i
T.C.
GAZİOSMANPAŞA ÜNİVERSİTESİ
Bilimsel Araştırma Projeleri KomisyonuSonuç Raporu
Proje No: 2009/44
Tokat ve Ordu Çevresindeki Sert Kenelerde (Acari: Ixodidae) Kene Kökenli Ensefalit Virisü Varlığının Tespiti
Proje Yöneticisi Doç Dr. Şaban TEKİN
Birimi Biyoloji Bölümü
Araştırmacılar ve Birimleri Tünay KARAN Fen Edebiyat Fakültesi
Biyoloji Bölümü (Ocak / 2011)
ii ÖZET
TOKAT VE ORDU ÇEVRESĠNDEKĠ SERT KENELERDE (ACARI:
IXODIDAE) KENE-KÖKENLĠ ENSEFALĠT VĠRÜSÜ VARLIĞININ
TESPĠTĠ (*)
Kene Kökenli Ensefalit Virüsü (TBE) Flaviviridae familyasına ait olan Flavivirüs genusu üyesidir. TBE Avrupa‟dan Asya‟ya kadar uzanan bir kuĢakta endemik olarak görülmektedir. Hastalığın üç büyük formu vardır; Merkez Avrupa, Uzak Doğu ve Sibiryan alt tipi. TBE insanlara genellikle Ixodes ricinius, Ixodes persulcatus ve Haemphysalis concinna türü kenelerin ısırmasıyla bulaĢır. Türkiye‟deki kene türlerinde Kene Kökenli Ensefalit Virüsü (TBEV) varlığıda dair yeterli bilgi bulunmamaktadır. Bu çalıĢmada, Tokat, Ordu merkez ve Fatsa ilçelerinden toplanan değiĢik sert kene türlerinde TBEV‟ünün varlığı RT-PCR ile test edilmiĢtir. RT-PCR sonuçlarına göre çalıĢmamız da toplanan sert kene türlerinde TBEV varlığına rastlanmamıĢtır. Bu sonuç, en azından çalıĢma bölgemizde toplanan kene türlerinin TBEV ile bulaĢık olmadığını ve TBEV bulaĢtırma riski taĢımadıklarını göstermektedir.
Anahtar kelimeler: Kene, TBEV, RT-PCR, Tokat,
(*) Bu çalıĢma GaziosmanpaĢa Üniversitesi Bilimsel AraĢtırma Projeleri Komisyon BaĢkanlığı tarafından 2009-44 No‟lu proje olarak desteklenmiĢtir.
iii ABSTRACT
DETERMINATION OF TICK-BORNE ENCEPHALITIS VIRUS IN IXODID TICKS (ACARI: IXODIDAE) FROM TOKAT AND ORDU
VICINITY
Tick-borne encephalitis virus (TBEV) is a member of the genus Flavivirus in the family of Flaviviridae. TBE is an endemic disease from Europe to Asia. TBE is an infectious disease involving the central nervous system, which may result in death. There are three major forms of the disease; Central European, Far Eastern and Siberian subtypes. TBEV is tranmitted to humans by ixodid tick species such as Ixodes ricinius, Ixodes persulcatus and Haemphysalis concinna. There are no evidence for the presence of TBEV in ticks species in Turkey. In the present study, presence of TBEV in hard ticks from Tokat and Ordu and Fatsa provinces were tested using revers transcriptase-polimerase chain reaction (RT-PCR). According to RT-PCR results, no TBEV detected in ticks collected in this study. This result indicated that hard ticks of the region tested were not harbored TBEV and have no potential for transmission of TBEV.
iv ÖNSÖZ
Bu çalıĢmada Tokat, Ordu merkez ve Fatsa ilçelerinden toplanan değiĢik sert kene türlerinde TBEV‟ünün varlığı RT-PCR ile test edilmiĢtir. ÇalıĢmamız genelde sıkıntısız seyeretmesine rağmen özellikle Tokat bölgesinde arazide bazı TBEV spesifik sert kene türlerine yeterince rastlanmamıĢtır. Ordu çevresinde yapılan örnek toplama çalıĢmaları zaman almasına karĢın ilgili kuruluĢların yardımı sayesinde gerçekleĢmiĢtir. ÇalıĢmamız sırasında örneklerin temininde katkıda bulunan Tokat Devlet Hastanesi, Ordu Devlet ve Fatsa Devlet Hastanesi BaĢhekimleri ve personeline de teĢekkür ederiz. Ayrıca örneklerin tür tayinlerinde yardımcı olan Yrd. Doç. Ahmet Bursalı ve Uzman Adem Keskin‟e teĢekkür ederiz.
ÇalıĢmamızın bir özeti EURAAC (EURopean Association of Acarologists) Newsletter‟ın 2011 Mayıs sayısında yayınlanacaktır. Ayrıca çalıĢmamızın sonuçları 2011 yılında yapılacak uluslar arası bir konferansta poster olarak sunulmak üzere baĢvuru yapılmıĢtır.
v İÇİNDEKİLER Sayfa ÖZET……… i ABSTRACT………. ii ÖNSÖZ………... iii SĠMGE VE KISALTMALAR DĠZĠNĠ……… vi ġEKĠLLER DĠZĠNĠ……….. vii ÇĠZELGELER DĠZĠNĠ………. ix 1.GİRİŞ ve LİTERATÜR ÖZETİ……….. 1 1.1 . Tarihçe………... 2
1.2.1. Kene kökenli Ensefalit Hastalığı‟nın Dünyada ve Türkiye‟deki Epidemileri………..…... 2
1.2.1. Dünya‟daki Epidemileri………...…... 2
1.2.2. Türkiye‟de TBE Epidemileri………..…… 6
1.3. TBE Virüsünün Yapısı, Özellikleri ve TaĢınımı………... 7
1.3.1. TBE Virüsünün Yapısı ………... 7
1.3.1.1. Flaviviriade Ailesindeki Virüslerin Replikasyonu……….. 9
1.3.2 . TBE Virüsünün Özellikleri………. 9
1.3.3. Kene Kökenli Ensefalit Virüsünün TaĢınımı………... 10
1.4. TBE Hastalığında Enfeksiyon OluĢumu, Klinik Yol,Tanısı,Tedavisi ve Korunma Yolları……….. 11
1.4.1. TBE Hastalığında Enfeksiyon OluĢumu……….….. 11
1.4.2. Klinik Yol ve Hastalığın Ortaya çıkması……….… 13
1.4.3. TBE Hastalığının Tanısı……….….. 14
1.4.4. TBE Hastalığından Korunma Yolları……….….. 15
1.4.4.1. TBE AĢısı……….………… 16
2. MATERYAL VE YÖNTEM……… 17
2.1. Materyal ……….……….... 17
2.1.1. Kullanılan Kimyasal madde ve Malzemeler………...……… 17
2.1.2. Cihazlar……… 18
2.1.3. Tampon ve solisyonların HazırlanıĢı………... 18
2.1.3.1. 0.5 M EDTA Solisyonu………..………... 18
2.1.3.2. 50X Tris Aceteta EDTA (TAE) Tamponu ………..………... 18
2.1.3.3. 1X TE Tamponu ………..……….………... 19
2.1.3.4. 3M Sodyum Asetat Solüsyonu..……….………...……... 19
2.1.3.5. Etidium Bromür.…….……….………. 19
2.1.3.6. 6X Bromophenol Blue……….. 19
2.1.1.3.7. ÇalıĢmada Kullanılan Primerler………... 20
2.2. Yöntem….………..……… 21
2.2.1. Kene Dokularının Ayrılması…...………. 21
2.2.2. Viral RNA Ekstrasyonu…..……….………... 21
2.2.3. One – Step Reverse Transkripsiyon Polimeraz Zincir Reaksiyonu (RT-PCR)…22 . 2.2.3.1. Thermal cycler‟ın Program Ayarı………. 22
vi
2.2.4. Agaroz Jel Elektroforezi………..……… 22
2.2.4.2. Örneklerin Agaroz Jele Yüklenmesi ve Yürütülmesi………...…… 23
2.2.5. DNA Dizi Analizi………...……. 23
İÇİNDEKİLER Sayfa 3. BULGULAR……….….…. 24
3.1. Tokat ve Amasya Bölgesi Kenelerinde TBEV Varlığı……….. 24
3.2. Ordu Merkez ve Fatsa Bölgesi Kenelerinde TBE Varlığı……….…24
4. TARTIŞMA ve SONUÇ……….… 26
vii SİMGE ve KISALTMALAR DİZİNİ Simgeler Açıklama oC Santigrat Derecesi g Gram L Litre M Molar % Yüzde o Derece Kısaltmalar Açıklama Ark. ArkadaĢları
TBE Kene Kökenli Ensefalit Bç Baz çifti
cDNA Komplementer DNA dk Dakika
DNA Deoksiribonükleik asit
dNTP Deoksiribonükleosit Trifosfat DTT Ditiotrietol
EDTA Etilendiamintetraasetik Asit ELISA Enzim Bağlı Ġmmün Assay HCL Hidrojen Klorür
IgG Ġmmunoglobulin G IgM Ġmmunoglobulin M Kb Kilobaz
KKKA Kırım Kongo Kanamalı AteĢi CNS Merkezi Sinir Sistemi
viii mA Miliamper
mg Miligram ml Mililitre
TBEV Kene Kökenli Ensefalit Virüsü mM Milimolar
MW Moleküler Ağırlık nmol Nanomolar
ppm part per million
PCR Polimeraz Zincir Reaksiyonu RNA Ribonükleik asit
RNAase RNAaz
RSHM Refik Saydam Hıfzısıhha Merkezi
RT-PCR Reverse Transkripsiyon Polimeraz Zincir Reaksiyonu TAE Tris-Asetat EDTA
TE Tris-EDTA UV Ultraviyole Pmol Pikomol µl Mikrolitre µl Mikromol
ix
ŞEKİLLER DİZİNİ
Şekil Sayfa
ġekil 1.1 Kene Kökenli Ensefalit Hastalığı‟nın Dünya‟daki yayılıĢı…...5
ġekil 1.2 Mevsimsel kene aktivitesi ile TBE insidansı arasındaki iliĢki………6
ġekil 1.3 Arbovirüs ailesi………...8
ġekil 1.4 TBE virüsünün yapısı ve elektron mikroskoptaki görünümü…………....8
ġekil 1.5 TBE Virüsü‟nün yapısal ve yapısal olmayan proteinleri………9
ġekil 1.6 Flaviviridae ailesindeki virüslerin replikasyonu………10
ġekil 1.7 TBE Virüsü'nü taĢıyan bazı kene türleri………...10
ġekil 1.8 TBE hastalığının real-time PCR ile tanısı………..15
ġekil 3.1 RT-PCR sonrası PCR ürününün agaroz jel görüntüsü ... 25
x
ÇİZELGELER DİZİNİ
Çizelge Sayfa Çizelge 1.1. 2001-2003 yılları arasında çeĢitli ülkelerde TBE'li vaka sayısı………. 4
Çizelge 1.2. 2005-2009 yılları arasında TBE hastalık sıklığının arttığı ülkeler……. 6 Çizelge 1.3. TBE virüsünü kene dıĢında bulaĢtıran diğer hayvanlar……… 11
Çizelge 1.4. TBEV suşlarının görüldüğü kene türleri……….. 12 Çizelge 1.5. TBE aĢısının içeriği……….….. 17 Çizelge 2.1. Bu çalıĢmada TBEV varlğını test etmek için toplanan
kene cinsleri……… 19 Çizelge 2.2. Bu çalıĢmada TBEV varlığını test etmek için kullanılan primerler…. 20
1. GİRİŞ VE KAYNAK ÖZETLERİ
Tick-borne encephalit (TBE), Avrupa‟dan Asya‟ya kadar birçok ülkede görülen ve insanların merkezi sinir sistemini etkileyen önemli viral enfeksiyon hastalıklarından biridir. Enfeksiyon, farklı zamanlarada değiĢik isimlerle anılmıĢtır. Frühsommermeningoenzephalitis, Western subtype (FSME), Kumlinge‟s disease, Western subtype (Central European encephalitis), ve Russian Spring and Summer Encephalisitis, Eastern subtype (RSSE) olarakta adlandırılan enfeksiyon son zamanlarda TBE olarak isimlendirilmektedir (Gritsun ve ark., 2003).
Kene kökenli hastalıklar kenelerle taĢınan enfeksiyon hastaklıklarıdır. Keneler riketsiyal, spiroketal, bakteriyal ve parazitik hastalıkların vektörü olan kan emen parazitlerdir. Tick-borne encephalit (TBE), Avrupa‟dan Asya‟ya kadar birçok ülkede görülen ve insanların merkezi sinir sistemini etkileyen kene ile bulaĢan önemli bir viral enfeksiyonel hastalıktır. TBE virüsleri (TBEV), doğadaki yaĢam döngüsü keneler ile omurgalılar arasında gerçekleĢir. Kan emici keneler omurgalı konaklardan
xi
beslenme sırasında aldıkları virüsle enfekte olurlar ve yaĢamları boyunca enfekte kalarak virüsü taĢırlar (Süss 1992). Doğada özellikle Avrasya bölgesinde Ixodes ricinus, Ixodes persulcatus, Haemaphysalis concinna türü kenelerle taĢınırlar. Bu kene türleri ülkemizde de bulunmaktadır (Ozkan ve ark., 1987). Keneler haricinde Apodemus cinsi fareler virüsün en belirgin taĢıyıcı konakları olarak bildirilmiĢtir. Ġnsan ise tıpkı dana, keçi, koyun, geyik, kuğu gibi diğer büyük omurgalılarla birlikte yanlıĢlıkla konak olabilmektedir.
Diğer ülkelerin aksine, ülkemizde TBEV ile ilgili ve özellikle keneleri ihtiva eden çalıĢmalar çok sınırlıdır. Ülkemizde özellikle Karadeniz bölgesinde TBEV bulaĢmasına sebep olabilecek kene türlerinin bulunması bu virüsün de kenelerle bulaĢma ihtimalini güçlendirmektedir. Avrupa ülkelerinde aĢılama proğramlarında bulunmasına rağmen, ülkemizde bu hastalık çoğunlukla asemptomatik seyretmesi ve düĢük mortaliteye sahip olması nedeniyle fazla dikkatle önemsenmemektedir. Bu çalıĢmada özellikle Orta Karadeniz Bölgesi‟nde yer alan Tokat ve çevresindeki illerde toplanan kenelerde TBEV varlığı moleküler yöntemlerle belirlenerek kenelerin TBE hastalık yayma potansiyelleri ortaya çıkartılması amaçlanmıĢtır.
1.1. Tarihçe
Enfeksiyon klinik olarak ilk kez 1931 yılında Avusturyalı Schneider tarafından bildirilmiĢ, 1937 yılında Rus Lev Zilber kene ısırması ile iliĢkili akut ensefalitis olgularını, 1947 yılında da Rusya‟dan Pavlovsky kene ve insanlar arasındaki zoonotik bulaĢmayı tanımlamıĢtır. Bu hastalığa, kene ile bulaĢan kene kökenli ensefalit virüsünün (TBEV) yol açtığı ise 1937 yılında Zilber tarafından bulunmuĢtur (Dumpis ve Crook, 1999).
1.2. Kene Kökenli Ensefalit Hastalığı’nın Dünya’da ve Türkiye’ki Epidemileri 1.2.1. Dünyada’ki Epidemileri
TBEV enfeksiyonu Avusturya, Beyaz Rusya, Bosna, Hırvatistan, Çin, Çek Cumhuriyeti, Danimarka, Estonya, Finlandiya, Fransa, Almanya, Yunanistan,
xii
Ġtalya, Japonya, Macaristan, Kazakistan, Letonya, Litvanya, Norveç, Polonya, Romanya, Rusya, Sırbistan, Slovak Cumhuriyeti, Slovenya, Ġsveç, Ġsviçre ve Ukrayna gibi birçok ülkede görülmüĢ ve virüs serolojik olarak tanımlanmıĢtır. Çizelge 1.1‟de bazı ülkelerdeki TBE epidemileri verilmiĢtir (Süss, 2003). Avusturya TBE‟in en çok görüldüğü ülkelerden biri olup, 2003 yılında 87 TBE vakası bildirmiĢtir (insidans:100.000‟de 1.9). Kene kaynaklı ensefalit vakaları daha çok Avusturya‟nın güneyinde görülmektedir. Bütün bu vakalar aĢılanmayan veya bildirilen aĢı takvimine uymayan kiĢilerden oluĢmaktadır. Geçen 5 yılda aĢılanma oranı %79‟dan %87‟ye çıkmıĢtır. AĢılanma oranı küçük çocuklarda ve 65 yaĢ üstü grupta %70‟lerde kalmıĢtır. YaĢlılardaki bu düĢük aĢılanma oranı Avusturya‟daki TBE‟ e karĢı mücadeleyi zorlaĢtırmaktadır (Kunz, 2003). Finlandiya‟da 1990' lı yıllarda ve 2001 yılında kene kaynaklı ensefalit vakaları bildirilmiĢtir. 2001 yılında vaka sayısı yıllık 40‟ın üzerine ulaĢmıĢtır.
TBE Almanya‟da da görülen bir hastalıktır. 2003‟de 276 vaka bildirilmiĢtir. Bu vakalar özellikle Almanya‟nın güneyinde Baden-Württemberg (%42) ve Bavaria‟da (%38) görülmüĢtür. Almanya TBE riski açısından üç bölgeye ayrılmıĢtır. Bir bölgede 1984-2003 yılları arasındaki 5 yıllık periyotta en az 25 TBE vakası varsa “yüksek riskli alan”, bir yılda iki veya daha az vaka ya da 1984-2003 yılları arasındaki 5 yıllık periyotta 5 veya daha az vaka varsa “riskli alan” olarak sınıflandırılmıĢtır. AĢılanmamıĢ orman iĢçilerinde yapılan çalıĢmalarda kene kaynaklı ensefalit seroprevelansının yüksekliğine dayanılarak bazı bölgeler endemik olarak kabul edilmiĢtir. 2003 yılında üç yeni riskli alan tanımlanmıĢtır. Keneyle temas riski yüksek olan ve riskli alanlarda yaĢayan kiĢilere aĢılama önerilmektedir (Roggendorf, 1996).
Macaristan‟da 1977‟den beri TBE bildirimi zorunludur ve tüm veriler “National Center for Epidemiology” tarafından toplanmaktadır. Aseptik menenjit ve ensefalitli hastaların TBE için tek tanı laboratuvarı olan merkezin viroloji bölümünde 1977‟den beri düzenli olarak test edilmektedir. 1977-1996 yılları arasında ortalama yıllık insidans 2.5/100.000 (range 1.8-3.8) olup 1981-1990 yılları arasında en yüksek düzeyde saptanmıĢtır. 1997‟den 2000‟e kadar tanı konulan TBE vakalarında önemli bir düĢüĢ görülmüĢ, 2000‟de insidans 100.000‟de 0.5 olmuĢtur. 2001‟den itibaren
xiii
insidansda tekrar artıĢ görülmüĢtür. Son 3 yılda yıllık ortalama rapor edilen vaka sayısı, 63‟dür. Yüksek risk grubundakiler (çiftçi, orman iĢçileri vb.) için aĢılama yapılmaktadır.
Norveç‟te TBE de dahil bütün ensefalit vakalarının bildirimi zorunludur. 2003‟de bir vaka bildirilmiĢke, Norveç‟te toplam 8 vaka rapor edilmiĢtir. Bir sağlık merkezinde düzenli takip edilen hastalar arasında yapılan küçük ölçekli bir seroprevalans çalıĢmasında %24 oranında TBE virus antikorları saptanmıĢtır. Norveç‟teki düĢük insidansdan dolayı ülkelerarası yayılıma karĢı aĢılama son zamanlarda tavsiye edilmiĢtir (Scarpaas, 2004). TBE Polonya‟ da 30 yıldan beri endemiktir ve bildirimi yapılmıĢtır.
1933‟ ten beri ülkede rapor edilen vaka sayısı 100 ile 350 arasındadır. 2002 yılında bu sayı 126 (insidans 100.000‟de 0.33) ve 2003 yılında 339 (insidans 100.000‟de 0.89)dur. Vakaların %8‟i Polonya‟nın Litvanya ve Belarus‟a komĢu iki güney batı ilinde gözlemlenmiĢtir. Polonya‟nın Çek Cumhuriyeti‟ne komĢu olan kuzey doğu bölgeleri bu hastalığın ikincil merkezidir.
Çizelge 1.1 2001-2003 Yılları arasında çeĢitli ülkelerde TBE‟li vaka sayısı ve insidansı (Süss, 2003).
Ülke Yıl
Rapor edilen vaka (S) Ġnsidans (100.000) Avusturya 2003 87 1.09 Çek Cumhuriyeti 2003 - 5.9 Danimarka - - - Finlandiya 2001 >40 - Almanya 2003 276 - Macaristan 2001-2003 63 - Litvanya 2003 - 15.7 Letonca 2003 763 22
xiv
Norveç 2003 1 -
Polonya 2003 339 0.89
TBE‟nin Slovakya‟da bildirimi zorunludur. Son on yılda rapor edilen vaka sayısı her yıl 54 ile 101 arasındadır. 2002‟de 62 vaka (insidansı 100 000‟de 1.15) ve 2003‟de 74 vaka (insidansı 100 000‟de 1.38) rapor edilmiĢtir. Rapor edilen bazı vakalar çiğ olarak tüketilen keçi ve koyun sütünden (ev yapımı) kaynaklanmıĢtır (Gresikova, 1968). TBE ve Lyme hastalıkları, Slovenya‟nın güneyinde endemik ve bildirimi yapılan hastalıklardır. 2003 yılında 272 vaka rapor edilmiĢtir (insidansı 100 000‟de 13.6). 2002 yılında (262 vaka) ve 2001 yılında (260 vaka) rapor edilen vaka sayıları yaklaĢık olarak aynıdır. TBE Ġsveç‟te isteğe bağlı olarak laboratuvar bildirimine dahil olan bir enfeksiyon hastalığıdır. 1980‟lerin sonunda ve 1990‟ların baĢında yıllık yaklaĢık 50-70 kadar vaka rapor edilmiĢtir. 2003 yılında 75‟i erkek, 32‟si kadın 107 TBE vakası bildirilmiĢtir. Endemik bölgelerde yaĢayanlar veya buraları ziyarete gidenler gibi yüksek risk grubuna aĢılama, tavsiye edilir (Gustawson, 1993).
TBE virüsü (kenelerde ve omurgalı konaklarda) tropik olmayan Avrupa orman kuĢaklarının tüm güney kısmında, Batıda Alsae – Lorraine de ve doğuda Çin‟in kuzey ve güneye ait bölgelerinde dağılım göstermektedir (ġekil1.1). 1988‟de Japonya‟da izole edilmiĢ endemik bir virüs Hokkoida‟da belirlenmiĢtir. Norveç ve Ġsveç‟in güneye ait kısmında bilinen risk bölgelerine ek olarak yeni risk bölgeleri oluĢtuğu bildirilmiĢtir (Scarpaas, 2004).
xv
Şekil 1.1 Kene kökenli ensefalit hastalığının Dünya‟daki yayılımı (Takeda, 2004).
TBE Uluslar arası bilimsel çalıĢma grub(ISW TBE), TBE hastalığının Avrupa‟ da bir sağlık sorunu olduğu bildirilmiĢtir (Kunze, 2006). TBE insidansının, son yıllarda Avusturya hariç hemen hemen TBE riskli tüm Avrupa ülkelerinde arttığı ve bunun sebebinin küresel ısınmaya bağlı olarak değiĢen kene biyolojisi olduğu düĢünülmektedir. TBE endemik bölgelere artan seyehat, seyehat sezonunun kene aktivitesinin yüksek olduğu periyoda uyması, koruyucu giysilerin kullanılmaması ve aĢılanmama neticesinde TBE vakalarıda son zamanlarda artıĢ rapor edilmiĢtir. Çizelge1.2‟de görüldüğü kadarıyla özellikle Almanya, Güney Kore, Çek Cumhuriyeti, Ġsveç, Ġsviçre de hastalık vakalarında artıĢ görülmüĢtür (Kim ve ark., 2009).
Çizelge 1.2 2005-2009 yılları arasında TBE hastalık sıklığının arttığı ülkeler (Kim ve ark., 2009)
Ülke Prevalans (%)
xvi
Almanya 12-35
Güney Kore 14-25
Ġsveç 10-22
Ġsviçre 10- 18
TBE hastalığı artan ülkelerde kene aktivitesi ilkbahar ve sonbahar aylarında olmak üzere 2 mevsimsel zirvesi göstermektedir ve TBE klinik vakaları özellikle mevsimsel kene aktivitesinin yaklaĢık 4 haftasında ortaya çıkmaktadır (ġekil1.2).
Şekil 1.2 Mevsimsel kene aktivitesi ile TBE insidansı arasındaki iliĢki (Klaus, 2008).
1.2.2. Türkiye’de TBE Epidemileri
Diğer ülkelerin aksine, ülkemizde TBEV ile ilgili ve özellikle keneleri ihtiva eden çalıĢmalar çok sınırlıdır. Ülkemizde özellikle Karadeniz bölgesinde TBEV bulaĢmasına sebep olabilecek kene türlerinin bulunması bu virüsün de kenelerle bulaĢma ihtimalini güçlendirmektedir. Avrupa ülkelerinde aĢılama proğramlarında bulunmasına rağmen, ülkemizde bu hastalık çoğunlukla asemptomatik seyretmesi ve
xvii
düĢük mortaliteye sahip olması nedeniyle fazla dikkat önemsenmemektedir. Hastalığın kalıcı ve yıllar sonradan çıkan etkileri insanlarda değiĢik sağlık sorunlarının oluĢmasına ve hayat kalitesinin düĢmesine neden olduğu göz ardı edilmektedir.
Türkiye‟de TBE virüsü seroprevalansı ile ilgili çeĢitli veriler bulunmakla birlikte bunların çoğundaki seropozitiflikler viral nötralizasyon ile doğrulanmamıĢtır. Bununla birlikte özellikle Türkiye‟nin Güneydoğu Anadolu bölgesinde yapılan bir seroprevalans çalıĢmasında olguların % 9.5‟ğunda TBE virus seropozitifliği viral nötralizasyon yöntemi ile doğrulanmıĢtır (Ergunay ve ark., 2007). Türkiye‟de KKKA‟nin endemik olduğu bir bölgede, 39 KKKA Ģüpheli serumun birinin TBEV IgM pozitif olduğu bulunmuĢtur (Eser ve ark., 2007).
1.3. TBE Virüsünün Yapısı, Özellikleri ve Taşınımı 1.3.1. TBE Virüsünün Yapısı
TBE virüsü tek zincirli pozitif RNA genomuna sahip, zarflı virüslerdir. Ortalama 50 nanometre (nm) çapında virionları vardır. 11 kb büyüklüğünde bir RNA olan genomu tek bir büyük açık okunan bölge içerir (ġekil 1.4). Açık okunan bölge yaklaĢık 3400 amino asit büyüklüğünde bir polipeptidi kodlar (Heinz and Collet, 2000).. Bu polipeptid konak hücresi ve viral proteaz enzimleri tarafından çeĢitli bölgelerden kesilerek iĢlemlendikten sonra virüsün yapısal (C, E ve M) ve yapısal olmayan proteinleri (NA1, NS2A,NS2B, NS3, NS4A, NS4B ve NS5) açığa çıkar. E protein, hücre reseptörüne bağlanma, füzyon ve nötralizan antikor yanıtı için önemlidir (Chambers,1990). Açık okunan bölgenin 3' ve 5' uçlarında virüsün genom replikasyonu, translasyon ve paketlenmesin de önemli rol oynayan özelleĢmiĢ yapılarını içeren kodlamayan bölgeler bulunur (ġekil1.5). Bu virüsler Uluslararası Virüs Taksonomi Komitesinin sınıflandırma tablosunda Flaviviridae Ailesinin Flavivirus cinsi içerisinde tek tür olarak sınıflandırılmıĢ (ġekil 1.3)ve Avrupa, Sibirya ve Uzak Doğu olmak üzere üç alt tipe ayrılmıĢtır (Heinz and Collet, 2000).
xviii 8 Reoviridae •dsRNA segmentli,zarfsız •Coltivirüs Kene vektörü
Colarado kene ateşi
Arbovirüs
Bunyaviridae
• Zarflı
• 3 helikal nükleotid • Negatif sens, segmentli RNA
Grup A
Togaviridae ailesi
• Zarflı • İkosohedral • ss+RNA
• Sitoplazmik membradan zarflı
Rubivirüs genusu
• Rubella
Alfavirüs genusu
• EEE
• WEE
Grup B Flaviviridae ailesiZarflı
• İkosohedral • ss+RNA
•Sitoplazmik membrandan zarflı
Flavivirüs genusu
•Denqueateşi
• Japon ensefalit virüsü • St Louis Ensefaliti •Batı Nil Virüs
Bunyavirüs genusu • Kalifornia Ensefalit Grubu La Crosse Virüs • Toscana virus Arbovirus ailesi
TBE
TBE ETİYOLOJİSİŞekil 1.3 Arbovirüs ailesi (Heinz, 1999).
Şekil 1.4 TBE Virüsü‟nün yapısı ve elektron mikroskoptaki görünümü (Chambers,1990).
xix
Şeki1 1.5 TBE Virüsü‟nün yapısal ve yapısal olmayan proteinleri (Heinz, 2000).
1.3.1.1. Flaviviridae Ailesindeki Virüslerin Replikasyonu
Viral glikoproteinlerin, duyarlı hücrelerdeki reseptör bölgelerini tanımaktan sorumlu olduğuna inanılmaktadır. Bu hücrelerdeki reseptörlere bağlanan virüsler, endositoz ile hücre içine alınırlar. Sitoplazmaya alınan virüsler, replike olduktan sonra tomurcuklanarak endoplazmikretikulumdan ayrılırlar ve Golgi bölgesinde sitoplazmik veziküller içerisine alınırlar. Bu bölgeden de füzyon iĢlemi ile virüs en dıĢtaki zarını da alarak hücre dıĢına çıkar (ġekil 1.6) (Heinz,1991).
1.3.2. TBE Virüsünün Özellikleri
TBEV, lipid zarfından dolayı organik solventler ve deterjanlarla inaktif olur. Zarf, çıplak nükleokapsiti ve hücresel nükleazdan da genomu korur. RNA‟nın farelere intracerebral injeksiyonu ile enfeksiyöz olduğu gösterilmiĢtir. Flavivirusların infektivite ve viral hemaglutininleri pH 8.4-8.8 arasında stabil olmasına karĢın, TBEV geniĢ bir pH‟da (pH 1.42-9.19) canlı kalabilmektedir. Virusun E proteini asidik pH ile infektivitesini kaybetse de, virionlar süt ve mide sıvısında infektivitesini korurlar, bu durum TBEV‟nin oral yolla da infektivitesini açıklamaktadır. TBEV, 50°C‟de 10 dakikada infektivitesinin %50‟sini kaybederler, tam bir inaktivasyon için 56°C‟de 30 dak. yeterlidir. Sıvı arerosol süspansiyonlardaki virusler oda ısısı %23-80 nem oranında 6 saat, dondurularak kurutulduğunda ise yıllarca stabil kalırlar. Pasterizasyon, Ultraviole ve gama ıĢınları, %3-8‟lik formaldehid, %2‟lik
xx
gluteraldehid, %2-3‟lük hidrojen peroksit, 500-5000 ppm chlorine, alkol, %1‟lik iyot ve fenol ile inaktive olurlar(Rey, 1995).
Şekil 1.6 Flaviviridae ailesindeki virüslerin replikasyonu (Anonim, 2007).
1.3.3. Kene Kökenli Ensefalit Virüsünün Taşınımı
TBE virüsleri doğadaki yaĢam döngüsü keneler ile omurgalılar arasında gerçekleĢir. Kan emici keneler omurgalı konaklardan beslenme sırasında aldıkları virüsle enfekte olurlar ve yaĢamları boyunca enfekte kalarak virüsü taĢırlar (Süss 1992). Doğada özellikle Avrasya bölgesinde Ixodes ricinus, Ixodes persulcatus, Haemaphysalis concinna türü kenelerle taĢınırlar (ġekil 1.7). Bu kene türleri ülkemizde de bulunmaktadır (Ozkan ve ark., 1987). Keneler haricinde Apodemus cinsi fareler virüsün en belirgin taĢıyıcı konakları olarak bildirilmiĢtir. Ġnsan ise tıpkı dana, keçi, koyun, geyik, kuğu gibi diğer büyük omurgalılarla birlikte yanlıĢlıkla konak olabilmektedir (Çizelge 1.3).
Ixodes sp. (diĢi) Haemaphysalis sp. Ixodes ricinius
xxi
Şekil 1.7. TBE virüsünü taĢıyan bazı kene türleri (Anonim,2006).
Çizelge 1.3. TBE virüsünü kene dıĢında bulaĢtıran diğer hayvanlar (Bodemann, 2000).
Konak Sıklık (%)
Sarı boyunlu tarla faresi 47.9 Kırmızı astarlı köstebek 29.4 Tilki 18.0 Geyik 83 Köpek 2.0- 5.6 Keçi 44.0 Sığır 35.5-91.0
TBE virüsü insanlara veya larva, nimf ve yetiĢkin keneler tarafından diğer konaklara taĢınır. Sıcaklık kene kökenli hastalık dinamiklerinin belirleyicisidir. Kene aktivitesi Mart-Nisan ayında toprak sıcaklığı 5-7 oC derece arttığında baĢlar ve ortalama hava sıcaklığı Ekim veya Kasım‟da yaklaĢık aynı değerde azaldığı zamanda yılın sonlarına doğru sonlanır. Kene aktivitisi aynı zamanda toprak nemliliği ve iliĢkili nemlilik üzerine dayanır. Ixodes ricinius Avrupada TBEV bulaĢında rol oynayan baĢlıca kene türü olup TBEV‟nün yayılması için esas sorumludur (batı alt tipi). TBE virüsünün Uzak Doğu alt tipi Ural Dağlarının ötesinde bulunmuĢtur ve temel vektörü Ixodes persulcatus‟ tur (Çizelge 1.4).
1.4. TBE Hastalığında Enfeksiyon Oluşumu, Klinik Yol, Tanısı, Tedavisi ve Koruma Yolları
xxii
Enfekteli kenenin insanı ısırmasından sonra, virüs kene ısırığının olduğu bölgedeki dermal hücrelerde replike olur. Kenenin salyası ile immün sistemin baskılanması nedeniyle virüs nötrofilik granülositlerin yanında Langerhans hücrelerinde de replike olur. TBE virüsü replikasyon için sadece Langerhans hücrelerini ve granülositleri kullanmaz, aynı zamanda lenf kapilerleri yolu ile bölgesel lenf bezlerine ulaĢır. Böylece virüs lenfatik sistem yolu ile yayılır ve birkaç gün sonra, kan dolaĢımı (viremi) safhasına ulaĢır. Daha sonra diğer duyarlı organ ve dokulara istila eder, özellikle retiküloendotelyal sistemde (timus, dalak, karaciğer) etkili olarak replike olur. Bu basamaktan sonra virüs merkezi sinir sistemine ulaĢmak için, beyin kapiler endotelyum hücrelerini enfekte eder. Beyin kapiler endotelyum hücrelerinin enfekte olması yüksek virüs miktarına bağlıdır. Endotel hücreler istila edildikten sonra virüs replike olur ve beyin dokusu içerisinde beyindeki kapiler endotelyum hücrelerinden merkezi sinir sistemine geçer. TBE virüsü ayrıca sinir fibrilleri boyunca da yayılabilir. Bu durum özellikle laboratuar enfeksiyonlarında havadan virüs alındığında görülebilir.
Çizelge 1.4 Kene kökenli ensefalit virüsü suşlarının görüldüğü kene türleri.
TBEV suşu Taşıyıcı Kene Türü Referans
Avrupa Ixodes ricinius Ixodes nipponensis Haemaphysalis concinna Haemaphysalis longicornis Haemahysalis flava
(Kim ve ark., 2009)
Uzak Doğu Ixodes persulcatus Haemaphysalis japonica
xxiii Sibiryan Ixodes persulcatus
Haemaphysalis concinna
(Kunze, 2006)
1.4.2. Klinik Yol ve Hastalığın Ortaya Çıkması
Hastalık dört periyodluk bir seyir gösterir:
İnkübasyon Periyodu: Çoğu vakalarda ilk basamağın saldırı öncesi, inkübasyon periyodu 7-14 gün veya 2-28 gün sürebilen periyodudur.
İlk Basamak: Ortalama ilk basamak 2-4 gün sürer (1-8 gün devam süresi nadir olarak incelenir) ve viremik fazla karĢılaĢır. Karakteristik olmayan grip benzeri semptomları ve çoğu vakada 38 oC bir artıĢla iliĢkilidir. Bazen istisna olarak yüksek baĢ sıcaklıklar oluĢabilir.
Aseptomatik Aralık: Ġlk basamak yaklaĢık 8 gün süren aseptomatik aralık tarafından takip edilir. Bu periyod esnasında hastalar genelde septomsuzdur.
İkinci Faz: Enfeksiyondan sonra yaklaĢık 2-4 hafta içinde hastaların üçte birinde hastalığın ikinci basamağı görülebilir ki, bu faz merkezi sinir sistemi (CNS) ile iliĢkisi tarafından karakterize edilir. Klinik resmi meninjit, ensefalit, meningoenfalomyelitis, veya meningoensefaloradikulustur. Avrupa‟da yetiĢkin hastalarda ölüm oranı yaklaĢık % 1‟dir ve meningoensefalit, meningoensefalomyelitis ve otonom sinir sisteminin disfonksiyonu dahil TBE‟li hastalarda yaklaĢık % 3‟e çıkar. (Radda, 1983).
Meninjitin asıl septomları ciddi baĢ ağrısı, mide bulantısı, kusma, ense sertliği, ve yüksek ateĢtir. Ensefalit, bilinçsizlik, uyuĢukluktan derin uyku haline değiĢen ve bazı nadir durumlarda, koma gibi rahatsızlıklarla karakterize edilir. Hastalığın ileriki safhalarında vücutta bir takım değiĢiklikler görülebilir. Bunlardan bazıları karakterize edilmiĢtir. Özellikle merkezi sinir sistemini etkileyecek septomları vardır. Beyin bariyerini geçtikten sonra omurilik ve ensefalit sonrası septomlar olası. Diğer septomları
xxiv
uykusuzluk, kolların ve yüz kasının aĢırı hareketliliği, dil titremesi, kasılma, baĢ dönmesi, konuĢma bozukluklarıdır. Kranial (kafatasına ait) sinirleri içerdiğinde, esas olarak göz merceği, yüz kısmı ve boğaz kasları etkilenir. Bazı durumlarda nöropsiyatrik septomlar hakim olur ve hastalar psikiyatrik gözetime yollanır. TBE‟li nörolojik anormalliklerin en büyük uzantısı hastalığın ortaya çıkan meningoensefalomyelitikte bulunur ki bu durum öncelikle ekstremitelerin zayıf paralizi tarafından karakterize edilir. Paraliz genellikle üst kolları, omuz eklem miyelitini ve baĢ kaslarını etkiler (Mickiene, 2005).
1.4.3. TBE Hastalığının Tanısı
TBE virüsünün tanısı için değişik yöntemler kullanılmaktadır. Bunlardan bazıları aşağıda özetlenmiştir (Haglund, 2000).
BOS (Beyin omurilik sıvısı) incelemesi: BOS‟ta orta derecede pleositozis (100-300 hücre/μl), segmentli granülositler % 60-70, lenfositler %30-40 görülmektedir. Kan – BOS bariyeri orta derecede bozulmuĢ olup, BOS / Serum albumin oranı artmıĢtır ve IgM ön planda olmak üzere intratekal antikor üretimi artmıĢtır. Nadiren ölümcül vakalarda beyin dokusunda elektron mikroskobu ile virus gösterilebilmiĢtir.
Hücre kültüründe izolasyon: TBEV, hastalara ait serum ve / veya BOS örneklerinin memeli hücre kültürü ortamlarına (Vero, BHK-21, PK, RH, 293 veya A549 hücreleri) veya fare beynine inokülasyonundan sonra yapılabilmektedir.
Serolojik tanı: 1980‟lerden önce, tanıda kompleman fiksasyonu veya hemaglütinasyon inhibisyon testi kullanılmıĢtır. Hızlı tanı için, hemaglütinasyon inhibisyon testinde 2-merkaptoetanol ile muamele sonrası TBEV spesifik IgM antikorları saptanabilir. Bu testte erken akut dönem serumunda 0.05M 2-ME ile muameleden önce ve sonra serum Hemaglutinasyon inhibisyonu (HI) ile test edilmelidir (Allwinn, 2002).
Günümüzde, TBE tanısında Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) serum ve BOS‟da serolojik tanı için oldukça iyi ve kullanıĢlı bir yöntemdir. “Capture”
xxv
ELISA yöntemiyle, romatoid faktör veya heterofil antikorların interferansı nedeniyle oluĢabilecek yalancı pozitifliklerden uzaklaĢılarak TBEV-IgM çalıĢılabilmektedir. ELISA yöntemi ile IgM‟in gösterilmesi oldukça güvenilir bir serolojik testtir. Ancak, erken dönemde antikoru saptayamaması ile aĢı sonrası ve doğal vakalarda 10 aya kadar devam eden IgM antikor varlığı bazen tanıda sorun oluĢturabilmektedir. Bu nedenle TBEV spesifik IgG ELISA testi veya seronötralizasyon testleri ile konfirmasyon yapılması önerilmektedir (Sonnenberg, 2004).
Moleküler tanı: Hastalığın ilk fazı boyunca, hem kan hem de BOS örneğinden RT-PCR tekniği ile TBEV genomu saptanabilmektedir. Buna rağmen, bu teknikler pratikte tanıda minör derecede önemlidir, çünkü hastaların çoğu hastalığın ikinci fazında hekim muayenesine baĢvurmaktadır ve bu dönemde zaten kan ve BOS‟tan virüs temizlenmiĢ olmaktadır. Bu nedenle, RT-PCR tekniği TBE‟nin laboratuar tanısında hastalığın birinci faz dönemi hariç kullanılıĢlı değildir. Yeni real-time RT-PCR yöntemleri TBEV tanısında daha baĢarılıdır. Omurgalılarda vireminin araĢtırılması ve kenelerde virüs prevalansının epidemiyolojik surveyinde TBEV RNA‟sının RT-PCR ile taranması ile baĢarılı sonuçlar alınmıĢtır (ġekil 1.8). Ancak, TBE‟nin rutin tanısında virus izolasyonu ve moleküler yöntemlerin önemli bir rolü yoktur, genellikle ikinci fazın baĢlamasıyla beraber spesifik antikorların saptanmasıyla tanı konmaktadır (Puchhammer-Stock and Kunz, 1995).
xxvi 1.4.4. TBE Hastalığından Korunma Yolları
Genel olarak diğer kene kökenli hastalıklarda uyulması gereken korunma yolları (Kenelerle mücadele, keneli alanlara girmeme, kene kovucu veya ilaçlı elbise kullanma, aĢılanma) burada da gecerlidir.
1.4.4.1. TBE Aşısı
TBE hastalığını önlemede en etkili yol aktif aĢılamadır. TBE için halen çok sayıda aĢı bulunmakta ve birçok ülkede rutin, bazı ülkelerde ise isteğe bağlı kullanılmaktadır. Örneğin, Avrupada Baxter firması tarafından TBE‟ye karĢı kullanılmak üzere formaldehitle inaktive edilmiĢ sükroz gradienti ile saflaĢtırılmıĢ TBEV antijeni içeren FSME-IMMUN adlı bir aĢı yoğun olarak kullanılmaktadır (Baxter 2007). Bu aĢının içeriği Çizelgede verilmiĢtir (Kunz 2003). Bu aĢı üç dozda kullanılmakta ve yaĢlara göre farklı dozda uygulanmaktadır. Avusturya‟da özellikle bu aĢının uygulanmasıyla TBEV vakalarında çarpıcı bir Ģekilde azaldığı ispat edilmiĢtir. Diğer bir Ģekilde ticari olarak elde edilen aĢı Encepur (Behringwerke AG, Marburg, Almanya ) piyasaya sunulmuĢtur. Bu aĢı ile Almanya‟da TBEV‟ ünün yüksek riskli bölgelerinde yaĢayan bebek ve çocuklarda yaygın bir Ģekilde kullanılmıĢtır. Üçüncü olarak Rusya‟da üretilerek kullanılan aĢı da rapor edilmiĢtir. Endemik TBE bölgelerine ziyaret eden ve kene ısırma riskinde olan kiĢilere TBE aĢısı alması önerilir (Baxter 2007).
Çizelge 1.5 TBE aĢısının içeriği (Kunz, 2003). FSME-İmmün 0.5 ml
FSME-İmmün0.25ml (Genç)
Aktif madde: inaktive edilmiĢ Formaldehit, saflaĢtırılmıĢ Sukroz gradienti, TBE virüs
2.4 µg (hedef)
2- 2.75 µg (aralık)
1.2 µg (hedef)
xxvii antijeni Adjuvant: sulandırılmıĢ Alüminyum hidroksit 0.35 mg Al 0.17 mg Al Tampon sistem: Sodyum klorit 3.45 mg 1.725 mg
Sukroz Max. 15 mg Max. 7.5 mg
Formaldehit Max. 5 µg Max. 2.5 µg
Protamin sülfat Az miktar Az miktar
Neomisin ve gentamisin Az miktar Az miktar
Dengeleyici 0.5 mg 0.25 mg
Enjeksiyon için su 0.5 ml 0.25 ml
2. MATERYAL ve YÖNTEM 2.1. Materyal
ÇalıĢmada, 2007-2008 yılları arasında Tokat, ve çevresinden yapılan arazi çalıĢmaları sonucunda ve sağlık kuruluĢlarından kene ısırığı olan insanlardan toplam 690 kene örneği toplanmıĢ ve TBEV varlığı için test edilene kadar -80o
C de muhafaza edilmiĢtir. Ayrıca 2010 yılı Temmuz-Ağustos ayları arasında Ordu Merkez ve Fatsa ilçelerinde insanlardan toplanan 228 kene (özellikle Ixodes ricinius) bu çalıĢmada kullanılmıĢtır (Çizelge 2.1).
Çizelge 2.1 Bu çalıĢmada TBEV varlğını test etmek için toplanan kene cinsleri ve sayıları.
Keneler Tokat- Amasya Ġlleri Ordu-Fatsa Bölgesi
Hyalomma sp 630 _
Haemaphysalis sp 20 _
Ixodes sp 40 228
TOPLAM 690 228
Tokat ve Amasya ili için 630 adet Hyalomma cinsine kene örneği, 40 adet Ixodes cinsi kene örneği ve 20 adet Haemaphysalis cinsi kene örneği kullanılarak
xxviii
10 keneden oluĢan 69 adet kene havuzu oluĢturulmuĢtur. Ayrıca Ordu merkez ve Fatsa ilçelerinden 205 adet ergin Ixodes ricinus örneği, 20 adet Ixodes cinsi nimf ve 3 adet larva 5‟li gruplar halinde gruplanarak 46 adet kene havuzu oluĢturulmuĢtur. Bu kene havuzları viral RNA izolasyonu için kullanılmıĢtır. Bazı örnekler (120) tek tek test edilmiĢtir. Her örnek grubu en az 3 kez test edilmiĢtir.
2.1.1. Kullanılan Kimyasal Madde ve Malzemeler
Agaroz, Etidium bromür, Bromophenol blue (Sigma), Etanol, Glasiyal asetik asit (Merck), Sodyum asetat, HCI (Carlo Erba), Tris, EDTA, Gliserol, Xylene cyanol, Ġsopropanol (Amresco), Sıvı azot, Moleküler ağırlık standartı (Vivantis), TBENC5'R-OF, TBEN5'CR-OR, TBENS4B-NS5-TBENC5'R-OF, TBENS4B-NS5-OR, TBENS4B-NS5-IF, TBENS4B-NS5-IR, TBE913F, TBE1739R, TBE1192F TBE1669R (Ġontek) primer seti, Viral RNA izolasyon kiti (Roche), RT-PCR kiti (Roche), Erlen, Beher, Cam ġiĢeler
(100 ml, 500 ml, 1000 ml‟ lik), Mezür, Bistüri, Forcep, Enjektör, Petri kapları (Isolab), Pipet uçları (Corning, Neptune, Eppendorf), Mikrosantrifüj ve PCR tüpleri (Axygen) ile diğer laboratuvar malzemeleri kullanıldı.
2.1.2. Cihazlar
Thermal cycler (Peqlab), Santrifüjler (Eppendorf, Hettich), UV transillüminatör (Syngene), Yatay elektroforez (Scie-plas), Güç kaynağı (Consort), Hassas terazi (Acculab), pH metre (Hanna), Otomatik pipetler (Eppendorf, Brand), Manyetik karıĢtırıcılar, Vorteks (Ika), Buz makinesi (Scotsman), Otoklav (Hiclave), Etüv (Memmert), Mikrodalga fırın (Arçelik), 4, -20 ve -80 oC‟deki buzdolapları (Uğur,
Arçelik, U410 premium), Fotoğraf makinesi (Sony) ve Saf su cihazları (Mes mp minipure, Millipore) kullanıldı.
2.1.3. Tampon ve Solüsyonların Hazırlanışı
xxix
16.81 g EDTA 90 ml H20 içerisinde manyetik karıĢtırıcı yardımı ile partiküller
tamamen çözününceye kadar karıĢtırıldı. pH:8.0‟e ayarlandıktan sonra hacim 100 ml.‟ye tamamlandı. Otoklavda 121 oC‟de 20 dk. steril edildikten sonra, +4 oC‟deki
buzdolyaplarında muhafaza edildi.
2.1.3.2. 50X Tris Asetat EDTA (TAE) Tamponu
242 g Tris, 57.1 ml Glasiyal asetik asit ve 100 ml 0.5 M EDTA (pH:8) manyetik karıĢtırıcı yardımı ile partüküller çözününceye kadar karıĢtırıldı. Hazırlanan çözeltinin pH‟ı Glasiyal asetik asitle 8.5‟e ayarlandı ve toplam hacim distile su iL‟ye tamamlandı. Steril edildikten sonra +4 oC‟deki buzdolaplarında muhafaza edildi.
2.1.3.3. 1X TE Tamponu
1.2 g 10 mM Tris HCI ile 0.37 g 1 mM EDTA, 900 ml distile su içerinde manyetik karıĢtırıcı yardımı ile çözüldü. pH:8‟e ayarlandıktan sonra hacim 1000 ml‟ye tamamlandı. Hazırlanan tampon steril edildikten sonra +4 oC‟deki buzdolaplarında muhafaza edildi.
2.1.3.4. 3M Sodyum Asetat Solüsyonu
41 g Sodyum asetat, 90 ml distile su içerisinde çözüldü. pH:5.0‟a ayarlandıktan sonra hacim 100 ml‟ye tamamlanır. Otoklavda steril edilerek +4 oC‟de muhafaza edildi.
2.1.3.5. Etidyum Bromür
10 mg Etidium bromür, 10 ml steril distile su içerinde hazırlandı ve 4 oC‟de muhafaza edildi.
xxx 2.1.3.6. 6X Bromophenol Blue
15 ml Gliserol, 0.25 g Bromophenol blue ile 0.25 g Xylene cyanol; 100 ml distile su içerisinde çözününceye kadar karıĢtırılarak hazırlandı.
2.1.3.7. Çalışmada Kullanılan Primerler
Çizelge 2.2 Bu çalıĢmada TBEV varlığını test etmek için kullanılan primerler (Melik, 2007, Ternovi 1999)
Primerler Sekans TBEV bölge (nt)
5'NCR-OF 5'NCR-OR 5'-AGATTTTCTTGCACGTGCAT-3' 5'-CTCTTTCGACACTCGTCGAGG-3' 1-20( +sense) 195-175(-sense) (195 bp) NS4B-NS5-OF NS4B-NS5-OR 5'-ATGAGTGGTGTGGTCAGGGGG-3' 5'-TGCATGCTGAACACGTCCATTCC-3' 7582-7601(+sense) 8072-8050(-sense) (490 bp) NS4B-NS5-IF NS4B-NS5-IR 5'-GGGGTTTTTGCCTCTTGGGC-3' 5'-CCCAGGCTTGTTACCATCTTTGG-3' 7611-7630(+sense) 8024-8002(-sense) (413 bp)
xxxi TBE1738R TBE1192F 5'-TGGCCACTTTTCAGGTGGTACTTGGTT CC-3' 5'-CAGAGTGATCGAGGCCTGGGGGYAA-3' 1709-1738(-sense) 1192-217(+sense) (546 bp) TBE1669R TBE913F 5'-AACACTCCAGTCTGGTCYCCTAGGTTGTA-3'
5'-TGC AAA TGC CAG GGA-3'
1640-1669(-sense)
913-928 (+sense) (756 bp)
2.2. Yöntem
2.2.1. Kene Dokularının Ayrılması
Keneler -80 °C‟den çıkarılarak petri kabı içine koyulduktan sonra, 400 µl RNAlater içinde steril bir bistüri yardımı ile boĢaltım açıklığının hemen üst kısmından enine olarak ikiye kesildi, bütün dokuları dıĢ iskelet kalacak Ģekilde dıĢarıya çıkarıldı. DıĢarı çıkarılan dokular enjektör yardımı ile toplanıp ependorf tüplerine alındı. Enjektörün iğnesinden geçirilen dokuların tamamen parçalanması sağlandı. OluĢan bu homojenat 14000 rpm‟de 5 dk. santrifüj edilerek süpernatantı pelletinden ayrıldı.
2.2.2. Viral RNA Ekstraksiyonu
Kenenin ayrılan dokularından viral RNA izolasyonu için Roche‟un „High Pure Viral RNA‟ kiti kullanılmıĢtır. Ġzolasyon, kit prosedürüne uygun olarak Ģu Ģekilde yapılmıĢtır:
1. Poly(A) carrier RNA içerisine 400 µl Elution Buffer, Inhibitor Removal Buffer‟a 20 ml, Wash Buffer‟a ise 40 ml etanol ilave edilerek solüsyonlar hazırlandı.
xxxii
2. 12 numune için, 5 ml Binding Buffer‟a (4.5 M guanidine-HCI, 50 mM Tris-HCI, %30 Triton X-100, pH: 6.6) 50µl carrier RNA eklendi. Akabinde filtreli kolonlara her bir numune için 200 µl serum ile 400 µl Binding Buffer+carrier RNA ilave edildi.
3. 8 000 x g‟de 15 s santrifüj edildi ve sonrasında collection tüpleri atılırak yeni tüpler kullanıldı.
4. Sonra, filtreli kolonlara 500 µl Inhibitor Removal Buffer (5 M guanidine-HCI, 20 mM Tris-guanidine-HCI, pH: 6.6) ilave edildi.
5. 8 000 x g‟de 1 dk. santrifüj edildi ve collection tüpleri atılarak yerlerine yeni tüpler yerleĢtirildi
6. Sonrasında her bir tüpe 450 µl Wash Buffer (20 mM NaCI, 2 mM Tris-HCI, pH: 7.5) eklendi ve 8 000 x g‟de 1 dk. santrifüj edildikten sonra collection tüpleri atılırak yeni tüpler yerleĢtirildi.
7. Tekrar 450 µl Wash Buffer eklenerek 8 000 x g‟ de 1 dk. santrifüj edildi. 8. Sonrasında 10 s kadar tekrar santrifüj yapıldıktan sonra collection tüpleri atıldı ve yerine eppendorf tüpleri yerleĢtirildi.
9. Filtreli kısıma 50 µl Elution Buffer (Nükleaz saf su) eklenerek, 8 000 x g‟de 1 dk. santrifüj edildi.
10. Son aĢamada ise, filtreli kolonlar atıldı ve eppendorf tüplerindeki ekstraksiyon ürünleri etiketlenerek -80 ° C„de saklandı.
2.2.3. One-Step Reverse Transkripsiyon Polimeraz Zincir Reaksiyonu (RT-PCR)
RNA ekstraksiyonu sonucunda elde edilen örnekler, Roche transcriptor one-step RT-PCR kiti kullanılarak, RT-PCR‟ı yapıldı. Kit içeriğine göre:
RNase free su (Vial 3) 13.5 µl 5X RT-PCR buffer (Vial 2) 5 µl
Upstream primer 1 µl Downstream primer 1 µl Transcriptor Enzim mix (Vial 1) 0.5 µl Templete RNA 4 µl
xxxiii
Pipetlendikten sonra numunelerin toplam hacmi 25 μl olacak sekilde hazırlanmıĢtır.
2.2.3.1. Thermal cycler’ın Program Ayarı
Thermal cycler‟ın programı; Denatürasyon için 94 °C‟de 2dk.‟ya, 50-60 °C‟de 15 s (annealing), 72 °C‟de 1dk.‟ya (extension) ve Final extension için ise 72 °C‟de 5 dk.‟ya ayarlandı.
2.2.4. Agaroz Jel Elektroforezi 2.2.4.1. Agaroz Jelin Hazırlanması
1 gr agaroz ve 5 ul etidyum bromid eklendikten sonra bir mikro dalga fırında jel haline getirildi. Agaroz jel eletroferez tankına döküldü ve jelin soğuyup katılaĢması beklendi. KatılaĢan jelin üzerine TAE tamponu döküldü, tarak çıkarıldı ve yükleme yapmak için jel hazır hale getirildi.
2.2.4.2. Örneklerin Agaroz Jele Yüklenmesi ve Yürütülmesi
PCR sonrasında elde edilen ürünler %1‟lik agaroz jel elektroferezi kullanılarak görüntülendi. Kısaca her bir tüpe 2 μl bromfenol mavisi (BFB) ile 5 μl DNA örneği eklenerek kısa süreli spin yapıldı. Ġlk kuyucuğa 2-4 μl DNA MW standardı diğerlerine de PCR ürünleri koyuldu. Güç kaynağı 100 ampere ayarlandı ve yaklaĢık 30 dakika koĢturuldu. Jeller jel dökümantasyon cihazında ultraviyole ıĢık altında görüntülendi ve jel görüntüleri bilgisayara kaydedildi
2.2.5. DNA Dizi Analizi
Jel elektroforezi sonucunda elde edilen Ģüpheli DNA bantları veren örneklere ait PCR ürünleri DNA dizisinin belirlenmesi için ilgili primerlerle birlikte REFGEN (Ankara) firmasına gönderilerek çift yönlü dizi analizi yaptırıldı. Elde edilen sekanslar NCBI BLAST proğramı kullanılarak bilinen viral sekanslarla karĢılaĢtırıldı.
xxxiv 3. BULGULAR
Bu çalıĢmada Tokat, Amasya, Ordu ve Fatsa bölgelerinden toplanan kenelerde kene kökenli ensefalit virüsünün varlığı RT-PCR yöntemiyle araĢtırılmıĢtır. ÇalıĢmamızda, Tokat, Amasya, Ordu ve Fatsa bölgelerinden toplanan toplam 918 kene örneği TBEV varlığı için RT-PCR yöntemiyle test edilmiĢtir.
3.1. Tokat ve Amasya Bölgesi Kenelerinde TBE Varlığı:
Bu çalıĢmada, 2007-2009 yılları arasında arazi çalıĢmaları sonucunda toplanmıĢ 690 kene örneği TBEV spesifik primerler setleri kullanılarak RT-PCR‟ı yapılmıĢtır. Test edilen kenelerden RT-PCR ürünleri pozitif bant veren 4 Ģüpheli örnek DNA dizi analizi yaptırılmıĢ ve bunlarında nonspesisfik bantlar olduğu anlaĢılmıĢtır (ġekil
xxxv
3.1.a). Dolayısyla RT-PCR sonuçlarına göre Tokat bölgesinde test edilen kene örneklerinde TBEV varlığı saptanamamıĢtır.
3.2. Ordu Merkez ve Fatsa Bölgesi Kenelerinde TBE Varlığı:
Bu çalıĢmada, 2010 yılı yaz aylarında Ordu Merkez ve Fatsa ilçelerinde insanlardan toplanan 228 adet Ixodes ricinus kene örneği TBEV spesifik primerler setleri kullanılarak RT-PCR ile test edilmiĢtir. Test edilen keneler arasında RT-PCR ürünleri pozitif bant veren 6 Ģüpheli örnek DNA dizi analizi yaptırılmıĢ ve fakat bunlarında nonspesisfik bantlar olduğu anlaĢılmıĢtır (ġekil 3.1.b). Sonuç olarak RT-PCR sonuçlarına göre Ordu ve Fatsa bölgesinde test edilen kene örneklerinde de TBEV varlığı saptanamamıĢtır.
a) STD K11 b. ) 500 bp 350 bp
xxxvi STD K39
Şekil 3.1 RT-PCR sonrası dizi analizine giden PCR ürününün agaroz jel elektroforezi (%1‟lik) yöntemi kullanarak görüntülenmesi a.) TBENS4B-NS5-IF ve-NS5-IR primer setleri b.) TBENS4B-NS5-OF ve TBE-NS4B-NS5-OR primer setleri kullanılmıĢtır.
4. TARTIŞMA ve SONUÇ
Ülkemizde en az 39 sert kene türü bulunmakta (Bursalı et al. 2011) ve bunların bir kısmının kene kökenli patojenleri taĢıdığı gösterilmiĢtir (Güner, 2003, Tekin et al. 2009). Örneğin Tokat ve Amasya bölgesinden hayvan ve insanlardan toplanan kenelerde Kırım Kongo Kanamalı ateĢi virüsü (KKKAV) varlığı daha önce gösterilmiĢtir (Tekin 2009; Bursalı et al. 2011). Ayrıca kenelerde Borrelia burgdoferi varlığı da Güner (2003) tarafından rapor edilmiĢtir (Güner, 2003).
Ülkemizde kenelerde KKKAV varlığı test edilmesine rağmen, TBEV ve diğer kene kökenli virüslerin varlığı konusunda çok fazla bilgi bulunmamaktadır. Ülkemizde daha önce yapılan çalıĢmalarda TBE virüs varlığı daha çok prevalans çalıĢmalarında serolojik olarak incelenmiĢtir ve pozitif sonuçlar alınmasına rağmen, çoğu
xxxvii
seropozitifler viral nötralizasyon ile tam olarak doğrulanmamıĢtır (Nuhoğlu, 2008). Bu hastalık çoğunlukla asemptomatik seyretmesi ve düĢük mortaliteye sahip olması nedeniyle fazla dikkatle önemsenmemektedir.
ÇalıĢmamızda test ettiğimiz örneklerden özellikle Tokat ve Amasya bölgelerinden toplananlarda TBEV olmaması çok ĢaĢırtıcı değildir. Çünkü bu bölgelerde özellikle Hyalomma cinsi kene türleri test edilmiĢ olup bunlar arasında TBEV vektörü olarak bilinen kene türleri çok az miktarda bulunmaktadır. Buna karĢılık Ordu ve Fatsa‟dan toplanan ve baĢlıca TBEV vektörleri olarak bilinen kene türlerinden biri olan I. ricinus türü kenelerde test ediliĢ olmasına rağmen bu kenelerde RT-PCR sonuçlarına göre TBEV varlığı bulunamamıĢtır. Bu negatif sonucun alınmasında örnek sayısının az olması ve örneklerin özellikle yaz sonuna doğru toplanmasının etkili olduğu tahmin edilmektedir. Ayrıca klasik RT-PCR hassasiyeti real time PCR‟a göre düĢük olduğundan, özellikle Avrupaya daha yakın olan Trakya ve Batı Karadeniz Bölgesinden toplanacak yeni örneklerin real time RT-PCR yöntemiyle test edildiği takdirde daha farklı sonuçlar alınması mümkün görülmektedeir.
Sonuç olarak bu çalıĢma da ülkemizde özellikle Orta Karadeniz Bölgesi‟nde TBEV varlığı moleküler yöntemler kullanılarak ilk kez test edilmiĢtir. RT-PCR ve DNA sekans analiz sonuçları Tokat, Amasya, Ordu ve Fatsa bölgelerindeki sert kenelerde TBEV bulunmadığını ve dolayısıyla bölge kenelerinin test edildiği kadarıyla TBEV bulaĢtırma riski taĢımadıklarını göstermiĢtir. Trakya ve Karadeniz bölgesinde daha geniĢ bir alanda ve daha çok örneğin test edilmesi bölge kenelerinin TBEV taĢıma potansiyellerinin daha kesin olarak ortaya konmasını sağlayacaktır. Ayrıca bu çalıĢma, ileride kenelerde TBEV varlığını ortaya koymak için yapılması muhtemel çalıĢmalara ıĢık tutacak olması açısından önemlidir.
xxxviii 5. KAYNAKLAR
Anonim, 2006. http://webpages lincoln.ac.uk/fruedisueli/Fwebpages/parasitology, (06.04.2004).
Bodemann, H.H., Pausch J., Schmitz, H., Hoppe, G., 2000. Die Zeckenzephalitis (FSME) als Labor-Infektion Med, 78-89.
Bursali, A., Ozkan M., and Tekin, S., 2008. Tokat ve Civarı Sert kenelerini Sistematik Yönden incelenmesi, 19. Ulusal Biyoloji Kongresi 23-27 Haziran, Trabzon.
Bursali, A., Tekin, S., Orhan, M., Keskin, A., and M. Ozkan. 2009. Geographical distribution, species diversity, and seasonal activity of ixodid ticks infesting humans
xxxix
in Turkey. In Proceedings, 5 SOVE Congress, 11-16 October, 2009. Belek, Antalya, Turkey
Bursali, A., Tekin S., Orhan, M., Keskin, A., M. Ozkan. 2010. Ixodid ticks (Acari: Ixodidae) infesting humans in180-186.Tokat province of Turkey: species diversity and seasonal activity. J Vector Ecol. 35-38.
Chambers, T.J., Hahn, C.S, Galler, R., Rice, C.M., 1999. Flavivirus genome organization, expression and replication. Annu. Rev. Microbiol: 649–688.
Dumpis, U., Crook, D., Oksi J., 1999. Tick-borne encephalitis. Clin Infect Dis, 28:882-890.
Gresikova, M., Kozuch, O., Nosek, J., 1968. Die Rolle von Ixodes ricinus als Vektor Zeckenenzephalitisvirus in verschiedenen mitteleuropäischen Naturherden. Zbl. Bakt. Parasit. 207: 423–429.
Gunther, G., Hanglund, M., Lindquist, L., Forsgren, M., Sköldenberg, B., 1997. Tick-borne encephalitis in Sweden in relation to aseptic meningoencephalitis of other
etilogy: a prospective study of clinical course and outcome: 230-238.
Gustavson, R., Forsgren, M., Gardulf, A., Granstrom, M., Svenungsson, B.,1993. Clinical manisfestations and antibody prevalence of Lyme borreliosis and tick-borne encephalitis in Sweden a study in five endemic areas close to Stockholm. Scand J. Infect Dis., 25(5), 595-603.
Haglund, M., Göran, G., 2003. Tick-borne encephalitis-pathogenesis, clinical course and longterm follow-up. Vaccine 2003, 21:S1/11–18.
Heinz, F.X., 1999. Sequence analysis and genetic classification of tick-borne viruses. from Europe and Asia. J. Gen. Virol, 80(2), 179–185.
Heinz, F.X., Collett, M.S., Purcell, R.H., 2000. Virus taxonomy: the classification and nomenclature of viruses. The seventh report of the International Commitee for the
Taxonomy of Viruses. San Diego: Academic Press, 858-8.
Heinz, F.X., 2003. Molecular aspects of TBE virus research. Vaccine 21: S1/3–S1/10. Heinz, F.X., Mandl, C.W, Holzmann, H., Kunz, C., Harris, B.A, Rey Ret al., 2005. The flavivirusenvelope protein E: Isolation of a soluble dimeric form from tick- borne encephalitis virus and its crystallization. 291-298.
Kim, S., Jeong, Y., Yun, M., 2009. Division of Arbovirus, Center for Immunoloji and pathology. 23(5), 15-20.
Kunz, C., 2003. TBE vaccination and the Austrian experience. Vaccine 21: S2/50–55.
xl
infection in tick-borne encephalitis virus transmission. Virology 219(4), 357-366.
Mutluay, N., 2009. Tokat ve çevresindeki sert kenelerde kırım kongo kanamalı ateĢi virüsünün real tıme RT-PCR yöntemi ile teĢhisi (Yüksek Lisans Tezi), GaziosmanpaĢa
Üniversitesi. Biyoloji Bölümü, Tokat.
Nuhoğlu, 2008. TAF Preventive Medicine Bulletin, Derleme/Review Article TAF Prev Med Bull 2008; 7(5):461-468.
Pogodina, V.V., Frolova, M.P., Erman, B.A., 1986. Chronic tick –borne encephalitis. Moscow: Nauka, 234.
Radda, A.C., Kunz, C., 1983. Die Frühsommer-Meningoenzephalitis in
Mitteleuropa. Kinderarzt 1983; 14: 714–724.
Roggendorf, M.E., 1996. Epidemiologyo tick-bore encephalitis virus in Germany. Infection, 24:465-6.
Skarpaas, T., Ljostad, U., Sundoy, A., 2004. First human cases of tick- borne encephalit Norway. Emerg Infect Dis./248-12.
Swanepoel, R., Shepherd, A.J., Leman, P.A., Shepherd, S.P., Miller, G.B., 1985. A commonsource outbreak of Crimean-Congo haemorrhagic fever on a dairy farm. S Afr Med J, 68, 635-637.
Süss, J., Sinnecker, H ., Sinnecker, R., Berndt, D., Zilske, E ., Dedek, G., 1992. Epidemiology and ekology of tick-borne encephalitis in the eastern part of Germany between 1960 and 1990 and studies on the Dynamics of a natural focus of
tick-borne encephalitis, 224-235. Nuttall PA, Labuda M: Dynamics of infection in tick vectorsnand at the tick-host interface. Adv Virus Res, 233–7.
Takeda, T., Ito, T., Osada, M., Takahashi, K., Takashima, I., 1999. Isolation of tick-
borne encephalitis virus from wild rodents and a seroepizootiologic survey in
Hokkaido, Japan. Am- J Trop Med Hyg. 60 (1), 287–291.
Tekin, S., A. Bursali, Mutluay, N., Ozkan, M., 2009. A molecular survey on ticks for Crimean-Congo haemorrhagic fever virus (CCHFV) in Turkey. In Proceedings, 5SOVECongress, 11-16 October, Belek, Antalya, Turkey.
