ANKARA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ
DOKTORA TEZİ
YOĞURT ÜRETİMİ VE DEPOLAMASI SIRASINDA SALMONELLA ENTERiTiDiS’İN CANLI KALMA DURUMUNUN
MODELLENMESİ
Derya SAVRAN
GIDA MÜHENDİSLİĞİ ANABİLİM DALI
ANKARA 2017
Her hakkı saklıdır
ii ÖZET
Doktora Tezi
YOĞURT ÜRETİMİ VE DEPOLAMASI SIRASINDA SALMONELLA ENTERİTİDİS’İN CANLI KALMA DURUMUNUN
MODELLENMESİ
Derya SAVRAN Ankara Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Gıda Mühendisliği Anabilim Dalı Danışman: Prof. Dr. A. Kadir HALKMAN
Yoğurt genellikle mikrobiyolojik olarak güvenilir gıda olarak düşünülse de patojen bakteriler gelişip canlılıklarını sürdürebilirler. Bu çalışmada Atatürk Orman Çiftliği (AOÇ) Çiftlik Köy Yoğurdu üretiminde kullanılan geleneksel starter kültüre karşı, patojen bir mikroorganizma olan Salmonella Enteritidis’in fermantasyon ve farklı sıcaklıklarda depolama işlemi süresince canlı kalma durumunun araştırılması ve elde edilen bulguların matematiksel modeller ile ifade edilmesi amaçlanmıştır.
Fermantasyon aşamasında Salmonella Enteritidis süte farklı inokülasyon düzeylerinde (3, 5 ve 7 log KOB/mL) ilave edilmiş, fermantasyon süresince belli aralıkla sayım sonuçları alınmıştır. Sayım sonuçları DMFit yazılımı (versiyon 3.5) kullanılarak Baranyi modeline başarılı bir şekilde fit edilmiştir. Sonuçlar, başlangıç inokülasyon düzeylerinin Salmonella Enteritidis’in maksimum gelişme hızı (µmax) üzerine etki etmediğini göstermiş, µmax değerleri (0.26–0.38) log KOB/g/sa olarak elde edilmiştir (P>0.05). Başlangıç inokülasyon düzeyleri ve lag fazı (λ) arasında belirgin bir ilişki gözlenmemiştir.
Depolama aşamasında süte fermantasyon öncesi 5 log KOB/mL Salmonella Enteritidis inoküle edilmiş, fermantasyon sonrası farklı sıcaklıklarda (4, 12, 20 ve 25 oC) depolama süresince belli aralıklarla sayım sonuçları alınmıştır. Sayım sonuçları R programı (versiyon 3.2.2) kullanılarak farklı modellere fit edilmiştir. En uygun model olarak;
omuz, lineer ve kuyruk kısımlarını birlikte içeren Geeraerd modeli belirlenmiştir.
Depolama sıcaklığı arttıkça ölüm hızı (kmax) artmış, 25 oC’ta kmax maksimum (0.32 sa-1), 4 oC’ta kmax (0.05 sa-1) minimum olarak bulunmuştur. Depolama sıcaklığı arttıkça omuz uzunluğu (Sı) azalmıştır. 4 oC’ta Sı maksimum (55.93 sa), 25 oC’ta Sı minimum (4.28 sa) olarak bulunmuştur. Depolama sıcaklığının kinetik parametreler (kmax ve Sı) üzerine etkisi TableCurve 2D yazılımı (versiyon 5.01) kullanılarak iki eşitlikle belirlenmiştir.
Ocak 2017, 124 sayfa
Anahtar Kelimeler: Salmonella, yoğurt, fermantasyon, depolama, prediktif mikrobiyoloji, canlı kalma
iii ABSTRACT
Ph. D. Thesis
MODELLING SURVIVAL OF SALMONELLA ENTERITIDIS DURING PRODUCTION AND STORAGE OF YOGHURT
Derya SAVRAN Ankara University
Graduate School of Natural and Applied Sciences Department of Food Engineering
Supervisor: Prof. Dr. A. Kadir HALKMAN
Although yoghurt is usually considered microbiologically safe, pathogens may grow and survive. The aim of this study was to evaluate the behaviour of Salmonella Enteritidis during the fermentation and the storage of the yoghurt (utilizing the starter cultures used by AOÇ) at different temperatures, and to develop mathematical models able to predict the behaviour of this microorganism.
In the fermentation step, Salmonella Enteritidis was inoculated into milk at different inoculation levels (3, 5 and 7 log CFU/mL) prior to fermentation, and viable cells were enumerated at certain times. The data were successfully fitted to Baranyi model using DMFit software (version 3.5). The results showed that the initial inoculum level did not affect the maximum growth rate (µmax), thus, µmax values were similar for each contamination level, ranging from (0.26–0.38) log CFU/g/h (P>0.05). There was no clear trend between inoculation levels and λ values (lag time).
In the storage step, Salmonella Enteritidis was inoculated into milk at the level of 5 log CFU/mL) prior to fermentation, viable cells were enumerated at certain times during fermentation at different temperatures (4, 12, 20, and 25 ºC). The data were fitted to different survival models using R software (version 3.2.2). The Geeraerd model with shoulder and tailing was selected as the most suitable model. As temperature increased, the kmax value increased. Thus, at 4 oC, Salmonella Enteritidis displayed the lowest death rate (0.05 h-1), whereas at 25 oC, the maximum temperature assayed, it showed the highest death rate (0.32 h-1). As temperature increased, the Sl value decreased. Sl was longest in samples stored at 4oC (55.93 h), whereas in samples stored at 25oC it was shortest (4.28 h). The influence of temperature on the parameters was determined using TableCurve 2D software (version 5.01) with two empirical models.
January 2017, 124 pages
Key Words: Salmonella, yoghurt, fermentation, storage, predictive microbiology, survival
iv TEŞEKKÜR
Bu doktora çalışmasının bir bölümü ICFMH (International Committee on Food Microbiology and Hygiene of the IUMS) Mobility Grant programı, bir bölümü Türkiye Bilimsel ve Teknolojik Araştırma Kurumu (TÜBİTAK) 2214-A Yurt Dışı Doktora Sırası Araştırma Burs (1059B141500410) programı ile desteklenmiştir.
Doktora dönemim boyunca gerek bilgi birikimi ve deneyimlerini benimle paylaşan gerek her konuda arkamda olduğunu hissettiren, hem iyi bir akademisyen hem iyi bir insan olan, birlikte çalışmaktan mutluluk ve onur duyduğum değerli danışman hocam Sn. Prof. Dr. A. Kadir HALKMAN’a (Ankara Üniversitesi, Gıda Mühendisliği Anabilim Dalı) en kalbi duygularımla teşekkür ediyorum.
Ayrıca çalışmalarım süresince değerli görüş ve düşünceleri ile çalışmama yön veren, değerli tez izleme komitesi üyeleri Sn. Prof. Dr. Ferruh ERDOĞDU (Ankara Üniversitesi, Gıda Mühendisliği Anabilim Dalı) ve Sn. Prof. Dr. S. Aykut AYTAÇ’a (Hacettepe Üniversitesi, Gıda Mühendisliği Anabilim Dalı), çalışmanın özellikle matematiksel modelleme aşamasındaki değerli katkıları dolayısıyla Sn. Prof. Dr.
Fernando PÉREZ-RODRÍGUEZ’e (Cordoba Üniversitesi, İspanya), yine değerli katkıları dolayısıyla ICFMH yönetim kurulu üyelerine içten teşekkürlerimi sunuyorum.
Ve sonsuz güven, sabır ve destekle; her kararımın arkasında olan değerli aileme sonsuz teşekkür ediyor, sevgi ve saygılarımı sunuyorum.
Derya SAVRAN Ankara, Ocak 2017
v
İÇİNDEKİLER
TEZ ONAY SAYFASI
ETİK SAYFASI ... i
ÖZET... ii
ABSTRACT ... iii
TEŞEKKÜR ... iv
SİMGELER ve KISALTMALAR DİZİNİ ... vii
ŞEKİLLLER DİZİNİ ... viii
ÇİZELGELER DİZİNİ ... x
1. GİRİŞ ... 1
2. KAYNAK ÖZETLERİ... 5
2.1 Fermantasyon Teknolojisi ... 5
2.2 Laktik Asit Bakterileri (LAB) ... 6
2.3 Fermente Süt Ürünleri ... 9
2.3.1 Yoğurt ... 12
2.3.2 Yoğurt üretimi ... 13
2.3.3 Yoğurtta bulunan LAB ve aralarındaki simbiyotik ilişki ... 16
2.4 Gıda Kaynaklı Hastalıklar ... 17
2.5 Salmonella ... 20
2.6 Yoğurtta Patojen Davranışı Üzerine Yapılan Çalışmalar ... 23
2.7 Prediktif Mikrobiyoloji ... 28
2.7.1 Prediktif mikrobiyolojinin tarihi... 28
2.7.2 Prediktif mikrobiyolojinin gıda endüstrisindeki kullanım alanları ... 30
2.7.3 Modellemeye giriş ... 33
2.7.4 Prediktif modellemenin temel aşamaları ... 34
2.7.5 Modellerin sınıflandırılması ... 37
2.7.5.1 Birincil modeller ... 40
2.7.5.2 İkincil modeller... 48
2.7.5.3 Üçüncül modeller ve veri tabanları ... 50
3. MATERYAL ve YÖNTEM ... 59
3.1 Materyal ... 59
3.2 Yöntem ... 59
3.2.1 Fermantasyon aşaması ... 59
3.2.1.1 Yoğurt yapımı ve Salmonella inokülasyonu ... 59
3.2.1.2 Mikrobiyolojik analizler ... 60
3.2.1.3 pH ölçümü ... 62
3.2.1.4 İstatistiksel analiz ... 63
3.2.1.5 Matematiksel modelleme ... 63
3.2.2 Depolama aşaması ... 65
3.2.2.1 Depolama aşaması yoğurt yapımı ve Salmonella inokülasyonu ... 65
vi
3.2.2.2 Depolama aşaması mikrobiyolojik analizleri ... 66
3.2.2.3 Depolama aşaması pH ölçümü ... 66
3.2.2.4 Depolama aşaması matematiksel modelleme ... 66
3.2.2.4.1 S. Enteritidis’in yoğurdun farklı sıcaklıklarda depolanması sırasındaki davranışının modellenmesi (Birincil model) ... 66
3.2.2.4.2 Depolama sıcaklığının Salmonella’nın kinetik parametreleri üzerine etkisinin incelenmesi (İkincil model) ... 71
3.2.2.5 Validasyon çalışması ... 72
3.2.2.5.1 Validasyon aşaması yoğurt yapımı ve Salmonella inokülasyonu ... 73
3.2.2.5.2 Validasyon aşaması mikrobiyolojik analizleri... 73
3.2.2.5.3 Validasyon aşaması pH ölçümü ... 73
3.2.2.5.4 Validasyon aşaması matematiksel modelleme ... 74
4. BULGULAR ve TARTIŞMA ... 75
4.1 Fermantasyon Aşaması ... 75
4.1.1 Fermantasyon aşaması mikrobiyolojik analiz sonuçları ... 75
4.1.2 Fermantasyon aşaması pH sonuçları ... 79
4.1.3 Fermantasyon aşaması matematiksel modelleme ... 82
4.2 Depolama Aşaması ... 85
4.2.1 Depolama aşaması mikrobiyolojik analiz sonuçları ... 86
4.2.2 Depolama aşaması pH sonuçları ... 87
4.2.3 Depolama aşaması matematiksel modelleme ... 89
4.2.3.1 S. Enteritidis’in yoğurdun farklı sıcaklıklarda depolanması sırasındaki davranışının modellenmesi (Birincil model) ... 89
4.2.3.2 Sıcaklığın S. Enteritidis’in kinetik parametreleri üzerine etkisinin incelenmesi (İkincil model)... 97
4.2.3.3 Validasyon sonuçları ... 100
5. SONUÇ ... 104
KAYNAKLAR ... 106
EKLER ... 118
EK 1 Gompertz Modeli ve Çıkarımı ... 119
EK 2 Denenen Birincil Modellere Ait İstatistiksel Ölçüt Değerleri ... 122
ÖZGEÇMİŞ ... 123
vii
SİMGELER DİZİNİ
A : Çarpışma (frekans) faktörü
Af : Kesinlik faktörü, accuracy
Bf : Yanlılık faktörü, bias
Cc : Hücrelerin fizyolojik durumu
D : Desimal azalma süresi, D değeri (zaman)
dk : Dakika
Ea : Aktivasyon enerjisi (J/mol)
g : Gram
kmax : Spesifik inaktivasyon hızı (sa-1)
L : Litre
mL : Mililitre
Nmax : Maksimum hücre konsantrasyonu (log KOB/g) No : Başlangıç hücre konsantrasyonu (log KOB/g) Nres : Dirençli hücre konsantrasyonu (log KOB/g) Nt : t (sa) anındaki hücre konsantrasyonu (log KOB/g)
oC : Santigrat
R : Gaz sabiti (8.314 J/(Kmol))
sa : Saat
Sl : Omuz uzunluğu (sa)
T : Sıcaklık (oC)
t : zaman (sa)
α : Skala parametresi
β : Şekil parametresi
λ : lag fazı (sa)
μ : Gelişme hızı (log KOB/g/sa)
μmax : Maksimum gelişme hızı (log KOB/g/sa)
Kısaltmalar
AICC : Düzeltilmiş Akaike bilgi ölçütü
AOÇ : Atatürk Orman Çiftliği
EMS : En muhtemel sayı
KOB : Koloni oluşturan birim
L. bulgaricus : Lactobacillus bulgaricus
LAB : Laktik asit bakterisi
MPY : Maksimum popülasyon yoğunluğu
MRD : Maximum recovery diluent
MRS : de Man, Rogosa ve Sharpe
RMSE : Ortalama hata kareleri toplamı kökü S. Enteritidis : Salmonella Enteritidis
S. thermophilus : Streptococcus thermophilus
TSB : Tryptic soy broth
XLD : Xylose lysine deoxycholate
viii
ŞEKİLLER DİZİNİ
Şekil 2.1 Geleneksel yoğurt üretimi şeması ... 14
Şekil 2.2 Prediktif modellerin geliştirilmesi ve uygulanmasındaki temel aşamalar ... 35
Şekil 2.3 Mikrobiyel gelişme eğrisi ... 38
Şekil 2.4 Tipik bir gelişme eğrisinde maksimum gelişme hızı, lag fazı, MPY kinetik parametrelerinin grafiksel anlamı………... 39
Şekil 2.5 Termal veya termal olmayan proseslerde vejetatif bakteri hücrelerinin farklı inaktivasyon davranışları ... 43
Şekil 2.6 GInaFiT analiz çıktısı örneği. Seçilen model “Geeraerd vd. 2000 Log-Linear+Shoulder” ... 51
Şekil 2.7 GInaFiT’te veriye uygun olmayan model seçilmesi durumunda alınan hata çıktısı örneği ... 52
Şekil 2.8 DMFit ekranı ve analiz çıktısı örneği ... 53
Şekil 2.9 R Project komut ekranı... 55
Şekil 2.10 R Project analiz çıktı ekranı ... 56
Şekil 2.11 PMP ekranı ve analiz çıktısı ... 58
Şekil 3.1. a. Salmonella. Enteritidis (XLD Agar), b. Streptococcus thermophilus (M17 Agar), c. Lactobacillus bulgaricus (MRS Agar) ... 62
Şekil 3.2 DMFit programı uygulama örneği ... 64
Şekil 3.3 R programı uygulama örneği ... 70
Şekil 3.4 TableCurve 2D yazılımı ile elde edilen grafik, başlangıç parametre değerleri ve modelin uygunluğu ile ilgili istatistiksel ölçütleri içeren çıktı örneği ... 72
Şekil 4.1 S. Enteritidis’in süte farklı inokülasyon düzeylerinde (a. 3, b. 5, c. 7 log KOB/mL) ilave edilmesi durumlarında yoğurt bakterileri davranışı (S. therm: S. thermophilus, L. bulg: L. bulgaricus) ... 77
Şekil 4.2 S. Enteritidis’in yoğurdun fermantasyonu sırasında farklı inokülasyon düzeylerindeki (a. 3, b. 5, c. 7 log KOB/mL) davranışı ve örneklerin ortalama pH değerleri değişimi ... 80
ix
Şekil 4.3 S. Enteritidis’in yoğurdun fermantasyonu sırasında farklı
inokülasyon düzeylerindeki (a. 3, b. 5, c. 7 log KOB/mL) davranışını
tahmin eden Baranyi modeli ... 82 Şekil 4.4 Farklı sıcaklıklarda depolama işlemi süresince yoğurt örneklerinin
ortalama pH değerleri değişimi ... 88 Şekil 4.5 S. Enteritidis’in 4 oC’ta depolama işlemi sırasında gözlenen ve tahmin
edilen canlı kalma eğrisi ... 90 Şekil 4.6 S. Enteritidis’in 12 oC’ta depolama işlemi sırasında gözlenen ve tahmin
edilen canlı kalma eğrisi ... 91 Şekil 4.7 S. Enteritidis’in 20 oC’ta depolama işlemi sırasında gözlenen ve tahmin
edilen canlı kalma eğrisi ... 92 Şekil 4.8 S. Enteritidis’in 25 oC’ta depolama işlemi sırasında gözlenen ve tahmin
edilen canlı kalma eğrisi ... 93 Şekil 4.9 Depolama sıcaklığı ve kmax arasındaki ilişki ... 99 Şekil 4.10 Depolama sıcaklığı ve SI arasındaki ilişki ... 99 Şekil 4.11 S. Enteritidis’in 16 oC’ta depolama işlemi sırasında gözlenen ve
tahmin edilen canlı kalma eğrisi (Geeraerd modeli omuz, linner kısım
ve kuyruk) ... 101 Şekil 4.14 Yoğurt örneklerinin 16 oC’ta depolama işlemi süresince elde edilen
pH değerleri ... 103
x
ÇİZELGELER DİZİNİ
Çizelge 2.1 Bazı fermente süt ürünleri ve içerdikleri LAB türleri ... 11 Çizelge 2.2 Salmonella’ya ait biyokimyasal özellikler... 21 Çizelge 2.3 Salmonella’nın gelişim gösterdiği çevresel koşulların limit değerleri ... 22 Çizelge 2.4 Bazı birincil modellere ait eşitlikler ve eşitliklerin yeniden
düzenlenmiş halleri; e=exp(1) ... 41 Çizelge 3.1 Yoğurdun farklı sıcaklıklarda depolanması sırasında
S. Enteritidis’in davranışının modellenmesi için denenen modeller, modellere ait matematiksel denklikler ve modellerin kinetik
parametreleri ... 68 Çizelge 4.1 Fermantasyon başlangıcı ve sonunda elde edilen yoğurt bakterileri
sayım sonuçları ... 78 Çizelge 4.2 Yoğurdun fermantasyonu sırasında S. Enteritidis’in farklı
inokülasyon düzeylerinde elde edilen sayım sonuçlarının Baranyi modeline fit edilmesi ile elde edilen kinetik parametre sonuçları
ve istatistiksel ölçütler ... 83 Çizelge 4.3 S. Enteritidis’in yoğurdun farklı sıcaklıklarda depolama işlemi
süresince fit edilen modellerden (Geeraerd vd. 2000) elde edilen parametre sonuçları ve fit işleminin uygunluğunu gösteren
istatistiksel ölçütler (RMSE, AICc) ... 94 Çizelge 4.4 16 oC’ta yapılan deney sonrası birincil modelden elde edilen
parametre değerleri ... 101
1 1. GİRİŞ
Fermantasyon teknolojisi gıdaların muhafazasında kullanılan en eski teknolojilerden biridir. Fermente ürünler, laktik asit, asetik asit ve etanol gibi çeşitli fermantasyon uygulamaları ile elde edilmekte ve insanlar tarafından uzun yıllardır güvenli ve besleyici değeri yüksek gıdalar olarak tüketilmektedir (Marshall ve Mejia 2012).
Fermantasyon sırasında oluşan bazı bileşikler fermente ürünlerin kendilerine özgü lezzetini ve besleyici değerini kazandırmakta, bazı bileşikler de pH’yı düşürerek ürünlerin mikroorganizma gelişimine karşı güvenilir hale gelmelerini sağlamaktadır (Kalui vd. 2010).
Fermente bir ürün olan yoğurt, Streptococcus salivarius subsp. thermophilus ve Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus‘tan oluşan starter kültür ile laktik asit fermantasyonu sonucu elde edilen bir süt ürünüdür. Sahip olduğu besin değeri ve sağlık üzerine önemli etkileri nedeni ile diyette önemli bir yere sahiptir (Madhu vd. 2013, Hrnjez vd. 2014, Sfakianakis ve Tzia 2014). Kullanılan starter kültürün orijininden bağımsız olarak yoğurt üretimi sırasında düşen pH, aside duyarlı bakterilerin gelişimini önlemekte ve yoğurda antimikobiyel özellik kazandırmaktadır (Bachrouri vd. 2006). Bu bakımdan yoğurt, mikrobiyolojik açıdan genellikle güvenilir gıda olarak düşünülmektedir (Canganella vd. 1999).
Yoğurt üretiminde, gelişmiş sanayi tesislerinin yanı sıra kaliteye gereğince dikkat etmeyen mandıra üretimleri olduğu bilinmektedir. Bu üretimler sırasında gerekli hijyen ve sanitasyon koşulları sağlanmazsa gıda kaynaklı patojenlerin bir şekilde üretime bulaşmaları (Kumbhar vd. 2009) ve yoğurt kültürü tarafından geliştirilen asitlik ve oluşan pH düşüşüne rağmen yoğurt oluşum aşamasında gelişmeleri ve canlılıklarını sürdürmeleri mümkündür (Massa vd. 1997, Pazakova vd. 1997).
1993 yılında, ticari yoğurt tüketimi sonrası hemolitik üremik sendrom (HUS) gelişimi gözlenmiş, nedeni ise E. coli O157:H7 olarak belirlenmiştir (Morgan vd. 1993).
2
Gıda kaynaklı hastalıklar, bütün dünyada en önemli halk sağlığı sorunları arasında gösterilmektedir. ABD dünyanın en güvenli gıda tedarikçilerinden birisi olmasına rağmen, ABD Hastalık Kontrol ve Önleme Merkezleri (CDC), gıda kaynaklı olarak; her yıl 48 milyon insanın hastalandığını, 128 bin insanın hastaneye yatırıldığını ve 3 bin insanın yaşamını yitirdiğini açıklamıştır (http://www.cdc.gov 2011). Gıda kaynaklı hastalıkların 9.4 milyonunun, hastaneye yatırılmaların 55961’inin, ölümlerin 1351’inin gıda kaynaklı patojenler (virüs, bakteri, parazit vb.) nedeniyle olduğu belirtilmiştir (Scallan vd. 2011).
Gıda kaynaklı hastalıklara en çok neden patojenlerin nörovirüs ve Salmonella spp.
olduğu bildirilmiştir (http://www.cdc.gov 2014a). Enfeksiyonlara neden olan Salmonella izolatları serotiplendirildiğinde ilk üç sırayı Enteritidis, Typhimurium ve Newport’un oluşturduğu yine raporlarda belirtilenler arasındadır (Crim vd. 2014).
Enteritidis ve Typhimurium’un birlikte, her yıl oluşan salmonellosis vakalarının dörtte üçünü oluşturdukları bildirilmiştir (McClelland ve Pinder 1994).
Salmonella aynı zamanda süt ürünleri tüketimi ile ilişkili hastalıkların en sık nedeni olarak gösterilmektedir. Bununla birlikte, süt ürünleri kaynaklı oluşan vakaların ne kadarının yoğurt ve diğer fermente süt ürünleri ile ilgili olduğuna yönelik ulaşılabilir bir veri yoktur (Szczawińska ve Szczawiński 2011).
Çiğ sütün mikrobiyel yükünün fazla olması, yetersiz ısıl işlem, hijyen eksikliği nedeniyle paketleme sırasındaki ikincil bulaşma vb. nedenler, yoğurdun Salmonella içermesini mümkün kılmaktadır. Literatür bilgileri, yoğurdun Salmonella gelişimi için uygun ortam olmadığını belirtse de mikroorganizma; ürün türü, pH değeri, depolama sıcaklığı ve çevresel koşullara bağlı olarak son üründe canlılığını sürdürebilmektedir (Szczawińska ve Szczawiński 2011). Aynı zamanda yoğurt, FDA tarafından hazırlanan listede gıda savunması açısından zaaf değerlendirmesi yapılması gereken, yani tedarik sürecinde güvenlik açığı bulunan ürünler arasında gösterilmektedir (http://www.fda.gov 2012).
3
Bu nedenle gıda güvenliği ve halk sağlığı ile ilgili olarak; önemli gıda patojenlerinin neden olduğu hastalıkların önlenebilmesi için, bu patojenlerin gıda ürünleri içerisindeki çoğalma hızlarının, işleme koşullarındaki ölüm hızlarının ve depolama ile dağıtım sırasındaki potansiyel gelişme durumlarının araştırılması gereklidir.
Prediktif mikrobiyoloji (betimleyici mikrobiyoloji) uygulamalarıyla, gıdalarda üretim, muhafaza ve dağıtım aşamalarında, çevresel faktörlerin etkisi ile oluşan mikroorganizma davranışlarıyla ilgili bilgi elde edilebilmektedir (Roupas 2008).
Prediktif mikrobiyoloji, gıda mikrobiyolojisinin bir alanı olup, gıda ortamında mikroorganizma davranışlarının matematiksel modellerle tahmin edilmesini sağlar (Pérez-Rodríguez ve Valero 2013).
Modeller, mikroorganizmaların gıda içindeki davranışlarını belli tanımlar yaparak, belli başlangıç şartları tanımlayarak ve matematiksel fonksiyon ve eşitlikler kullanarak basitleştirir. Böylelikle değişimi anlama ve açıklama imkânı verir (Çoksöyler 2011).
Prediktif mikrobiyolojinin gıda endüstrisindeki kullanım alanlarından biri süt ve süt ürünleridir. Süt ürünleri tedarik zinciri boyunca birçok proseste uygulama alanı bulan prediktif modeller, proses etkinliği ve gıda kalite kontrolünü arttırma gibi önemli avantajlarıyla süt ürünleri üreticilerine ekonomik fayda sağlamaktadır (Roupas 2008).
Patojen bakterilerin yoğurdun fermantasyonu ve depolama sırasındaki davranışı birçok araştırmacı tarafından araştırılsa da (Massa vd. 1997, Pazakova vd. 1997, Canganella vd. 1998, Canganella vd. 1999, Bachrouri vd. 2002, Ogwaro vd. 2002, Al-Haddad 2003, Akkaya vd. 2009, Szczawińska ve Szczawiński 2011, Álvarez-Ordóñez vd. 2012, Ahmed vd. 2014, Szczawiński vd. 2016) konu ile ilgili modelleme çalışması oldukça sınırlıdır (Szczawiński vd. 2014, Bednarko-Młynarczyk vd. 2015, Szczawiński vd.
2016). Sınırlı düzeydeki bu çalışmalar da depolama aşaması üzerine yapılmış olup, fermantasyon aşaması ile ilgili olarak patojen davranışını modelleyen çalışma ile karşılaşılmamıştır.
4
Diğer taraftan prediktif modeller, gıda ortamına benzetilerek elde edilen yapay bir ortamdan veya gıda ortamının kendisinden elde edilen verilerden oluşturulabilmektedirler (Pérez-Rodríguez 2014). Bu çalışmada olduğu gibi, gıda ortamının kendisi kullanılarak oluşturulan modeller, o ortamdaki mikroorganizma kinetiğini daha gerçekçi yansıtması bakımından yapay ortamlardan elde edilen modellere oranla daha çok tercih edilmektedirler (Singh vd. 2011).
Bu çalışma kapsamında; Atatürk Orman Çiftliği (AOÇ) Çiftlik Köy Yoğurdu üretiminde kullanılan geleneksel starter kültüre karşı, patojen bir mikroorganizma olan Salmonella Enteritidis’in fermantasyon ve farklı sıcaklıklarda (4, 12, 20 ve 25 oC) depolama işlemi süresince canlı kalma durumunun araştırılması, elde edilen bulguların matematiksel modeller ile ifade edilmesi ve geliştirilen modellerin validasyonu amaçlanmıştır.
5 2. KAYNAK ARAŞTIRMASI
2.1 Fermantasyon Teknolojisi
Fermantasyon teknolojisi, kurutma ve tuzlama ile birlikte bilinen en eski gıda muhafaza yöntemlerindendir. Et, süt ve sebzelerin fermente edildiklerini gösteren, MÖ 6000 yılına dayanan kayıtlar olduğu bilinmektedir. Bu teknoloji, eski dönemlerin olumsuz koşullarında, gıda ve içeceklerin raf ömürlerinin ve güvenilirliklerinin arttırılmasını sağlamıştır (Marshall ve Mejia 2012).
Uzunca bir dönem fermente ürünlerin yapım teknikleri ile ilgili bilgiler kuşaktan kuşağa aktarılmış ve bu ürünlerin üretimi kırsal alanda, küçük ölçekte ve yerel düzeyde sınırlı kalmıştır. 19. yy’ın ortalarında gerçekleşen iki önemli olay fermente gıda teknolojisinin endüstriyel düzeyde öneminin anlaşılmasını sağlamıştır. Bunlardan birincisi, sanayi devrimi ile birlikte nüfus şehir ve kasabalarda toplanmaya başlamış, geleneksel yöntemlerle elde edilen küçük ölçekli üretimler bu koşullar için yetersiz kalmıştır.
Diğeri ise 1850’lerden sonra mikrobiyoloji alanındaki gelişmeler biyolojik temelde fermantasyonun anlaşılmasını sağlamış, böylelikle fermente gıdaların oluşturulmasında bakteri, maya ve küflerin önemi anlaşılarak daha kontrollü ve etkili fermantasyon yapılmaya başlanmıştır (Caplice ve Fitzgerald 1999).
Fermantasyonun modern hayattaki önemi hem gelişmiş hem de gelişmekte olan ülke pazarlarında, fermente gıdaların hem güvenilir gıdalar olmaları hem de yüksek talep gören duyusal özelliklere sahip olmalarıdır (Marshall ve Mejia 2012).
Campbell-Platt’e (1987) göre fermente gıdalar, mikroorganizmaların veya enzimlerin etkisine maruz kalan ve bunun sonucunda arzu edilir biyokimyasal değişiklerle modifiye olmuş gıdalar olarak tanımlanmaktadır.
6
Fermente gıdaların sınıflandırılmasında farklı araştırmacılar farklı sınıflandırma yöntemleri geliştirmişlerdir. Bazı araştırmacılar bu sınıflandırmayı fermente gıdanın ne tür mikroorganizma içerdiğini baz alarak yaparken, bazıları ürün bazlı sınıflandırmayı tercih etmişlerdir (Steinkraus 1997). Campbell-Platt’e (1987) göre fermente gıdalar; süt ürünleri, tahıl ürünleri, balık ürünleri, meyve ve sebze ürünleri, alkollü içecekler, baklagiller ve et ürünleri olarak yedi sınıfa ayrılmıştır.
Bu gıdalar kalitelerini uzun süre muhafaza edebilmeleri, arttırılmış besinsel değerleri, sindirilebilirlik özellikleri ve geleneksel olarak kabul edilir özellikleri ile gelişmekte olan birçok ülkenin beslenme kültürünün önemli bir parçasını oluşturmaktadır (Marshall ve Mejia 2012).
Fermente gıdalar genel olarak güvenilir olarak düşünülen gıdalardır. Fermantasyonun gıdalardaki koruyucu etkisi; karbohidrat ve türevlerinin oksidasyonu ve bunun sonucu olarak da asit, alkol ve karbondioksit gibi son ürünler oluşturması ile ilişkilidir. Bu son ürünler, bozulma yapan mikroorganizmaların gelişimini önlemektedir. Diğer taraftan oksidasyonun kısmi olması, gıdanın tüketiciler için halen yeterli enerji kaynağına sahip olması anlamına gelmektedir (Caplice ve Fitzgerald 1999). Bununla birlikte kendileri güvenilir olsa da kontaminasyonlu içme suları, atıklar, personel hijyeni, uygunsuz koşullarda üretilmeleri gibi etkenler güvenilirliğin sağlanmasında ve korunmasında dikkat edilmesi gereken hususlardır (Steinkraus 1997).
Fermente gıdalar, yapılarındaki floradan dolayı (bakteri, maya ve küf) doğal olarak oluşabildikleri gibi birçok fermente gıdanın oluşumundan laktik asit bakterileri sorumludur (Kalui vd. 2010, Widyastuti vd. 2014).
2.2 Laktik Asit Bakterileri (LAB)
Laktik asit bakterilerinin sınıflandırılmalarına yönelik çalışmalarda familyanın, morfolojik açıdan çok değişken özellik göstermekle birlikte, üyelerinin fizyolojik açıdan oldukça benzerlik gösterdikleri belirtilmiştir. Tanımlanmalarında kullanılan
7
taksonomik sınıflandırmanın temeli; morfolojik, fizyolojik, farklı sıcaklık, pH ve tuz konsantrasyonlarında gelişme durumları, arjininin parçalanması ve karbohidrat katabolizması gibi biyokimyasal özelliklerin incelendiği fenotipik özelliklere dayanmaktadır (Gobbetti vd. 2005, Botina vd. 2006).
Genel olarak LAB, Gram pozitif, katalaz, oksidaz, benzidin negatif, aerobik veya fakültatif anaerobik, spor oluşturmayan, çubuk veya kok şeklinde, sitokromdan yoksun, nitratı nitrite indirgeyemeyen bakteriler olarak tanımlamaktadır (Carr vd. 2002).
Çoğunlukla mezofilik bakteriler olmakla birlikte 5 oC gibi düşük bir sıcaklıkta gelişebilecekleri gibi 45 oC gibi yüksek sıcaklıkta da gelişim gösterebilmektedirler.
Benzer şekilde büyük bir çoğunlunun gelişimi için uygun olan pH değeri 4.0-4.5 iken, 3.2 gibi düşük bir pH değeri ya da 9.6 gibi yüksek bir pH değerinde aktif kalabilmektedirler. Pek çoğu zayıf proteolitik ve lipolitik aktiviteye sahiptirler (Caplice ve Fitzgerald 1999).
LAB’nin doğal yaşam alanları süt ve süt ürünleri, bitki ve bitki atıkları, insan ve hayvan bağırsak mukozalarıdır. Glikozu parçalama şekillerine göre homofermentatif ve heterofermentatif olmak üzere 2 gruba ayrılırlar. Homofermentatif LAB, glikozu EMP (Embden Meyerhoff Parnas) yoluyla parçalayarak % 90 laktik asit ve % 10 CO2
oluşturan bakterilerdir. Heterofermentatif LAB, glikozu HMP (Heksoz monofosfat) yoluyla parçalayıp laktik asidin yanı sıra etanol, asetik asit ve CO2 gibi yan ürünler oluşturan bakterilerdir (Evren vd. 2011).
LAB temel olarak Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus ve Lactococcus olmak üzere 4 cinsten oluşmaktadır (Carr vd. 2002). Gıdalarla bulunan LAB ise, Carnobacterium, Enterococcus, Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc, Oenococcus, Pediococcus, Streptococcus Tetragenococcus, Vagococcus, ve Wiessella cinslerinden oluşmaktadır (Vandamme vd. 1996).
8
LAB genel olarak güvenilir “GRAS” (Generally Recognized as Safe) kabul edilmelerinden dolayı, gıdaların fermantasyonunda oldukça fazla uygulama alanı bulmaktadırlar. Ayrıca gıdaların güvenilirliğini arttırmaları, organoleptik özelliklerini geliştirmeleri, besinsel faydaları, sağlık üzerine olumlu etkileri LAB’nin bilinen önemli özellikleridir (Widyastuti vd. 2014).
pH’nın düşürülmesi ve karbohidratların organik aside dönüştürülmesi laktik asit bakterilerinin fermente gıdaların korunması üzerindeki en önemli etkileridir (Šušković vd. 2010).
LAB antimikrobiyel etkiye sahip olup, antimikrobiyel etkileri oluşturdukları organik asitler (laktik, asetik, propiyonik) hidrojen peroksit, karbondioksit, diasetil, asetaldehit veya protein yapılardaki bakteriyosinler ile ilişkilidir (Caplice ve Fitzgerald 1999).
LAB tarafından üretilen protein yapıdaki bileşikler olan bakteriyosinler; mikrobiyolojik, fizyolojik ve teknolojik yararlarından dolayı gıdaların korunmasında yaygın olarak kullanılmaktadırlar. Ayrıca birçok bakteriyosinin Clostridium botulinum, Staphylococcus aureus ve Listeria monocytogenes gibi gıda kaynaklı patojenler üzerine etkili oldukları bilinmektedir (Leroy ve De Vuyst 2004).
Organik asitlerin antimikrobiyel etkileri pH’daki düşmeden ve moleküllerin dissosiye olmayan yapılarından kaynaklanmaktadır. Dissosiye olmamış asit, hücre membranına doğrudan dağılmakta ve hücre membran geçirgenliğini etkileyerek substrat transport sisteminin geçirgenliğini bozmaktadır (Caplice ve Fitzgerald 1999).
Aynı zamanda tat ve aroma maddesi olan asetaldehitin antimikrobiyel etkisi, lezzet eşiği mikroorganizmaların inhibisyonu için gerekli olan miktardan düşük olduğu için oldukça azdır. Benzer şekilde etanol, her ne kadar laktik asit bakterileri tarafından üretilse de gıda sistemlerinde üretilen miktarı antimikrobiyel etki için yeterli değildir. Bir başka tat ve aroma maddesi olan diasetilin gıda fermantasyonlarında etkili dozlarda kullanımı oldukça azdır (Caplice ve Fitzgerald 1999).
9
Diğer taraftan LAB’nin patojenler üzerinde etkili bir inhibisyon gerçekleştirebilmeleri için sayılarının yüksek olması istendiği bilinmektedir. Fermente edilmiş, LAB içeriği yüksek sayılara ulaşmış ve pH’sı çoktan düşmüş gıdalarda patojenlerin canlı kalamadıkları pek çok araştırmacı tarafından ortaya konulmuştur. Bununla birlikte LAB (Lactococcus lactis) ve patojen bakteri (E. coli) gıdaya (bebekleri sütten kesme gıdaları) aynı anda inoküle edildiğinde, başlangıçta LAB sayısı patojen bakteri sayısından 5 log birimden fazla bile olsa patojen sayısının 5 saat içinde 2 log birim artış gösterdiğini göstermiştir. Bu durum doğru hijyen uygulamalarının önemine dikkat çekmekte, fermantasyonun antimikrobiyel etkisinin doğru hijyen uygulamalarının yerine kullanılabileceği şeklinde değil, onun bir tamamlayıcısı olduğu şeklinde düşünülmelisini gerektirmektedir (Adams ve Nicolaides 1997).
Gıda endüstrisinde oldukça geniş uygulama alanı bulan LAB’nin yaygın olarak kullanıldığı alanlardan biri, kendilerinin bilinen en doğal ortamı olan süt ve süt ürünleridir (Widyastuti vd. 2014).
2.3 Fermente Süt Ürünleri
Türk Gıda Kodeksi Fermente Süt Ürünleri Tebliği’ne göre fermente süt ürünü, “sütün uygun mikroorganizmalar tarafından fermantasyonu ile pH değerinin koagülasyona yol açacak veya açmayacak şekilde düşürülmesi sonucu oluşan ve içermesi gereken mikroorganizmaları yeterli sayıda, canlı ve aktif olarak bulunduran süt ürününü” olarak tanımlanmaktadır (Anonim 2009).
Sütün fermente edilmesi çok eski bir uygulama olup tarihsel araştırmalar bu uygulamanın yaklaşık M.Ö 10000 yılına uzandığını ve fermente süt ürünlerinin orijinlerinin Orta Doğu ve Balkanlar olduğunu göstermektedir (Tamime 2002, Robinson ve Tamime 2006). Bugün dünya üzerinde geleneksel ve endüstriyel temelde yaklaşık 400 çeşit fermente süt ürünü olduğu bilinmekte fakat temelde bunların birbirinden çok büyük farklılıklar içermedikleri belirtilmektedir (Tamime 2002).
10
Sütün fermente edilmesinin temel nedeni raf ömrünün arttırılmasıdır. Fakat fermantasyon süte aynı zamanda tat ve aroma kazandırmakta, sindirilebilirliğini arttırmakta, geniş bir süt ürünleri yelpazesinin oluşturulmasını (yoğurt, peynir, kefir, kımız vb.) sağlamaktadır (Robinson ve Tamime 2006).
Fermente süt ürünlerinin dünya genelinde büyük bir bölümü kırsal alanlarda geleneksel olarak elde edilmektedir. Bunların büyük bir çoğunluğu sütün yapısında doğal olarak bulunan floradan ve ağırlıklı olarak laktik asit bakterilerinden dolayı kendiliğinden oluşan ürünlerdir (Robinson ve Tamime 2006).
Kendiliğinden oluşan fermente süt ürünleri laktik asit bakterileri ve diğer flora karışımının birlikte oluşturduğu, homojen olmayan, koagülasyonun düzensiz olduğu, yavan tada sahip olan ürünlerdir. Aksine, saf laktik asit kültürleri ile yapılan ürünler tat ve görünümleri ile daha tercih edilir olanlardır (Robinson ve Tamime 2006).
Gıdaların, özellikle süt ürünlerinin, fermantasyonunun mikroorganizma karakterizasyonuna bağlı olması 19. yy’da starter kültürlerin, büyük ölçekli üretimlerde kullanılmak üzere izolasyonuna yol açmıştır. Bu büyük gelişme saf kültürler ile yapılan ürünlerin kıvamının daha iyi olmasını, fermantasyonun ise daha güvenilir olmasını sağlamıştır (Caplice ve Fitzgerald 1999).
Çizelge 2.1’de bazı önemli fermente süt ürünleri ve içerdikleri LAB türleri verilmiştir.
11
Çizelge 2.1 Bazı fermente süt ürünleri ve içerdikleri LAB türleri (Panesar 2011)
Ürün adı Süt çeşidi İçerdiği mikroorganizma çeşidi
Ekşi Krema Manda ve inek sütü
L. lactis subsp. lactis L. delbrueckii subsp. bulgaricus
L. plantarum Streptococcus lactis
S. thermophilus S. cremoris
Yoğurt İnek sütü
S. thermophilus L. bulgaricus L. acidophilus Tereyağı Manda ve inek sütü S. lactis subsp. diacetylactis
S. cremoris
Kımız Kısrak ve deve sütü
L. acidophilus L. bulgaricus Saccharomyces
Micrococci
Kefir Koyun, inek ve keçi sütü
S. lactis Leuconostoc sp.
Saccharomyces
Kefir, Torula kefir, Micrococci
Peynir İnek, manda, koyun ve keçi sütü
L. lactis subsp. lactis L. lactis subsp. cremoris L. lactis subsp. diacetylactis
S. thermophilus
L. delbueckii subsp. bulgaricus Priopionibacterium shermanii
Penicillium roqueforti
Sonraları fermente süt ürünleri spesifik starter kültürlerle belirli koşullar altında üretilmeye başlanmıştır (Robinson ve Tamime 2006). Spesifik starter kültürlerin kullanılması fermantasyonu kontrol altında tutmakta ve son ürünün standardizasyonunu sağlamaktadır (Leroy ve De Vuyst 2004).
12 2.3.1 Yoğurt
Diyette önemli yeri olan fermente süt ürünlerinden biri gerek besinsel değeri gerek sağlık üzerine olumlu etkileri nedeni ile dünya genelinde büyük kabul gören yoğurttur.
Yoğurdun tarihinin yaklaşık M.Ö 6000 yılına dayandığı ve orijininin Orta Asya olup oradan dünyaya yayıldığı bilinmektedir. Bununla birlikte yoğurdun ilk olarak nasıl yapıldığına dair net bir bilgi olmayıp diğer fermente süt ürünlerinde olduğu gibi tesadüfen yapıldığı düşünülmektedir (Weerathilake vd. 2014).
Türk Gıda Kodeksi Fermente Süt Ürünleri Tebliği’ne göre yoğurt, “fermantasyonda spesifik olarak Streptococcus thermophilus ve Lactobacillus delbrueckii subsp.
bulgaricus’un simbiyotik kültürlerinin kullanıldığı fermente süt ürününü” olarak tanımlanmaktadır (Anonim 2009). Bununla birlikte Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus casei, Lactobacillus lactis, Lactobacillus jugurti, Lactobacillus helveticus, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium bifidus ve Bifidobacterium infantis gibi pek çok bakteri yoğurt kültürü olarak kullanılabilmektedir (Sfakianakis ve Tzia 2014).
Yoğurt oluşumu, süt proteini olan kazeinlerin asitlik gelişimi ile destabilizasyonu ve ısı ile denatürasyona uğramış serum proteinlerinin stabilitesini yitirmiş kazeinler ile interaksiyona girmesi prensibine dayanmaktadır (Özer ve Halkman 2015). Yoğurt kültürleri laktik asit fermantasyonu sırasında laktozdan laktik asit oluşturarak sütün pH’sını düşürmekte, böylelikle yoğurda özgü karakteristik tat ve koku sağlayıp, oluşturdukları pıhtı ile yoğurda stabilite ve viskozite kazandırmaktadırlar (Köse ve Ocak 2014).
Yoğurt, tekstürel özellikleri (sıvı, katı, yumuşak), yağ içeriği (az yağlı, yağsız), aroma özellikleri (doğal, meyveli, tahıllı) gibi geniş ürün yelpazesi ile yılın her zamanında yemeklerin yanında veya atıştırmalık olarak tüketilen bir süt ürünüdür. Ürün çeşitliliğinin yanı sıra sağlık üzerine olumlu etkilerinin olması ve zengin besinsel
13
içeriği, tüketimine olan talebi arttırmaktadır (McKinley 2005). Yoğurdun yararları arasında kemik sağlığının geliştirilmesi, tüm yaşam süresince sağlığın korunması ve geliştirilmesi, diyet kalitesinin arttırılması, vücut ağırlığının yönetimi ve kardiyometabolik hastalıklar gibi birçok hastalıkların önlenmesi önem taşımaktadır (Pekcan 2015).
Yoğurt çok iyi protein, kalsiyum, fosfor, riboflavin (B2 vitamini), tiamin (B1 vitamini), B12 vitamini, folik asit, magnezyum ve çinko kaynağıdır. Bununla birlikte süt ile kıyaslandığında, yoğurt proteinleri yüksek biyolojik değere, vitaminler ve mineraller de yüksek biyoyararlılığa (vücut içindeki absorbe edilme durumu) sahiptirler (McKinley 2005).
2.3.2 Yoğurt üretimi
Yoğurt üretiminin ilk zamanlar bilgi ve tecrübeye dayalı olarak, standart prosedürü olmayan basit yöntemler ile yapıldığı bilinmektedir. 20. yy’ın sonlarına doğru, kazançlı bir ürün olduğu fark edilerek üretim süreci standardize edilip endüstriyel boyutta, spesifik starter kültürlerle (LAB), belirli koşullar altında üretilmeye başlanmıştır (Robinson ve Tamime 2006, Sfakianakis ve Tzia 2014). Son 20 yıldaki üretimi ise ticari ve bilimsel sebeplerden dolayı büyük bir artış göstermiştir. Bilimsel çalışmaların, özellikle probiyotik yoğurtların geliştirilmiş duyusal ve tekstürel özelliklerinin yanı sıra sağlık üzerine olumlu etki gösterdikleri yönünde olması yoğurt üretimine olan talebi arttırmıştır (Sfakianakis ve Tzia 2014).
Şekil 2.1’de geleneksel yoğurdun genel üretim şeması verilmiştir.
14
Yoğurt Üretim Şeması
Çiğ Süt
Klarifikasyon
Ön Isıtma
Soğutma
Standardizasyon
Homojenizasyon
Pastörizasyon
Soğutma
Yoğurt Kültürlerinin İlavesi
Fermantasyon
Soğutma
Depolama
Şekil 2.1 Geleneksel yoğurt üretimi şeması
15
Yoğurt yapımı öncesi yoğurda işlenecek çiğ süt (genellikle inek sütü) bir takım ön işlemlerden geçirilmektedir. Öncelikle klarifikasyon işlemi ile somatik hücrelerin veya katı kirlilik unsurlarının sütten ayrılması sağlanmaktadır. Sonrasında süte 60-69 oC’ta 20-30 saniyelik ılıman bir ön ısıtma işlemi uygulanmaktadır. Bu işlem ile vejetatif hücrelerin ve kısmen de bazı enzimlerin inaktive olması amaçlanmaktadır. Isıtma işleminin ardından süt <5 oC’a soğutulmaktadır. Bir sonraki aşama sütün standardizasyonu aşamasıdır. Bu aşamada sütün yağ içeriği ve yağsız katı madde içeriği ayarlanmaktadır (Sfakianakis ve Tzia 2014). Türk Gıda Kodeksi Fermente Süt Ürünleri Tebliği’ne göre yoğurda işlenecek sütün yağ oranları yağsız yoğurt için ≤% 0.5, yarım yağlı yoğurt için % 1.5≤ süt yağı <% 2 ve tam yağlı yoğurt için ≥% 3.8 olmalıdır (Anonim 2009). Yoğurdun yağsız kuru madde içeriği ise % 9-16’dır. Bir sonraki işlem homojenizasyon aşamasıdır. Homojenizasyon işlemi ile yağ globülleri 2-10 μm’den 0.1- 1 μm’ye kadar küçültülmektedir. Bu işlem süt endüstrisinde genellikle 10-20 MPa basınç altında gerçekleştirilmektedir. Homojenizasyon işleminin ardından süt ısıl işleme tabi tutulmaktadır. Isıl işlemin amacı ürünün mikrobiyel açıdan güvenilirliğini sağlamaktır. Sütün pastörize edilmesinde farklı sıcaklık-süre uygulamaları yapılabilmektedir. Düşük sıcaklıkta pastörizasyon işlemi ile süt 63-65 oC’ta 30 dk veya 72-75 oC’ta 15-20 saniye süre ile pastörize edilmektedir. Bu işlem ile birçok patojen, vejetatif hücreler, mayalar ve küfler öldürülmektedir. Ayrıca pek çok enzim inaktif hale getirilmektedir. Pastörizasyon işlemi daha yüksek sıcaklıkta da yapılabilmektedir. Bu işlem 85 oC’ta 20-30 dk veya 90-95 oC’ta 5 dk olarak gerçekleştirilmektedir. Yüksek sıcaklıkta pastörizasyon işlemi ile sporlar hariç pek çok vejetatif hücre öldürülmekte, pek çok enzim aktivitesini kaybetmektedir (özellikle süt proteinazı plazmin ve bazı bakteriyel proteinaz ve lipaz enzimleri hariç). Yoğurt üretiminde belirtilen ısıl işlemlerden en yaygın olanı 85 oC’ta 20-30 dk uygulamasıdır. Isıl işlemin ardından süt fermantasyon sıcaklığına kadar soğutulmaktadır. Fermantasyon aşaması yoğurt kültürlerinin ilave edildiği, üretimin en kritik aşamasını oluşturmaktadır. Yoğurt olarak adlandırılan fermente süt ürünlerinin canlı iki bakteriyi (Streptococcus salivarius subsp.
thermophilus ve Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus) içermesi gerekmektedir.
Bu bakteriler genellikle süte 1:1 oranında ve % 2 (v/v) olacak şekilde ilave edilir.
Bununla birlikte yoğurt kültürü olarak Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus casei, Lactobacillus lactis, Lactobacillus jugurti, Lactobacillus helveticus, Bifidobacterium
16
longum, Bifidobacterium bifidus ve Bifidobacterium infantis gibi pek çok bakteri de kullanılabilmektedir. Fermantasyon sırasında laktik asit bakterilerinin metabolizmaları sonucunda laktoz laktik aside dönüşmekte ve oluşan laktik asit, süt proteinlerini koagüle ederek yoğurdun yapısını oluşturmaktadır. Bu işlem sırasında aynı zamanda yoğurdun kendine özgü tat ve aroması oluşmaktadır. Fermantasyon süresince pH düşmekte, arzu edilen pH değerine (4.3-4.7 pH) ulaşınca fermantasyona son verilmektedir (Sfakianakis ve Tzia 2014, Weerathilake vd. 2014). Sıcaklığa bağlı olarak fermantasyon süresi 3-18 saattir. Yoğurt üretiminde uzun ve kısa olmak üzere iki tür fermantasyon uygulanabilmektedir. Fermantasyon sıcaklığı, genellikle uzun fermantasyon uygulamasında 30 oC, kısa fermantasyon uygulamasında 43-45 oC olarak seçilmektedir (Bachrouri vd. 2006). Fermantasyon işlemini takiben soğutma ve depolama işlemi gerçekleştirilmektedir. Bu işlem için yoğurt 5 oC dolaylarına alınmaktadır. Soğutma işleminin amacı, starter kültürlerin gelişiminin ve metabolik reaksiyonlarının durdurulması ve asitlik artışının önüne geçilmesidir. Soğutma işlemi hızlı bir şekilde 10
oC’ın altına alma şeklinde yapılabileceği gibi, önce hızlı bir şekilde 20 oC’ın altına alma sonra aşama aşama sıcaklığı 5 oC dolaylarına düşürme şeklinde de yapılabilmektedir.
İkincisi yoğurdun yapısal özellikleri dikkate alınarak yapılan bir uygulama olup daha çok meyve ilave edilen yoğurt üretimlerinde tercih edilmektedir (Sfakianakis ve Tzia 2014).
2.3.3 Yoğurtta bulunan LAB ve aralarındaki simbiyotik ilişki
Streptococcus thermophilus ve Lactobacillus bulgaricus genelde yoğurt starter bakterileri olarak kullanılan ve yoğurt üretiminden sorumlu olan laktik asit bakterileridir. Streptococcus thermophilus, homofermentatiftir ve 45-52 oC'ta gelişebilmektedir. Optimum gelişme pH'sı 6.0-6.5 olup aerobik ve fakültatif anaerob özellik göstermektedir. Proteolitik aktivitesi zayıftır. Lactobacillus bulgaricus, homofermentatiftir. Bu türün tüm varyeteleri 45 oC'ta iyi bir şekilde gelişirken bazıları 48-52 oC'ta da gelişebilmektedir. Optimum gelişme pH' sı 5.2-5.5 arasındadır.
Proteolitik aktivitesi zayıftır. Ancak Streptococcus thermophilus'a göre daha fazla proteolitik aktiviteye sahiptir. Laktozu fermente etme yeteneği yüksektir ve laktozun yanı sıra glukoz, fruktoz, galaktozu da kullanabilir (Yılmaz ve Temiz 2003).
17
Yoğurt bakterileri starter kültür olarak süte 1:1 oranında ilave edilir (Caplice ve Fitzgerald 1999). Sütte ilk olarak Streptococcus thermophilus hızla gelişir ve çözünmüş oksijen (O2) varlığında laktozu fermente ederek laktik asit oluşturur. Bu şekilde asitliğin gelişmesi, Lactobacillus bulgaricus'un gelişimini teşvik eder. Benzer şekilde Lactobacillus bulgaricus'un da süt proteinlerini yıkıma uğratarak oluşturduğu glisin, valin, histidin, lösin ve metiyonin gibi aminoasitler proteinaz enzimine sahip olmayan Streptococcus thermophilus'un gelişimini teşvik eder. Bu şekilde simbiyotik olarak gelişen yoğurt bakterileri laktozu metabolize ederek laktik asit, çeşitli aroma bileşikleri ve bazen ekzopolisakkarit üretirler. Yoğurt bakterileri bir arada kullanıldıklarında yalnız başlarına kullanıldıklarından daha fazla laktik asit ve aroma üretirler (Erginkaya ve Kabak 2011). Streptococcus thermophilus 4.2-4.4 pH dolaylarında inhibe olurken, Lactobacillus bulgaricus 3.5-3.8 pH’yı tolere edebilmektedir (Caplice ve Fitzgerald 1999).
2.4 Gıda Kaynaklı Hastalıklar
Son yıllarda, ‘Gıda Güvenliği’ ve ‘Gıda Savunması’ kavramları global düzeyde en çok konuşulan konular arasında yer almaktadır. Bu terimlerden gıda savunması, gıda ürünlerinin, normal şartlarda üretim zinciri içinde yer almayan kimyasal, biyolojik, fiziksel ve radyolojik etkenlerle kasıtlı kontaminasyonunu; gıda güvenliği ise, gıda ürünlerinin, normal üretim zinciri içinde yer alabilecek Listeria monocytogenes, Salmonella, Campylobacter ve E. coli O157:H7 gibi patojenler, kimyasal veya fiziksel tehlikelerle kasıtlı olmayan kontaminasyonunu önleme çabası olarak tanımlanmaktadır (http://www.fda.gov 2012, http://www.fsis.usda.gov 2014b).
Gıda tedarik zinciri, son derece karmaşık aynı zamanda çeşitli ajanlarla kasıtlı olarak kontamine edilmeye oldukça açık bir sistemdir. Sistemdeki açıklar ve kontaminant maddelerin çeşitliliği geçmişte, kasıtlı olarak yapılan çeşitli gıda kontaminasyonlarını olası hale getirmiştir. 1984 yılında bir grup dini tarikat üyesi Oregon’da farklı restoranlardaki 10 salata barına Salmonella Typhimurium bulaştırarak 751 kişinin hastalanmasına yol açmışlardır (Török vd. 1997). 1996 yılında Dallas’ta halinden
18
şikayetçi bir hastane çalışanı personel dinlenme odasındaki atıştırmalık gıdaları Shigella dysenteriae tip 2 ile bozarak 12 kişinin rahatsızlanmasına neden olmuştur (Khan vd.
2001). 2003 yılında Michigan’da bir süper market çalışanı sığır etine nikotin bulaştırarak 92 kişinin hastalanmasına neden olmuştur (http://www.cdc.gov 2003a).
2007 yılında Çin’in Kuzeydoğu’sundaki bir hastanede 203 kişinin hastalanması, aralarından bir kişinin ölümü ile sonuçlanan zehirlenme olayının kasıtlı olarak yapıldığı bildirilmiştir (http://www.china.org 2007).
Kasıtlı olarak gerçekleştirilen kontaminasyonların sayısı seyrek olmakla birlikte, yarattığı sonuçlar bakımından etkisi oldukça büyüktür. Kasıtlı kontaminasyonlar, önemli ölçüde kamu sağlığı sorunlarının oluşmasına, halk arasında korkunun yayılmasına, yıkıcı ekonomik etkilere, gıda güvenliği ve devletin etkinliği konusunda halkın güveninin yitirilmesine, ticarette aksamalara ve gıda güvenilirliliği konusunda endişeye neden olabilmektedir. Bu durum da otoriteleri oluşabilecek kasıtlı kontaminasyonlara karşı zaaf değerlendirmesi yapmaya zorlamaktadır (http://www.fda.gov 2012).
Halk sağlığı açısından kasıtlı olarak yapılmayan kontaminasyonlar da en az kasıtlı olarak yapılan kontaminasyonlar kadar önem taşımaktadır. Uzmanlar bu durumu, kasıtsız olarak oluşan salgınların kötü niyetli kişi veya kişiler tarafından tekrar oluşturulmasının daha korkunç sonuçlar oluşturabileceği şeklinde yorumlamaktadır.
2003 yılında FDA bu konuyu “Eğer kasıtsız olarak oluşan bir kontaminasyon 300 bin kişiyi etkiliyorsa, bu durum, daha tehlikeli kimyasal, biyolojik veya radyonükleer ajanlarla kasıtlı olarak yapılırsa yıkıcı etkiler doğurabilir” şeklinde yorumlamıştır (http://seafood.oregonstate.edu 2003b).
Geçmişte, kasıtsız olarak gerçekleşen ve oldukça büyük salgınlara neden olan gıda kontaminasyonları ile karşılaşmak mümkündür. Nitekim 1985 yılında ABD’de pastörize sütün Salmonella Typhimurium ile kasıtsız olarak kontamine olması sonucu 170 bin kişinin hastalandığı bildirilmiştir. Bu olaydan 10 yıl sonra ABD’de 41 eyalette, Salmonella Enteriditidis’in dondurmaya bulaşması sonucunda kontamine olmuş
19
dondurmayı tüketen yaklaşık 224 bin kişinin hastalandığı belirtilmiştir (http://seafood.oregonstate.edu 2008).
İster kasıtlı ister kasıtsız olsun gıda kaynaklı hastalıklar, bütün dünyada en önemli halk sağlığı sorunları arasında gösterilmektedir. ABD dünyanın en güvenli gıda tedarikçilerinden birisi olmasına rağmen, ABD Hastalık Kontrol ve Önleme Merkezi (CDC), gıda kaynaklı olarak; her yıl 48 milyon insanın hastalandığını, 128 bin insanın hastaneye yatırıldığını ve 3 bin insanın yaşamını yitirdiğini açıklamıştır (http://www.cdc.gov 2011). Gıda kaynaklı hastalıkların 9.4 milyonunun, hastaneye yatırılmaların 55961’inin, ölümlerin 1351’inin gıda kaynaklı patojenler (virüs, bakteri, parazit vb.) nedeniyle olduğu belirtilmiştir (Scallan vd. 2011).
Diğer taraftan birçok çalışma, sütü insan sağlığına etki eden gıda kaynaklı patojenlerin kaynağı olarak göstermektedir. Özellikle Campylobacter jejuni, şiga toksin üreten E.
coli (STEC), Listeria monocytogenes ve Salmonella süt ve süt ürünlerinde bulunan en önemli patojen mikroorganizmalar olarak birçok araştırmaya konu olmuştur (Oliver vd.
2005).
Gıda kaynaklı hastalıklara en çok neden patojenlerin nörovirüs ve Salmonella spp.
olduğu bildirilmiştir (http://www.cdc.gov 2014a). Enfeksiyonlara neden olan Salmonella izolatları serotiplendirildiğinde ilk üç sırayı Enteritidis, Typhimurium ve Newport’un oluşturduğu yine raporlarda belirtilenler arasındadır (Crim vd. 2014).
Salmonella aynı zamanda süt ürünleri tüketimi ile ilişkili hastalıkların en sık nedeni olarak gösterilmektedir. Bununla birlikte, süt ürünleri kaynaklı oluşan vakaların ne kadarının yoğurt ve diğer fermente süt ürünleri ile ilgili olduğuna yönelik ulaşılabilir bir veri yoktur (Szczawińska ve Szczawiński 2011). Diğer taraftan yoğurt, FDA tarafından hazırlanan listede gıda savunması açısından zaaf değerlendirmesi yapılması gereken, yani tedarik sürecinde güvenlik açığı bulunan ürünler arasında gösterilmektedir (http://www.fda.gov 2012).
20
Çiğ sütün mikrobiyel yükünün fazla olması, yetersiz ısıl işlem, hijyen eksikliği nedeniyle paketleme sırasındaki ikincil bulaşma vb. nedenler, yoğurdun Salmonella içermesini olası kılmaktadır. Literatür bilgileri, yoğurdun Salmonella gelişimi için uygun ortam olmadığını belirtse de mikroorganizma; ürün türü, pH değeri, depolama sıcaklığı ve çevresel koşullara bağlı olarak son üründe canlılığını sürdürebilmektedir (Szczawińska ve Szczawiński 2011).
2.5 Salmonella
Salmonella, Enterobacteriaceae üyesi olan Gram negatif, fakültatif anaerob, çubuk şeklinde, 0.7-1.5 x 2-5 μm boyutlarında, genellikle hareketli bakterilerdir (Bell ve Kyriakides 2002).
Salmonella cins ismi ilk kez 1900 yılında Ligniéres tarafından, Amerikan bakteriyologlar D. E Salmon ve T. Smith’in çalışmalarına dayanarak önerilmiştir. Bu bakteriyologlar domuz vebasına neden olan Bacterium suipestifer olarak isimlendirilen bakteriyi tanımlamışlardır. Sonrasında bu bakteri S. choleraesuis olarak Salmonella türleri içerisine dâhil edilmiştir (Bell ve Kyriakides 2002).
Salmonella cinsi; S. enterica ve S. bongori olmak üzere iki türe ayrılmaktadır. S.
enterica’da kendi içinde 6 alt türe (I, II, IIIa, IIIb, IV, ve VI) ayrılmaktadır. Bunlardan
“V.” sonrasında S. bongori olarak farklı özellikleri nedeni ile gruptan ayrılmıştır. İnsan patojeni türler en çok S. enterica alt türleri arasında yer almaktadır (Crum-Cianflone 2008). Çizelge 2.2’de Salmonella türlerine ait biyokimyasal özellikler verilmiştir.
21
Çizelge 2.2 Salmonella’ya ait biyokimyasal özellikler (Bell ve Kyriakides 2002)
Reaksiyon Reaksiyon yanıtı
Katalaz +
Oksidaz -
Laktozdan asit oluşturma -
Glukozdan gaz oluşturma* +
İndol -
Üreaz oluşturma -
Triple-sugar-iron agardan hidrojen sülfit oluşturma + Karbon kaynağı olarak sadece sitrat kullanımı* +
Metil red +
Voges-proskauer -
Lisin dekarboksilaz +
Ornitin dekarboksilaz +
“+” pozitif reaksiyon; “-“negatif reaksiyon; *S. Typhi hariç. S. Typhi bu reaksiyonlarda negatif sonuç vermektedir.
Kauffman ve White şemasına göre O (Somatik) ve H (Flagellar) antijenlerindeki farklılıklar baz alınarak 2500’ün üzerinde serotip rapor edilmiştir (Crum-Cianflone 2008).
Salmonella adlandırması diğer mikroorganizma adlandırmalarından farklıdır. Standart adlandırmada cins ve tür ismi kullanılır ve tümü italik yazılır. Salmonella ise serotipler ile ifade edilir ve serotip ismi büyük harfle başlar, italik olmadan yazılır (Halkman 2013). Adlandırmada kısaltma yapılabilir. Örneğin açık ismi “Salmonella enterica subspecies enterica serotype Typhimurium” olan mikroorganizma, tür isimleri dâhil edilmeyerek kısaca serotip üzerinden “Salmonella Typhimurium” olarak ifade edilebilir (Crum-Cianflone 2008).
Salmonella cinsi ya insan ya hayvan veya hem insan hem hayvanlarda hastalık oluşturabilen türlere sahiptir. Bazıları insan vücuduna kolay adapte olurken bunun tersi de mümkündür. Örneğin, S. typhi sadece insanlarda enfeksiyona neden olurken, S.
Dublin ağırlıklı olarak sığırlar üzerine enfekte olmaktadır (Crum-Cianflone 2008).
22
Doğal habitatları sıcak kanlı hayvanlar olarak tanımlanan memelilerin bağırsak sistemleri olan Salmonella spp., toprakta, havada suda, lağım ve atık sularında, insan ve hayvanlarda, hayvan yemlerinde, insan gıdalarında, alet ekipman ve bazı meyve sebzelerde bulunur (Halkman 2013). Salmonella vakalarının büyük bir çoğunluğuna (> % 95) kontamine olmuş gıdaların, özellikle yumurta, tavuk eti ve kırmızı et ve süt ürünleri gibi gıdaların tüketiminin neden olduğu belirtilmektedir (Crum-Cianflone 2008).
Çizelge 2.3’te diğer koşulların optimum tutulması durumunda Salmonella’nın gelişim gösterdiği pH, sıcaklık ve su aktivitesi (aw) alt ve üst limit değerleri verilmiştir.
Çizelge 2.3 Salmonella’nın gelişim gösterdiği çevresel koşulların limit değerleri (Bell ve Kyriakides 2002)
Parametre (Diğer koşullar opt.) Minimum Maksimum
Sıcaklık oC 5.2 46.2
pH 3.8 9.5
Su aktivitesi 0.94 >0.99
Çizelge 2.3’te belirtilen gelişmesi için gerekli çevresel koşullardaki limit değerlerin yanı sıra yapılan çalışmalar Salmonella spp.’nin ≤54 oC ve 3 pH gibi optimum gelişme aralıklarının dışında kalan ekstrem çevresel koşullara adapte olabildikleri yönündedir (Tan vd. 2014). Birçok çalışma Salmonella spp.’nin asitli gıdalarda çok uzun süre canlı kalabileceklerini (elma, portakal, ananas ve üzüm konsantrelerinde 12 haftaya kadar, yoğurtta 10 haftaya kadar, mayonezde 4 haftaya kadar) göstermiştir (Álvarez-Ordóñez vd. 2012).
Suşlara ve substrata bağlı olarak değişiklik göstermekle birlikte çok az Salmonella türü 7 oC’ın altında gelişebilmektedir. 15 oC’ın altında ise gelişme hızlarında büyük düşüş gözlenmektedir. Sıcaklığa karşı duyarlılıkları mikroorganizmanın ısıl uygulama öncesi maruz kaldığı durumlara ve gıdanın bileşenlerine bağlı olarak değişiklik göstermektedir.
Su aktivitesinin düşük olduğu koşullarda mikroorganizmanın ısıl direnci artarken,
23
pH’nın düşük olduğu durumlarda ise tersine olarak azalmaktadır (Bell ve Kyriakides 2002).
2.6 Yoğurtta Patojen Davranışı Üzerine Yapılan Çalışmalar
Laktik asit bakterilerinin Salmonella’ya karşı antagonistik etki gösterdiği bilinse de kültüre edilmiş süt ürünlerinde Salmonella davranışı farklı olabilmektedir. Örneğin Al- Haddad (2003) tarafından yürütülen bir çalışmada Salmonella Infantis yoğurtta 10 gün boyunca canlılığını korurken, aynı örnekte Salmonella Haddar sadece 2 gün sonra canlılığını yitirmiştir.
Szczawińska ve Szczawiński (2011) tarafından yürütülen bir başka çalışmada S.
Enteritidis’in yoğurtta farklı depolama sıcaklıklarındaki gelişimi incelenmiştir. Yoğurt örnekleri S. Enteritidis’in 3 farklı suş karışımı ile inoküle edilmiş, 5, 10, 15, 20 ve 25
oC'ta 24 saat süreyle depolanmıştır. S. Enteritidis sayısı her iki saatte bir sayılmıştır.
Bütün örneklerde S. Enteritidis sayısı depolama süresince lineer bir şekilde azalmıştır.
Depolama sıcaklığı, S. Enteritidis’in canlı kalması üzerine istatistiksel olarak önemli ölçüde etki etmiştir. 5 oC'ta depolama işlemi sırasında S. Enteritidis sayısı en yavaş azalmayı göstermiştir (D değeri 31.25 saat). Diğer depolama sıcaklıkları için D değerleri 25.64 sa (10 oC), 22.73 sa (15 oC), 14.29 sa (20 oC) ve 7.52 sa (25 oC) olarak bulunmuştur.
Álvarez-Ordóñez vd. (2012) tarafından yürütülen bir diğer çalışmada, Salmonella Typhimurium’un aside dirençli ve dirençsiz hücrelerinin farklı depolama sıcaklıklarında (4, 10, 25 ve 37 oC), pastörize yoğurt (pH 4.1) ve portakal suyundaki (pH 3.6) canlı kalma durumları araştırılmıştır. Aside dayanıklı ve dayanıklı olmayan hücreler sırasıyla, sitrik asit ile asitlendirilmiş Brain Heart Infusion Broth (pH 4.8) ve tamponlanmış Brain Heart Infusion Broth'ta (pH 7.0), 36 saatlik gelişimleri izlenerek belirlenmiştir. S.
typhimurium her iki gıdada da, özellikle de yoğurtta, canlı kalma konusunda büyük başarı sağlamıştır. Hem aside dirençli hem de dirençsiz hücreler, depolama sıcaklığı 4- 25 oC aralığında iken 43 gün sonra sadece 1.3-1.9 log birim azalma göstermişlerdir. En
24
fazla bakteriyel inaktivasyon 37 oC’ta gerçekleştirilmiştir (4.0-4.4 log birim). Portakal suyunda, aside dirençli ve dirençsiz hücrelerde farklı davranışlar gözlenmiştir. 4 ve 10
oC’ta aside dirençsiz hücreler dirençlilere oranla daha iyi canlılıklarını korurken, aside dirençli hücreler yüksek sıcaklıklara (25-37 oC) daha iyi direnç göstermişlerdir. Aside dirençli olmayan ve aside dirençli hücreler için 5 log birimlik azalma sırasıyla; 10.2-6 (4 oC), 6.3-4.2 (10 oC), 0.6-1.0 (25 oC) ve 0.10-0.15 (37 oC) gün olarak belirlenmiştir.
Çalışma sonrası, buzdolabı sıcaklığının asitli gıdalarda S. Typhimurium’un inaktivasyonunu önlediği ve S. Typhimurium’un asit toleransının depolama sıcaklığı ile ilişkili olduğu sonucu çıkarılmıştır.
Yoğurtta patojen davranışı hem ulusal ve hem uluslararası alanda üzerinde çalışılan bir konudur. Salmonella spp. dışındaki çeşitli gıda patojenlerinin yoğurttaki gelişimi de farklı araştırmacılar tarafından çalışılmıştır. Massa vd. (1997) tarafından, yoğurdun hazırlanması ve 4 oC'ta depolanması sırasında E. coli O157:H7’nin canlı kalma durumunun araştırıldığı bir çalışmada, inek sütüne 103 ve 107 KOB/mL oranında E. coli O157:H7 inoküle edilmiş, 42 oC'ta 0-5 sa süre ile fermantasyona bırakılmıştır.
Fermantasyon sonrası yoğurtlar 4 oC'ta 7 gün süre ile depolanmıştır. Çalışmada iki çeşit yoğurt kullanılmıştır. Birincisi Lactobacillus bulgaricus ve Streptococcus thermophilus ile hazırlanan geleneksel yoğurt, ikincisi ise bifido yoğurt olarak adlandırılan Lactobacillus bulgaricus ve Streptococcus thermophilus'un yanı sıra Bifidobacterium bifidum ilave edilerek hazırlanan yoğurttur. 7. gün sonunda E. coli O157:H7 sayısı geleneksel yoğurtta düşük ve yüksek patojen inokülüm değerlerinde sırası ile 3,52'den 2.72 log KOB/g’a, 7.08’den 5.32 log KOB/g’a; bifido yoğurtta 3.49'dan 2.73 log KOB/g’a, 7.38’den 5.41 log KOB/g’a düşmüştür. Geleneksel yoğurtta düşük ve yüksek patojen inokülümü sonrası pH değerlerinin sırasıyla 6.6’dan 4.5 ve 4.4’e; bifido yoğurtta 6.6’dan 4.6 ve 4.5’e düştüğü görülmüştür.
Pazakova vd. (1997) tarafından yoğurt kültürünün, süte çeşitli oranlarda ilave edilen Staphylococcus aureus CCM 5984’un, fermantasyon ve depolama süresince gelişimi üzerine etkisi incelenmiştir. Fermantasyon işlemi sonrasında (3-5 sa) Staph. aureus sayısında yalnızca çok hafif bir indirgenme gözlenirken, 4 oC’ta depolama süresince ise 1-2 log birimlik azalma gözlenmiştir 103 KOB/mL Staph. aureus ile kontamine edilen
