)
• Özgün antikor yanıtlarının tesbiti: Nakil öncesi ve takiben 1. ve 2. yılda hasta(alıcı) kan örneklerinde varsa antikor yanıtlarının ölçülmesi, (A.Ü.T.F Hematoloji Bilim Dalı laboratuarında kan örneklerinden serumları ayrılarak, serumlar dondurulacak Swiss Institute of Allergy and Asthma Research(SIAF)’a gönderilecektir. Ölçümler, SIAF’da ELISA yöntemi ile yapılacaktır)
• Perifer kandaki özgün T hücrelerin tesbiti. Sadece özgün antikor yanıtı oluşturduğu tesbit edilen bireylerde özgün T hücre yanıtlarını değerlendirmesi ile ilgili çalışmalar yapılacaktır (nakil öncesinde ve takiben 1.yılda ve 2.yılda, AÜTF Hematoloji BD Laboratuarı)
T Hücre kültür süpernatanlarında Sitokin (IL- 4, IL-5, IL- 10, IL-13, IFN-G) düzeylerinin ölçümü (ELISA ölçümleri SIAF da yapılacak)
Antijene Özgün T hücrelerin RT-PCR ile tesbiti (ölçümler SIAF’da yapılacak)
CFSE ile Hücre Bölünmesinin (proliferasyonunun) Değerlendirilmesi Hücre proliferasyonunun ölçülmesi (AÜTF Hematoloji BD Laboratuarı)
Şubat 2010-2012 tarihleri arasında Ankara Üniversitesi Tıp Fakültesi Hematoloji Bilim Dalı’nda kök hücre nakli uyulanması planlanmış olan (nakil başarası beklenen) 20 çiftten 17 alıcı ve verici çifti çalışmaya dahil edilebilmiştir. Halen takip edilen hasta sayısı onüçtür.
Nakil olmuş olan hastaların dördü nakilden sonraki 1 yıllık kontrolleri yapılmadan kaybedilmiştir. İki hasta nakil sürecinden çok kısa bir süre önce kaybedildiği, bir hasta kendi isteği ile nakilden vazgeçtiği için çalışma dışında kalmıştır.
Çalışmaya alınması planlanan 20 hasta ve vericisine nakil yapılmadan önce ERCHS anketleri ve deri testleri uygulanmıştır. Eş zamanlı olarak kan örnekleri alınarak serumları ayrılmış ve porsiyonlanarak varsa spesifik IgE yanıtlarının değerlendirilebilmesi için -80°C de dondurularak saklanmıştır. İlk olguların çalışmaya dahil edildiği dönemde European Federation for Immunogenetics, EFI tarafından akredite olan laboratuarımızın denetimini takiben müfettişlerin raporlarında belirtmeleri üzerine laboratuarda başlatılan tadilat nedeni ile steril çalışma koşulları ortadan kalkmış ve hücre ayırma, hücre kültürü çalışmaları uygulanamamıştır. 2010 yılının sonundan başlayarak hücreler varsa spesifik olan antijenlerle uyarılmalarını değerlendirmek üzere yapılacak kültür çalışmalarında kullanılmak üzere
dondurularak saklanmaya başlanmıştır. Bu amaçla toplanan kan örneklerinden aseptik koşullarda (Laminar-air flow içinde) dansite gradienti kullanılarak hücreler ayrılmış, bir dizi yıkama işlemini takiben canlılıkları değerlendirilmiş ve hücre sayımlarının yapılmasını takiben DMSO ve FCS içeren, amino asitler, antibiyotik ve L-Glutamin ile zenginleştirilmiş bir ortam içinde(cRPMI) dondurularak saklanmıştır. Bu örnekler arasında belirli sayıda hücre toplanabilen 3 olgunun hücrelerinin bir kısmı ayrılarak deneme ve kültür ortamının test edilmesi amacıyla daha önceden laboratuvarda mevcut olan 2 allerjen ile CO2 enkübatöründe %5 CO2, %95 nem ortamında kültüre alınmış ve bu hücrelerde CSFE ölçümü yapılarak hücrelerin bölünmeleri kontrol edilmiş, hücre yüzeyinde ifade edilen, uyarılmanın bir işareti olarak kabul edilen CD69 düzeyleri akan hücre ölçerde değerlendirilmiştir.
Kök hücre nakli uygulanmış olan 6 hastada cilt testleri tekrarlanmış ve kontrol örnekleri toplanabilmiştir. Diğer hastaların ise kontrollere davet edilerek verilerinin toplanması süreci devam etmektedir.
IV. Analiz ve Bulgular
Çalışmaya dahil edilebilen 17 hastanın dördü nakil sonrası 3.-7. aylarda nakile bağlı sebepler ile kaybedilmiştir, 13 hasta halen hayattadır .
Çalışmaya alınması planlanan 20 hasta ve vericisine ait cilt testlerinin sonucuna göre sadece 4 hastada , herbirinde farklı alerjenlere karşı olmak üzere pozitif reaksiyon gözlenmiştir. Hiçbir vericide cilt reaksiyonu gözlenmemiştir (Ek-c , Tablo 1) .
Nakil öncesinde 3 farklı antijene pozitif reaksiyon gösteren bir hastanın(1.BB) nakil sonrası kontrolünde hiçbir allerjene reaksiyon göstermediği gözlenmiştir. Reaktif olan diğer hastaların takip süreci devam etmektedir.
SIAF ile yapılan görüşmelerde dört hastanın da farklı allerjenlere yanıt oluşturmaları nedeniyle reaksiyon gösteren hasta sayısının en az 6 oluncaya kadar olgu toplamaya devem edilmesi ve verilerin kumulatif değerlendirmesini takiben mevcut hücrelerin seçilecek antijenlerle yapılacak titrasyon çalışmalarından sonra kültüre alınması, belirli sayıda dondurulabilen hücrenin ziyan edilmeden korunmaya devam edilmesi planlanmıştır. Spesifik IgE ölçümleri de örneklerin tek defada ve sağlıklı koşullarda transfer edilebilmesi ve aynı çalışmada değerlendirilebilmeleri için 6-10 adet atopik bireyin verisinin toplanmasını takiben toplu olarak yapılabilecektir.
Yeterli sayıda hücre ayrılabilen 3 bireyde yapılan deneme çalışmalarında hücreler 5 gün boyunca canlılıklarını sürdürmüş ancak denemede kullanılan HyA, PLA allerjenleri ile herhangi bir aktivasyon ya da proliferasyon bulgusu tespit edilmemiştir. Proliferasyonun değerlendirilmesi için CSFE ile işaretlenen hücreler alerjenler ile kültüre alınmış ve 5. Günde akan hücre ölçer kullanarak hücrede tutulan CSFE miktarının bölünmeye bağlı olarak azalıp azalmadığı kontrol edilmiş, bir azalma olmadığı görülmüştür (EK c, Şekil1 , Şekil 2).
Aktivasyonun değerlendirilmesi için ise kültüre alınan hücrelerde antiCD69 antikoru kullanılarak hücrenin CD69 ifadesi akan hücre ölçerde değerlendirilmiş ve beklendiği şekilde aktivasyon olmadığı, CD69 ifadesinin artmadığı görülmüştür.
V. Sonuç ve Öneriler
Adı geçen projede i) Laboratuvarda EFI akreditasyonunun bir gereği olarak uygulanan tadilat çalışmaları, ii) KİT ünitesinin komşu alanında başlayan inşaat çalışması nedeniyle belirli bir süre nakillere ara verilmesi iii) multidisipliner organizasyon gerekliliği nedenleri ile belirlenen zaman aralığı içinde hedeflenen hasta sayısına ulaşılması mümkün olmamıştır.
Ancak tüm olumsuz koşullara karşın nakil öncesinde atopik olan 4 hastanın tespit edilmesi ve bunlardan kontrole gelen birinde nakil sonrası dönemde atopik reaksiyonların ortadan kalkması çalışmaya devam etmemiz ve olgu sayısını arttırarak sayıları istatistiksel bir değerlendirmeye fırsat verecek düzeye çıkarmamız gerektiğini kuvvetle destekler niteliktedir.
Bu süreç içerisinde yöntem ile ilgili optimizasyon çalışmaları yapılarak hücrelerin kontamine olmadan yaşamlarının sürdürülebildiği kanıtlanmıştır.
Allerjenlerin belirlenip titrasyon çalışmaları yapılır yapılmaz elimizde bulunan hücreler ile spesifik allerjenlere karşı gelişen T hücre yanıtları da ölçülerek değerlendirilecektir.
VI. Kaynaklar
Saarinen UM. Transfer of latent atopy by bone marrow transplanttion? A case report. J allergy Clin Immunol. 1984 74(2):196-200
Tucker J, Barnetson RS, eden OB. Atopy after bone marrow transplantation BMJ 1985;
290:116-117
Agosti JM, Sprenger JD, Lum LG, et al. Transfer of allrgen specific IgE mediated hypersensitivity with allogeneic bone marrow transplantation NEJM 1988; 319:1623-1628 Gottesdiener KM . Transplanted infections: donor to host transmission with allograft Ann Intern Med 1989 15; 110: 101-1016
Denburg JA, Inman MD, Leber B, Sehmi R, O’Bryne PM. The role of thebone marrow in allergy and asthma Allergy.1996 mar,51(3):141-8
Penn I. Transmission of cancer from organ donors. Ann Transplant 1997; 2:7-12
Rietz H, Plummer AL, Gal AA. Asthma as a consquence of bone marrow transplantation Chest 2002; 122: 369-370
Gürman G: Hematolojik malinitelerde nonmyeloablatif transplantasyon. T Klin Hematol 1:69, 2003
Kreul DG, Devereux S, Pagliuca A, maher J, Ibrahim MAA. Increase in allergy following donor lymphpcyte infusion. BMT 2006; 37,983-984
VII. Ekler
EK a : Mali Bilanço ve Açıklamaları
1. yılda alımı planlanan cihazlardan biri (CO2 enkübatörü ) planlanan zamanda alınmış, diğerinin alımı ise teslimattaki gecikme nedeni ile bir sonraki mali yılın ilk aylarında gerçekleştirilebilmiştir.
1. yılda alımı planlanan sarf malzemelerinin tümü temin edilmiştir.
2. yıl içinde olgu toplamadaki sıkıntılar, ve beklenen düzeyde reaktif hastanın belirlenememesi nedenleri ile hücre kültür çalışmalarının allerjenler belirleninceye kadar ötelenmesi nedeniyle hücre kültürü için gereken ek malzemeler; T hücre alt tiplerinin belirlenmesinde kullanılacak olan antikorların miyadlarının kısa olması ve hedeflenen zamanda kullanılmamaları halinde ziyan olmaları riski nedeniyle alımları talep edilmemiştir.
EK-b: Makine ve Teçhizatın Konumu ve İlerideki Kullanımına Dair Açıklamalar (BAP Demirbaş numaraları dahil )
Proje kapsamında temin edilen Laminar air flow cihazı ve Karbondiosit enkübatörü AÜTF Hematoloji Bilim Dalı Laboratuvarında bulunan hücre kültürü odasında çalışır durumda bulunmaktadır.
Laminar air flow cihazı kan örneklerinden steril koşullarda hücrelerin ayrılarak saklanması aşamalarında aktif olarak kulanılmaktadır. (Demirbaş no: 255080215033710000001)
CO2 enkübatörü, yapılan deneme ve optimizasyon çalışmalarında kullanılmış ve T hücre yanıtlarının değerlendirilebilmesi için yapılan kültür çalışmalarında kullanılacaktır (Demirbaş no:
25303060301090409000002)
İlk yıl alımı planlanan reaktif ve sarf malzemeler alınmış ve ozel koşullarda saklanması gerekenler porsiyonlaranarak uygun ısılarda muhaza edilmiş, hücre ayırımı ve dondurulması aşamalarında kullanılmıştır
Plastik sarf malzemelerin önemli bir kısmı kültür sürecinde kullanılması planlandığından ancak allerjenlerin belirlenerek titrasyon çalışmalarının tamamlanmasını takiben kullanımları artacaktır.
Kültür çalışmalarının planlandığı şekilde başlatılamaması nedeniyle ikinci yılda hücresel sitokinlerin belirlenmesi için alımı planlanan, miyadı kısa olan hücre tipini ve sitokinleri belirlemeyi hedefleyen antikorlar için talepte bulunulmamış ve satın alma işlemi gerçekleştirilmemiştir.
EK- c : Teknik ve Bilimsel Ayrıntılar
EK- c : Teknik ve Bilimsel Ayrıntılar
Tablo 1: AlloHKHN uygulanan hastaların demografik özellikleri
Cinsiyet (K/E) 8/9
Ortanca Yaş (min-max) 41(18-61)
Tanı AML ALL MDS AAA PNH
8 3 4 1 1 Hazırlama rejimi
(Ablatif/nonmiyeloablatif)
5/12
Tablo 2 : Allo HKHN yapılması planlanan hastalara uygulanan cilt testi sonuçları (A: Alıcı, V: Verici, K: Kontrol)
Tx tarihi
(Ex tarih)
Allerjen
Der f Der
p
Polens4 (avena, hordeum, triticum, secale)
Polens5 (dactylis, festuca, lolium, phleum, poa)
Treesmix (alnus, betula, corylus)
Artemisi a
Secale Mold mix 1(alternaria, chaetomium, cladosporium , fusairum)
Aspergillus mix
Cat Latex Cockroac h
1A. BB
16/2/10 ‐ ‐+
+
+
‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐1V. SB
‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐BB ‐
‐ (‐) (‐) ‐ (‐)
‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐2A. RET
1/3/10 ‐+
‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐2V. OET
‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐3A. AB
19/3/10 ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐3V. BB
‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐4A. ZNS
24/3/10 ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐4V. ZFB
‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐4K.
ZNS ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐5A. EK (ex)
29/3/10(19/05/10) ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐
5V. HÇ
‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐6A. İY
28/4/10+
‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐+
6V. AG
‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐7A. ŞT
30/4/10 ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐7V. ST
‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐8A. EÇ
27/9/10 ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐8V. ŞÇ
‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐8K.
EÇ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐9A. RM (ex)
28/2/11(23/7/11) ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐
9V. MM
‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐10A. ZG
11/10/10 ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐10V. PB
‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐11A. ME
25/10/10 ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐11B. AE
‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐12A. İH
22/2/10 ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐12V. CB
‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐12K
İH ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐13A. FZ
3/11/10 ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐13V. SA
‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐13K.
F Z ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐14A. BA(Ex)
21/3/11(19/10/11) ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐
14V. YG
‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐15A. TA (ex)
18/3/11(18/7/11) ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐
15V. SK
‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐16A. KG
12/5/11 ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐16V. CG
‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐16K.
KG ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐17 A. ZZ
15/3/12+ + ‐ + ‐ +
‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐17V. NG
‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐18A. ŞK
Kendi isteğiile nakilden vazgeçti
‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐
18V. MK
‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐19A. FB
Nakillistesinden çıktı
‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐
19V. ŞN
* ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐20A. SY
Nakilolamadan ex oldu
‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐
20V. YY
‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐
EK- c : Teknik ve Bilimsel Ayrıntılar
Şekil 1: Aseptik koşullarda çevre kanından ayrılan mononuklear hücre sayısı yeterli düzeyde olan 3 bireyin hücrelerinden ayrılan bir porsiyon kullanılarak HyA, PLA allerjenleri ile yapılan kültür çalışmasının 5. gününde CSFE kullanarak akan hücre ölçer de ile proliferasyon, Acridin
Orange/Ethidium Bromide ile floresan mikroskopta canlılık kontrol edilmiştir. Hücrelerin 5 gün boyunca canlılıklarını sürdürdükleri görülmüş FCM ölçümlerinde hücre proliferasyonunu (bölünmeyi) destekleyen bir veri elde edilmemiştir (Not: Herbir bölünme siklusunda CSFE den kaynaklanan floresan ölçümlerinin azalarak tespit edilmesi beklenmektedir.)
Şekil 2: Aseptik koşullarda çevre kanından ayrılan mononuklear hücre sayısı yeterli düzeyde olan 3 bireyin hücrelerinden ayrılan bir porsiyon kullanılarak HyA, PLA allerjenleri ile yapılan kültür çalışmasının 5. gününde hücrelerin anti Cd69 antikorları ile işaretlenmesini takiben yapılan akan hücre ölçer (FCM) ölçümlerinde hücrelerin antijenle uyarıldıklarını destekleyecek ölçüde bir sinyal (CD69 pozitifliği) gözlenmemiştir
%2,3 %4.2 %2.6
