Stevia rebaudiana Bertoni'nin Doku Kültürü Teknikleriyle Çoğaltılması ve Steviol Glikozit İçeriğinin Belirlenmesi

(1)

T.C.

SELÇUK ÜNĠVERSĠTESĠ FEN BĠLĠMLERĠ ENSTĠTÜSÜ

Stevia rebaudiana Bertoni’nin DOKU KÜLTÜRÜ

TEKNĠKLERĠYLE ÇOĞALTILMASI VE STEVĠOL GLĠKOZĠT ĠÇERĠĞĠNĠN

BELĠRLENMESĠ AyĢe SOYHAN YÜKSEK LĠSANS TEZĠ

Tarla Bitkileri Anabilim Dalı

(2)

TEZ KABUL VE ONAYI

Ayşe SOYHAN tarafından hazırlanan “Stevia rebaudiana Bertoni’nin Doku Kültürü Teknikleriyle Çoğaltılması ve Steviol Glikozit Ġçeriğinin Belirlenmesi” adlı tez çalışması 20/08/2019 tarihinde aşağıdaki jüri tarafından oy birliği ile Selçuk Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Tarla Bitkileri Anabilim Dalı’nda YÜKSEK LİSANS TEZİ olarak kabul edilmiştir.

Jüri Üyeleri Ġmza

BaĢkan

Doç. Dr. Ahmet ÜNVER ………..

DanıĢman

Doç. Dr. Mustafa YORGANCILAR ………..

Üye

Dr. Ögr. Üyesi Emine ATALAY ………..

Yukarıdaki sonucu onaylarım.

Prof. Dr. Mustafa YILMAZ FBE Müdürü

Bu tez çalışması Bilimsel Araştırma Koordinatörlüğü tarafından 18201064 nolu proje ile desteklenmiştir.

(3)

TEZ BĠLDĠRĠMĠ

Bu tezdeki bütün bilgilerin etik davranış ve akademik kurallar çerçevesinde elde edildiğini ve tez yazım kurallarına uygun olarak hazırlanan bu çalışmada bana ait olmayan her türlü ifade ve bilginin kaynağına eksiksiz atıf yapıldığını bildiririm.

DECLARATION PAGE

I hereby declare that all information in this document has been obtained and presented in accordance with academic rules and ethical conduct. I also declare that, as required by these rules and conduct, I have fully cited and referenced all material and results that are not original to this work.

İmza Ayşe SOYHAN

Tarih: 20.08.2019

(4)

ÖZET

YÜKSEK LĠSANS TEZĠ

Stevia rebaudiana Bertoni’nin DOKU KÜLTÜRÜ TEKNĠKLERĠYLE

ÇOĞALTILMASI VE STEVĠOL GLĠKOZĠT ĠÇERĠĞĠNĠN BELĠRLENMESĠ

AyĢe SOYHAN

SELÇUK ÜNĠVERSĠTESĠ FEN BĠLĠMLERĠ ENSTĠTÜSÜ TARLA BĠTKĠLERĠ ANABĠLĠM DALI

DanıĢman: Doç. Dr. Mustafa YORGANCILAR

2019, 32 Sayfa Jüri

Doç. Dr. Ahmet ÜNVER Doç. Dr. Mustafa YORGANCILAR

Dr. Öğr. Üyesi Emine ATALAY

Stevia rebaudiana Bertoni ürettiği sıfır kaloriye sahip olması sebebiyle son yıllarda tüm dünyada

ilgi uyandıran bir türdür. Bitkinin gördüğü ilgi son yıllarda Türkiye’de artmış ve birçok yörede adaptasyon çalışması yapılmıştır. Ancak tohumlarda ki düşük çimlenme oranı ve yabancı tozlaşma nedeniyle oluşan genetik varyasyonlar bu bitkinin ticari üretiminin önündeki en büyük engeli oluşturmaktadır. Bu araştırmada Stevia rebaudiana Bertoni bitkisinin doku kültürü teknikleriyle çoğaltılması ve steviol glikozit içeriğinin belirlenmesi amaçlanmıştır. Bu amaca uygun olarak 3 farklı eksplant türünde (kök, gövde ve yaprak) farklı şeker tip (sakkaroz, maltoz) ve dozları (20-30-40 g/l) uygulanarak rejenerasyon çalışmaları yapılmış ve tüm eksplantlarda kallus oluşumları sağlanmıştır. Sonuç olarak kallus verimliliği açısından değerlendirildiğinde kök eksplantında 40 g/l maltoz ortamı, gövde eksplantında 20 g/l maltoz ortamı ve yaprak eksplantında 20 g/l sakkaroz ortamı etkin kallus verimliliği için tavsiye edilebilir. Elde edilen kalluslar steviol glikozit içeriklerinin belirlenmesi için HPLC analizine tabi tutulmuştur. Kallus kültürlerinin hiçbirinde steviol glikozit içeriklerine rastlanmamıştır.

(5)

ABSTRACT

MS THESIS

REPRODUCTION OF Stevia rebaudiana Bertoni BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES AND DETERMINATION OF STEVIOL GLUCOSIDE

CONTENT

AyĢe SOYHAN

THE GRADUATE SCHOOL OF NATURAL AND APPLIED SCIENCE OF SELÇUK UNIVERSITY

THE DEGREE OF MASTER OF SCIENCE IN FIELD CROPS Advisor: Assoc. Prof. Dr. Mustafa YORGANCILAR

2019, 32 Pages Jury

Assoc. Prof. Dr. Ahmet ÜNVER Assoc. Prof. Dr. Mustafa YORGANCILAR

Dr. Emine ATALAY

Stevia rebaudiana Bertoni is a species that has attracted worldwide attention in recent years due

to its zero calorie production. The plant sees increased interest in recent years in Turkey and adaptation studies have been made in many areas. However, genetic variations due to low germination rate and foreign pollination in seeds constitute the biggest obstacle to commercial production of this plant. In this study, it was aimed to propagate Stevia rebaudiana Bertoni by tissue culture techniques and to determine steviol glycoside content. Regarding this purpose, regeneration studies were performed by applying different sugar types (sucrose, maltose) and doses (20-30-40 g/l) in 3 different explant types (root, stem and leaf) and callus formation was provided in all explants. As a result, when evaluated in terms of callus efficiency, 40 g/l maltose medium in root explant, 20 g / l maltose medium in stem explant and 20 g/l sucrose medium in leaf explant can be recommended for effective callus productivity. The calli obtained were subjected to HPLC analysis to determine steviol glycoside contents. None of the callus cultures showed steviol glycoside content.

(6)

ÖNSÖZ

Bir tez çalışması olarak hazırlanan bu çalışma, 2015–2019 yılları arasında Doç. Dr. Mustafa YORGANCILAR denetiminde yapılmıştır. Öncelikle beni Yüksek Lisans öğrencisi olarak kabul eden, çalışmalarım süresince beni yönlendiren, aydınlatıcı bilgiyi, yapıcı eleştiriyi ve özeni esirgemeyen sayın hocam Doç. Dr. Mustafa YORGANCILAR’ a sonsuz teşekkürlerimi sunarım.

Gerek hazırlık aşamasındaki desteklerinden gerekse tez düzeni konusundaki yardımlarından dolayı sayın hocam Arş. Gör. Münüre TANUR ERKOYUNCU’ya ve Dr. Öğr. Üyesi Emine ATALAY’a, HPLC analizlerinde desteklerinden dolayı Prof. Dr. Osman KOLA’ya sonsuz teşekkürlerimi sunarım.

Ayşe SOYHAN KONYA-2019

(7)

ĠÇĠNDEKĠLER ÖZET ... i ABSTRACT ... ii ÖNSÖZ ... iii ĠÇĠNDEKĠLER ... iv SĠMGELER VE KISALTMALAR ... v 1. GĠRĠġ ... 1 2. KAYNAK ARAġTIRMASI ... 3 2.1. Genel Özellikleri ... 3 2.2. Doku Kültürü Çalışmaları ... 4 3. MATERYAL VE YÖNTEM ... 9 3.1. Materyal ... 9 3.2. Yöntem ... 9

3.2.1. Eksplantların elde edilmesi ... 9

3.2.2. Kültür ortamlarının hazırlanması ... 10

3.2.3. Eksplantların kültüre alınması ... 10

3.2.4. Oluşan sürgünlerin köklendirilmesi ve dış ortama aktarılması ... 11

3.2.5. Gözlem ve ölçümler ... 11

3.2.6. Sonuçların değerlendirilmesi ve istatistiki analizler ... 12

4. ARAġTIRMA SONUÇLARI VE TARTIġMA ... 13

4.1. Tohum Çimlendirme Çalışmaları ... 13

4.2. Sürgün Çoğaltımı ... 14

4.3. Rejenerasyon ... 15

4.3.1. Kök eksplantlarından rejenerasyon ... 15

4.3.2. Gövde eksplantından rejenerasyon ... 17

4.3.3. Yaprak eksplantından rejenerasyon ... 19

4.4. Köklendirme ve Dış Ortama Aktarma ... 21

4.5. Steviol Glikozit Analizleri ... 22

5. SONUÇLAR VE ÖNERĠLER ... 26

KAYNAKLAR ... 27

(8)

SĠMGELER VE KISALTMALAR Simgeler °C: Santigrat Derece mg/l: miligram/Litre g/l: gram/litre ml: milimetre mm: milimetre cm: santimetre mM: milimolar Kısaltmalar

atm: atmosfer basıncı

LSD: Least significant difference IAA: Indol asetik asit

BAP: Benzilaminopürin IBA: Indolbütirikasit KIN: Kinetin

NAA: Naftalin asetik asit HCI: Hidroklorik asit

(9)

1. GĠRĠġ

Stevia rebaudiana Bertoni Güney Amerika kökenli Asteracaea familyasına ait çok yıllık çalımsı bir bitkidir. Paraguay yerlilerinin binlerce yıldır tükettiği Stevia rebaudiana Bertoni, dünyada ticari anlamda en büyük ilgiyi uzak doğu ülkelerinden görmüştür. Uzun yıllardır tatlandırıcı olarak kullanılan bu bitkinin ticari üretimi birçok ülkede artmış olup steviol glikozitlerin gıda maddesi olarak kullanımına ABD’de 2008, Avrupa’da 2011, Türkiye’de 2013 yılından itibaren izin verilmiştir (İnanç ve Çınar, 2009). Kuzey Amerika da tespit edilebilen 80’den fazla çeşidi, Güney Amerika da ise 200’den fazla yerli türü olduğu tahmin edilmektedir (Tadhani ve ark., 2007). Genellikle bal otu, tatlı yaprak olarak bilinir. Çünkü çoğunlukla şeker tadı bitki yapraklarında bulunan sekonder metabolit ürünlerinden diterpenoid glikozitlerinden (Steviosid, rebaudiosid A, B, C, D ve F, dulcosid, steviolbiosid ve steviol) kaynaklanmaktadır (Yücesan ve ark., 2016). Bu bitkinin kuru yaprakları sakkarozdan 15-20 kat, ekstraktı ise 300 kat daha tatlı olup sıfır kaloridir (Singh ve ark., 2014). Sıfır kalori özelliğinden dolayı dünyada sağlık açısından risk oluşturan obeziteye karşı diyet ürünlerinde de rahatlıkla kullanılabilmektedir. Yapısı ve pH stabilitesi yüksektir. Bunun sonucunda yüksek ısıda pişirme mümkün olabilmektedir. Reçel, komposto, muhallebi vb. gibi kaynatılarak pişirilen yiyeceklerde; pasta, kek, kurabiye gibi fırında yüksek ısıda pişirilen tüm unlu gıdaların içerisinde kullanılabilmektedir (İnanç ve Çınar, 2009). Bakteriostatik olmasından ve fermente olmamasından dolayı içinde kullanıldığı gıdaların raf ömrünü uzattığı da belirlenmiştir (Swithers, 2013). Ekonomik değeri yüksek tıbbi aromatik bitki grubunda yer alan stevia bitkisinin dünyada gördüğü ilgi üzerine Türkiye de üretimin artırılması ve gerekli adaptasyon testlerinin yapılması için çalışmalar başlatılmıştır (Yücesan ve ark., 2016). Elde edilen verilerde özellikle Akdeniz Bölgesinin bu bitkinin üretimi için son derece uygun olduğunu göstermiştir (Turgut ve ark., 2015).

Stevia bitkisinin üretiminin önündeki en önemli problemin bitkilerin yeterli düzeyde tohum bağlamaması ve oluşan tohumların çimlenme oranının düşük olmasıdır (Yücesan ve ark., 2016). Bu bitkinin ülkemizde doğal yetişen bir bitki olmaması nedeniyle tohumları yurt dışından getirilmekte, getirilen tohumlar ise fide verme kapasitesinin (%10) çok düşük olduğu bu nedenle ticari boyutta bir fide üretiminin ve ekiminin yapılamadığı bilinmektedir (Turgut ve ark., 2015). Son yıllarda stevia üretiminin ülkemizde de artması tohum üretiminin bir nebze rahatlatsa da tohumlarda

(10)

düşük çimlenme oranı hala stevia üretiminin artırılmasının önümüzdeki en büyük engel olarak karşımıza çıkmaktadır. Bu problemlerin yanında dış tozlaşma ile meydana gelen tohumlardaki genetik varyasyonun steviol glikozitlerin üretiminde ciddi anlamda varyasyona neden olduğu bu nedenle ticari üretimde daha çok vejetatif üretimden elde edilmiş fidelerin tercih edildiği bilinmektedir (Sairkar, 2009). Bu yüzden şeker otunun büyük ölçekte ve hızlı üretiminde doku kültürü yöntem olarak görülmektedir. Bitki doku kültürü yöntemi temelde bir üretim yöntemidir. Bilinen diğer klasik yöntemlerden farklı olarak bitkinin çeşitli kısımlarından alınan küçük bir doku parçası sterilize edildikten sonra, çeşitli besin maddelerini içeren steril besin ortamında; ışık, nem, sıcaklık gibi uygun çevre koşullarında kültüre alınması işlemidir (Srivastava, 1981). Bitki doku kültürü teknikleriyle üretim yapılması daha seri üretim ve aynı anda aynı özelliğe sahip birçok bitkinin üretilmesi, doğaya kazandırılması teknolojik ve güncel bir yaklaşımdır.

Bu çalışmada Stevia rebaudiana Bertoni tohumlarının doku kültürü tekniğiyle çoğaltılması amaçlanmıştır. Ayrıca en iyi bitki büyüme düzenleyici kombinasyonları belirlenerek steviol glikozit içeriği analiz edilmiştir.

(11)

2. KAYNAK ARAġTIRMASI 2.1. Genel Özellikleri

Stevia rebaudiana Bertoni Asteraceae familyasına ait Güney Amerikanın yerli bitkisi olup yapraklarındaki tatlı tadı ve düşük kalorili diterpenoid steviol glikozit içeriğinden dolayı yaygın olarak kullanılan çalımsı bir türdür. Şeker otunun yaprakları doğal bir tatlandırıcı olarak Güney Amerika’daki Guarani Kızılderilileri tarafından yüzyıllarca kullanılmıştır. Yetiştiriciliği Çin, Brezilya, Paraguay, Meksika, Rusya, Endonezya, Kore, ABD, Tanzanya, Kanada, Tayland ve Arjantin dahil dünyanın diğer bölgelerine de yayılmış durumdadır (Lemus-Mondaca, 2012) Ayrıca son 10 yıldır Hindistan da ham kuru yaprak ve işlenmiş tatlandırıcı olarak kullanılmaktadır (Pal ve ark., 2013). Çin dünyada ki en büyük şeker otu üreticisi olarak %80’ini ihraç etmektedir (Kim ve ark., 2002, Mizutani ve Tanaka, 2002). Ekonomik değeri yüksek tıbbi aromatik bitki grubunda yer alan stevia bitkisinin dünyada gördüğü ilgi üzerine Türkiye’de üretiminin artırılması ve gerekli adaptasyon testlerinin yapılması için çalışmalar başlatılmıştır (Yücesan ve ark., 2016a., Yücesan ve ark., 2016b., Turgut ve ark., 2015). Elde edilen veriler özellikle Akdeniz Bölgesinin bu bitkinin üretimi için son derece uygun olduğunu göstermiştir (Turgut ve ark., 2015). Nemli ortamları seven, 60-90cm boyunda, ortalama 25℃ de ve bazı türleri 2300-2900m yüksekliklerde yetişebilen bir bitki türüdür (Cortes ve ark.., 2007). Stevia rebaudiana Bertoni çiçek yapısı 2-6 adet ufak beyaz çiçekçikten oluşan küçük salkım şeklindedir. Bitkide kendine uyuşmazlık olduğundan böcekle tozlanma olmaktadır (Goettemoeller ve Ching, 1999). Tohumlar 3mm uzunluğunda aken tipindedir. Yoğun bir kök sistemine sahiptir. Gövdesi oldukça nazik ve kırılgandır. Yaprakları 2-8 cm uzunluğunda kenarları ince dişli ve oval şekildedir. Bitki kültür koşullarında 1 m ya da daha fazla uzunluğa ulaşabilir (Shock, 1982b). Yapraklarında birden çok steviol glikozit bileşiği (%5-10) ihtiva etmekte olup bunlar; steviosid, reboodiside A (%2-4), reboudiside C (%1-2), dulcoside A (% 0.5-1), reboudiside B (<%1), reboudisid D (<%1), reboudisid E (<%1) olarak bilinmektedir. (Lemus-mondace ve ark., 2012). Yapraktaki ana maddeler steviosid ve rebaudisid A bileşikleridir (Salazar ve ark., 2018; Martins ve ark., 2016; Yadav ve ark., 2011). Yüksek tatlılıkta olan kısım rebausid A ve acılık veren kısım da steviosid’dir (Kovacevic ve ark., 2018). Steviol glikozitlerin bağırsaklarda normal sindirime uğrayarak steviol glucuronide olarak vücuttan atıldığı bilinmektedir. Bazı çalışmalar steviol glikozitlerin kristalize edilmiş şeker ve suni tatlandırıcıların aksine, hazmedildiği

(12)

esnada insülin salgılanmasına gerek duymadığı böylece diyabet tedavisinde kullanabileceğini göstermiştir (Lemus Mondaca ve ark., 2012). Ayrıca bu tatlandırıcının 100°C ve üzerinde yapısal bozukluğa uğramadığı dolayısıyla pasta bisküvi ve yemek endüstrisinde kullanımına uygun olduğu vurgulanmaktadır. Bakteriostatik olmasından ve fermente olmamasından dolayı içinde kullanıldığı gıdaların raf ömrünü uzattığı da belirlenmiştir (Swithers, 2013). Doğal bir tatlandırıcı olarak kullanılan şeker otu bitkisinin çağımızın en önemli hastalıklarından diyabet, tansiyon ve obezite gibi hastalıklarla mücadelede olumlu etkisi bulunmaktadır (Puri ve ark., 2011). İdrar söktürücü, ağrı kesici ve kan basıncını düşürücü özellikleri vardır ve ayrıca kan şekeri düşüklüğünde ve mide ağrılarında bitkisel tedavi amacıyla kullanılır (Argueta ve Cano, 1993). Kanser önleyici antioksidan özelliğine sahiptir (Okawa ve ark., 2001).

2.2. Doku Kültürü ÇalıĢmaları

Stevia rebaudiana Bertoninin yapısında ihtiva ettiği çok düşük kalorili tatlandırıcılar nedeniyle son yıllarda çok çalışılan bitkilerden olup tüm dünyada ilgi uyandıran bir bitki türüdür. Bitkinin gördüğü ilgi son yıllarda Türkiye’de artmış ve birçok yörede adaptasyon çalışmaları yapılmıştır. Ancak tohumların çok küçük ve zayıf yapıda olmasından dolayı düşük çimlenme oranı ve yabancı tozlaşma nedeni ile oluşan genetik varyasyonlar bu bitkinin ticari üretiminde zor bir süreç oluşturmaktadır. Bu nedenle çalışma ile stevia tohumlarının çimlenmesi üzerine gibberellikasit uygulaması test edilmiş ayrıca ticari üretimi için vejetatif üretimi sağlayacak doku kültürü fide üretim yolları araştırılmıştır. Araştırmada %3 sakkaroz ve 8 g/l agar kullanmıştır. Sonuçlarda özellikle 50 mg/l GA uygulamasının olumlu etkileri görülmüştür. En yüksek kallus indüksiyonu yaprak eksplantlarından NAA ve BAP kombinasyonundan elde edilmiş ve en düşük kallus oluşturan ortamların 2-4 D ile BAP kombinasyonları olduğu görülmüştür. Ayrıca maksimum sürgün ve kök gelişimi BAP ve IBA bulunan ortamlarda meydana gelmiştir (Yıldırım, 2017).

Stevia rebaudiana Bertoni tıbbi bir bitki ve diyabetik hastalarda kalorisiz tatlandırıcı olarak kullanılmaktadır. Bu çalışmada mikro çoğaltım için IAA, BAP ve KIN kullanılarak bir prosedür geliştirilmiştir. IBA ve NAA köklerin uyarılması için kullanılmıştır (Razak ve ark., 2014).

(13)

Stevia rebaudiana Bertoni bitkisinde in vitro ve in vivo çoğaltım protokolleri sekonder metabolitlerin üretimi için yaprak ve nodal eksplanttan organogenesis yoluyla geliştirilmiştir. KIN+IAA kombinasyonu ile en iyi kallus oluşumu, IAA+KIN kombinasyonu ile maksimum sürgün sayısı, BAP+KIN ile yaprak eksplantından maksimum sürgün verileri elde edilmiştir (Kumari ve Chandra, 2015).

Sekonder metobolitlerin içeriğinin artırılması amacıyla nod eksplantlarında aljınat (ALG), kazein hidrolizat (CH), pektin (PEC), metil jasmonat (MeJA), salisilik asit (SA), kitosan (CHI) içeren bitki ortamlarında kültüre alınmıştır. Çalışma sonucunda Stevia rebaudiana’nın bitki büyümesi ve sekonder metabolit üretimi üzerine önemli bulgular elde edilmiştir (Bayraktar ve ark., 2016).

Stevioside, Stevia rebaudiana’nın yaprağından elde edilen doğal bir tatlandırıcı ve şekerden 300 kat daha tatlıdır. Kan şekeri seviyesini düşürmeye yardımcı olur ve diyabetik hastalara faydalı bir bitkidir. Doku kültürü yöntemleri stevia üretimi için modern bir yöntemdir. Bu çalışmada steviosidenin tanımlanması için yaprak eksplantları kullanılarak in vitro yöntemler kullanıldı. Steviosid oranını tespit etmek için HPLC kullanıldı. Yaprak numunelerinin steviosid içeriği %9.6 olarak bulundu. Bu yöntem stevia’nın ticari olarak kullanılabileceğini gösterdi (Karim ve ark., 2016).

Ticari olarak değerli olan şifalı bitki Stevia rebaudiana’nın tuz konsantrasyonlarına maruz bırakılması araştırılmıştır. Önemli ölçüde artması fizyolojik parametrelerin, steviol glikozitlerin yani rebausid A ve steviosidenin, toplam flavanoid içerikleri incelendiğinde 100 mM NaCl stresine maruz bırakılan ortamlarda gözlemlenmiştir. Kallus sonuçları da benzer sonuçlar göstermiştir. Bu nedenle NaCl in vitro koşullarda Stevia’nın metabolik süreçlerinde ve fizyolojisinde stres giderici rol oynamaktadır (Javed ve Gurel, 2019).

Stevia rebaudiana düşük kalorili glikozit tatlandırıcıları nedeniyle diyabetik hastaları tedavi etmekte faydalıdır. Doğal ve bitkisel üretimi yetersizdir. In vitro teknikler alternatif bir yöntemdir. Bu nedenle doğal tatlandırıcı üretimini artırmanın yolları araştırılmıştır. Stevia biyokütlesi ve steviol glikozit üretimi açısından yarı katı ortam, sıvı ortam ve BITA’yı karşılaştırıldı. 21 günlük kültür sonunda BITA tarafından onaylanan sürgünlerin morfolojik kalitesi, taze ve kuru ağırlıkları daha iyi olduğu belirlendi. Çalışmanın ekonomik verimliliğini artırmak için ilave deneyler yapılması gösterilmektedir (Vives, 2017).

(14)

Doku kültürü stevia bitkisinin üretimi için hızlı bir yöntemdir. Ortamdaki en önemli faktörlerden biri bitki büyümesi için gerekli olan sakkarozdur. Çalışmada farklı sakkaroz konsantrasyonları (50 mM, 100 mM, 150 mM) denenerek kök eksplantı kullanılmıştır. 28 günlük bir süre içinde çeşitli morfolojik özellikler ölçülmüştür. En yüksek büyüme hızı yaprak ve köklenme 100 mM sakkaroz içeren ortamdan elde edilmiştir. Sonuç olarak stevia bitkisinin büyümesi ve steviol glikozit üretimi için en iyi koşulu 100 mM sakkarozun sağladığı görülmektedir (Ghorbani, 2017).

Stevia rebaudiana Bertoni tozlaşması zor olan bir bitkidir. Steviol glikozit olarak

rebaudiozit A tatlandırıcı acılığa sahip olan steviosideye kıyasla daha çok tercih edilen özelliğiyle ilgi çekmektedir. Araştırma da 6 hafta boyunca çimlendirilmiş fidelerden çıkarılmış nodlar çeşitli büyüme düzenleyicilerini içeren MS ortamı üzerinde kültürlenmiştir. Sonuçlar 3 hafta sonunda eksplant başına ortalama 2 sürgün verdiğini göstermiştir. Ardından sürgünler indol-3-asetik asit (IAA), indol-3-butirik asit (IBA), naftalin asetik asit (NAA) ve hiçbirini içermeyen MS bulunan ortamlara aktarıldı. 3 hafta boyunca kök oluşumu için indol-3-asetik asit(IAA) ve naftalin asetik asit(NAA) %100 köklenmede etkili olduğu görülmüştür. Tüm bitkiler seraya alındı ve hayatta kalma oranları yüksek olan bitkiler 14 hafta sonunda sahaya aktarıldı. Benzer şekilde saksılardaki tohum çimlenmesinden elde edilen fideler aynı alana aktarıldı. İkisinin arasında morfolojik farklılık ve steviol glikozit bileşimleri açısından anlamlı bir fark yok olduğu belirlendi (Yücesan ve ark., 2016).

Stevia rebaudiana bitkisinin mikro çoğaltım aşamasında eksplant olarak nod

kısımları kullanılmış. MS ortamı üzerine 0.1-0.5 mg/l BAP konsantrasyonları ve 0-0.1-0.5 mg/l KIN konsantrasyonları üzerinde kültürlenmiştir. En yüksek hayatta kalma yüzdesi 0.5 mg/l BAP +0.5 mg/l KIN ortamlarından elde edilmiştir. En yüksek sürgün sayısı 2 mg/l BAP +0.5 mg/l KIN ile desteklenmiş ortamlardan elde edilmiştir. Köklenmesi için uzun sürgünler ayrıldı ve IBA ve NAA ile desteklenmiş ortamlara aktarıldı. 0.5-1-2 mg/l IBA ortamlarında maksimum kök indüksiyonu gözlendi. IBA ortamlarının köklenme açısından NAA ortamlarından daha anlamlı ve etkili olduğu gözlendi. Oluşan bitkiler sera şartlarına aktarıldı (Alhady., 2011).

Sürgün rejenerasyonu Stevia rebaudiana Bertoni bitkisinin nodal eksplantlarından elde edildi. En yüksek sürgünlerin uyarılması MS ortamı üzerinde 1.5 mg/l BAP+0.5 mg/l KIN ortamlarından elde edilmiştir. IBA, NAA ve IAA köklenmesi için kullanılmıştır. En çok köklenme 0.1 mg/l IAA ortamlarından elde edilmiştir. Köklenen bitkiler toprağa aktarıldı (Ahmed ve ark., 2007).

(15)

Stevia rebaudiana Bertoni bitkisinde bulunan steviosidenin artırılması amacıyla

mikroçoğaltım yöntemleri geliştirilmiş ve CCC kullanılmıştır. Mikro sürgünler CCC ve IBA içeren MS ortamlarına transfer edilmiştir. Test edilen kombinasyonlar arasında 3 mg/l CCC ve 3 mg/l IBA ortamlarında kısa sürgün uzunluğu, çok sayıda sürgün, en yüksek yaprak büyüklüğü, artan biyokütle ve yükselen steviosid içerikleri bulunmuştur. Bu araştırma sonuçları stevia bitkisinde mikroçoğaltım için uygulanabilir olduğunu göstermektedir (Dey ve ark., 2013).

Araştırma da farklı azot dozlarının Stevia rebaudiana Bertoni bitkisinin verim ve kalite özellikleri üzerine etkisi araştırılmıştır. Üç yılın ortalaması değerlendirilmiş ve elde edilen verilere göre en erken çiçeklenme 0 azot dozunda 162 günde görülmüştür. En yüksek bitki boyu 121 cm ile 10-15 kg/da azot dozlarında tespit edilmiştir. En fazla ana dal sayısı 19 adet ile 10 kg/da azot dozunda görülürken, 2675.3kg/da ile en fazla yeşil herba verimi 15 kg/da görülmüştür. En fazla yeşil yaprak verimi 10 kg/da azot dozunda görülürken en fazla kuru herba verimi 15 kg/da dozunda görülmüştür. En fazla kuru yaprak verimi 10 kg/da azot dozunda görülürken en fazla yaprak/sap oranı 1.09 kg/da dozundan elde edilmiştir. Steviol glikozit açısından değerlendirildiğinde en fazla steviosid miktarı ve rebaudioside A miktarı 5 kg/da dozunda görülmüştür. Çalışma sonucunda 10kg/da dozunun şeker otu bitkisi için uygun olduğu ve Antalya koşullarında çok yıllık olarak yetiştirilebileceği sonucuna varılmıştır (Sözmen., 2015).

Araştırma 2013 yılında Çukurova Üniversitesi Ziraat Fakültesi, Tarla Bitkileri Bölümü deneme alanında farklı ekim sıklıkları (30×60 cm, 45×60 cm ve 60×60 cm), değişik biçim zamanı (çiçeklenme öncesi ve sırası) ve biçim sayılarının şeker otu’nun verim ve kalitesine etkisini saptamak amacıyla bölünen bölünmüş parseller deneme desenine göre 3 tekrarlamalı olarak yürütülmüştür. Bitki sıklıkları ana parseller, biçim zamanı alt parseller ve biçim sayıları da minik parselleri oluşturmuştur. Araştırma sonuçlarına göre en yüksek bitki boyu, dal sayısı, dal çapı, taze ve kuru herba, dal ve yaprak verimi, çiçek salkımı sayısı, taze ve kuru çiçek salkımı verimi ve tohum verimi 30×60cm bitki sıklığında saptanmıştır. Biçim zamanı yönünden ise en yüksek bitki boyu, dal sayısı, dal çapı, taze ve kuru herba, dal ve yaprak verimi çiçeklenme sırası ve en yüksek yaprak/dal oranı çiçeklenme öncesinde elde edilmiştir. Ayrıca en yüksek dal çapı, taze ve kuru herba, dal ve yaprak verimi birinci biçimlerde ve dal sayısı, taze ve kuru çiçek salkımı verimi ve tohum verimi ise ikinci biçimlerde saptanmıştır. Bitkinin kuru yapraklarında en yüksek steviosid oranı, 30×60cm bitki sıklığı, çiçeklenme öncesi ve ikinci biçimlerde tespit edilmiştir. Kuru yapraklarda diğer şeker bileşenleri yönünden

(16)

en yüksek sakkaroz, glikoz ve früktoz ikinci biçimlerde ve sorbitol ise birinci biçimlerde bulunmuştur. Araştırmada, kalorisiz tatlandırıcı olarak yüksek tansiyon ve şeker hastalarının tedavisinde kullanılan Stevia rebaudiana Bertoni’nin Çukurova bölgesi koşullarında en yüksek verimlerinin 30×60cm ekim sıklığında ve çiçeklenme öncesi yapılan biçimlerden elde edildiği saptanmıştır (Samadpourrigani 2014).

Günümüzde şeker tüketimindeki artış obezite, diyabet, diş çürüğü ve kalp damar hastalıklarının temel nedenidir. B nedenle şeker dışındaki doğal tatlandırıcıların kullanılması öngörülmektedir. Bunlardan biri Stevia rebaudiana Bertoni bitkisidir.

Asteraceae familyasına ait ve 1887’de Güney Amerika da keşfedilmiştir. Güney

Amerika da yaklaşık 200 tür bulunmuştur. Nemli ortamda yetişen endemik çok yıllık bitki türüdür. Paraguay ve Brezilya da tatlandırıcı olarak kullanılmakta ve Japonya gibi ülkelerde gıda katkı maddesi olarak kullanılıyor. Üretimi Türkiye’nin Akdeniz Bölgesinde baskın olmasına rağmen Ege, Karadeniz ve İç Anadolu Bölgelerinde de tanınmaktadır. Tatlandırıcı olarak birkaç bileşik olmasın rağmen ana madde steviosidedir. Toksik olmaması ve mutajenik yapısı düşük olduğu için birçok araştırmacının dikkatini çekmiştir. Bu araştırma da bor uygulamasıyla steviol glikozit içeriğinin artırılması ve çimlenme seviyesi araştırılması amaçlanmıştır. 0 ve 10 ppm bor uygulamaları yapıldı. 0 ppm bor uygulamasında toksik etkiler gözlenirken 10 ppm bor uygulamasında lekelenme ve katlanmış yapraklar gözlendi (Hakkı ve ark., 2018).

Stevia rebaudiana Bertoni tıbbi açıdan önemli, kalorisiz ve antidiyabetik bir

tatlandırıcıdır. Bu çalışmada Stevia rebaudiana’nın in vitro çoğaltılması amaçlanmıştır. Sera şartlarındaki bitkilerden eksplant olarak sürgün uçları ve nodal segmentler kullanıldı. Eksplantlar sürgün çoğaltımı için MS ortamları üzerine farklı konsantrasyonlar içeren BAP(0.2-0.5-1 mg/l) ortamlarında kültüre alındı. En yüksek sürgün sayısı 1 mg/l BAP ortamından elde edildi. Rejenere edilen sürgünler farklı konsantrasyonlarda (0.5-1.0 ve 3 mg/l) IBA ortamı ile desteklenmiş MS ortamlarına aktarıldı. Tüm ortamlarda köklenme %100 gözlendi ancak kök uzaması 0.5 mg/l IBA ortamında daha yüksek olduğu tespit edildi. Köklenen bitkiler saksılara aktarıldı (Atalay ve ark., 2011).

(17)

3. MATERYAL VE YÖNTEM

3.1. Materyal

Bu tez çalışmasında materyal olarak ekonomik değeri yüksek tıbbi aromatik bitki grubunda yer alan ve şeker otu olarak bilinen Stevia rebaudiana Bertoni bitkisinin tohumları ve fidesi kullanılmıştır.

ġekil 3.1. Stevia rebaudiana Bertoni (şeker otu)

3.2. Yöntem

3.2.1. Eksplantların elde edilmesi

Ön sterilizasyon için tohumlar akan çeşme suyunda yaklaşık 5 dakika yıkandıktan sonra steril kabin içerisinde manyetik karıştırıcıda %96’lık etil alkol (v/v) çözeltisinde 1 dakika bekletildi ve 1 kez steril su ile durulandı. Ardından manyetik karıştırıcı üzerinde Tween 20 içeren %10’luk sodyum hipoklorit (NaOCI) çözeltisinde 10 dakika bekletildikten sonra 3 kere steril saf su ile çalkalanarak durulanmıştır. Steril edilen tohumlar standart MS ortamı içeren kaplarda kültüre alınmıştır. Yeşil aksam içinde uygun sterilizasyon şartları belirlenmiştir. Steril fide elde edebilmek amacıyla sterilizasyon için saksılarda büyüyen fidelerden alınan nod kısımları ilk önce çeşme suyunda yıkandıktan sonra steril kabin içerisinde manyetik karıştırıcıda %96’lık etil alkol çözeltisinde 3 dakika bekletildi ve 1 kez steril saf su ile durulandı. Ardından Tween 20 içeren %5’lik sodyum hipoklorit çözeltisinde 10 dakika bekletildikten sonra 3

(18)

kez steril saf su ile durulandı. Steril fayans üzerine alındı ve birkaç dakika kuruması sağlandıktan sonra 0.5 mg/l BAP içeren ortamlara her magentada 4 adet nod olacak şekilde aktarıldı.

3.2.2. Kültür ortamlarının hazırlanması

Bu tez çalışmasında temel besin ortamı olarak MS kullanılmıştır. Tohumların çimlendirme aşamasında MS ortamı kullanılmıştır. Steril fide elde edebilmek amacıyla 0.5 mg/l BAP içeren MS ortamları hazırlanmıştır. Kök, yaprak ve gövde eksplantlarının rejenerasyonu için sakkaroz ve/veya maltoz içeren MS ortamına farklı konsantrasyon ve kombinasyonlarda oksin ve/veya sitokinin ilave edilerek ortamların pH’ları 1N KOH ya da 1N HCI kullanılarak 5.8’e ayarlandıktan sonra 1.2 atm basıncında 121ºC, 20 dakika sterilizasyonu sağlanmıştır.

ġekil 3.2. Kültür ortamlarının hazırlanması

3.2.3. Eksplantların kültüre alınması

Kallus ve sürgün çoğaltımı için eksplant kaynağı olarak doku kültüründe yetiştirilen steril fidelerin sürgünleri kullanılmıştır. Kallus ve sürgün çoğaltımı için kullanılacak eksplantlar (yaprak veya yaprak sapı) çeşitli şeker tipleri ve hormon kombinasyonlarının (Oksin x Sitokinin) bulunduğu MS ortamlarında kültüre alınmıştır.

Çalışmada kullanılan farklı şeker tiplerinde en iyi kallus gelişimini sağlayan büyüme düzenleyicilerinin kombinasyonları belirlenmiş ve steviol glikozit içeriği her iki şeker tipi içeren ortamda analiz edilmiştir.

(19)

3.2.4. OluĢan sürgünlerin köklendirilmesi ve dıĢ ortama aktarılması

2-3 cm uzunluğundaki sürgünler, kök gelişimi için farklı hormon kombinasyonlarının (IBA ve NAA) bulunduğu MS ortamlarında kültüre alınmıştır. Kültür başlangıcından 4 hafta sonra, her iki türde kök oluşturan sürgün yüzdesi (%), sürgün başına kök sayısı (adet) değerleri tespit edilmiştir.

Gelişimini tamamlayan bitkiler, magenta kutularından çıkartılarak kökleri musluk suyu ile yıkanarak ve besin ortamı kalıntılarından temizlenip steril torf ile doldurulmuş viyollere dikilmiştir.

ġekil 3.3. Sürgünlerin köklendirilmesi

3.2.5. Gözlem ve ölçümler

 Kallus OluĢturma Frekansı (%): Kültüre alınan eksplantların kallus oluşturma oranları tespit edilerek % olarak ifade edilmiştir.

 Kallus Ağırlığı (mg/eksplant): Petrilerde gelişen kallusların ağırlığı miligram cinsinden belirlenmiştir.

 Oransal Kallus Verimliliği (mg/kallus): Kallus ağırlığı x Kallus oluşturma oranı/100 denkliğine göre %olarak hesaplanmıştır.

 Sürgün GeliĢimi: Oluşan sürgünler sürgün gelişimi için farklı bir ortama alınarak sürgün sayıları belirlenmiştir.

(20)

 Kök OluĢturma Frekansı (%): Köklendirme ortamlarına alınan sürgünlerin kök oluşturma oranları tespit edilerek % olarak ifade edilmiştir.

 Steviol Glikozit Miktar (mg/g): Steviol glikozit içeriği HPLC analizi ile belirlenmiştir.

3.2.6. Sonuçların değerlendirilmesi ve istatistiki analizler

Araştırma Tesadüf Parselleri Deneme Desenine göre kurulmuş olup tüm denemeler üç tekerrürlü olarak yürütülmüştür. Denemelerde 2 şeker tipi ve en az 3 büyüme düzenleyicisi tipi kullanılmış olup bunların farklı konsantrasyonları ve kombinasyonları da denemede belirtilmiştir.

Elde edilen veriler MSTAT-C istatistik analiz programında analiz edildikten sonra önemli farklar LSD testiyle gruplandırılmıştır.

(21)

4. ARAġTIRMA SONUÇLARI VE TARTIġMA

4.1. Tohum Çimlendirme ÇalıĢmaları

Stevia rebaudiana Bertoni bitkisinin üretiminde en önemli problem tohumlarının çimlenme oranının düşük olması ve yeterli düzeyde tohum bağlayamamasıdır. Tarla da fide üretimine gidilmesi çok miktarda tohum gerektirip maliyeti artırmaktadır. Bu yüzden bu çalışmada tohumların çimlendirilmesini artırabilmek için tohumlar zımparalandı, bir gece suda bekletildi, gibberellik asit ve hidroklorik asit ile muamele edildi. Çizelge 4.1’de yöntemler ve sonuçları gösterilmektedir. Gupta ve Chakrabarty, (2013), gibberellik asit gibi bazı uygulamalarla bitkilerde hücre uzaması ve bölünmesini hızlandırdığı bu yüzden çoğu bitkide ince gövdeli uzun boylu bitkilerin elde edilmesinde kullanıldığı birçok çalışmada belirtilmiştir Yıldırım (2017), tohumların çimlendirilmesi aşamasında gibberellik asit konsantrasyonlarını uygulamış ve çimlenmenin en yüksek 50 mg/l’de olduğunu belirtmiştir. Çimlenme çalışmalarında farklılıkların görülmesi çeşitli uygulama yöntemlerinden ve konsantrasyonlarından kaynaklanabilmektedir.

(22)

Çizelge 4.1. Tohumların çimlendirilme yöntemleri

Uygulama Gözlem

Hidroklorik asit uygulaması Çimlenme gözlemlenmedi

Giberellik asit uygulaması + 7 gün karanlıkta bekletme Çimlenme gözlemlenmedi

Zımparalama Çimlenme gözlemlenmedi

Saf su uygulaması + 12 saat karanlıkta bekletme Çimlenme gözlemlenmedi

4.2. Sürgün Çoğaltımı

Steril Stevia rebaudiana Bertoni fidesi elde etmek amacıyla 0.5 mg/l BAP içeren MS ortamlarına nodlar aktarılmıştır. Sekiz hafta kültür süresi sonunda araştırmanın yürütülmesi için yeterli sayıda sürgün elde edilmiştir. Tek bir eksplanttan en düşük bir sürgün alınırken en fazla 10 sürgün alınmıştır. Benzer olarak Pratibha ve ark., (2010), yaptıkları çalışmalarda en iyi sürgün çoğaltım oluşum yüzdesini 0.5 mg/l BAP ve 1 mg/l BAP bulunan ortamlardan elde etmişlerdir. Aynı zamanda Sivaram ve Mukundam (2003), artan BAP konsantrasyonunun çoklu sürgün oluşumuna sebep olduğunu göstermişlerdir. Farklı uygulamalara bakıldığı zaman Das ve ark., (2011), yılında yaptıkları çalışmalarda KIN uygulamalarının BAP uygulamalarından daha etkili olduğunu bulmuşlardır. Tüm bu literatürlere bakıldığında çalışmamızın farklılık göstermesi bitki büyüme düzenleyicilerin konsantrasyonları, kültür süreleri ve eksplant farklılıklarından kaynaklı olabilmektedir.

(23)

4.3. Rejenerasyon

Bitki rejenerasyonu için 3 farklı eksplant tipi (kök, yaprak ve gövde) kullanılmış olup sonuçlar ayrı başlıklar altında değerlendirilmiştir.

4.3.1. Kök eksplantlarından rejenerasyon

Doku kültürü teknikleriyle steril Stevia rebaudiana Bertoni fidesi elde edebilmek için sterilizasyonu yapılan nodlar 0.5 mg/l BAP bulunan MS ortamına aktarıldıktan sonra kök eksplantlarının rejenerasyonu için köklendirme ortamına alınmıştır. Yeterli düzeyde büyüme sağladıktan köklenen bitkilerden alınan kök eksplantları her petride 5 eksplant olacak şekilde farklı şeker tipleri (sakkaroz ve maltoz) ve dozları bulunan MS ortamlarına nakledilmiştir. Kallus kültürlerinin 8 hafta sonunda kallus oluşturma durumları belirlenmiştir. Elde edilen veriler yüzde olarak ifade edilerek ortalama değerler varyans analizine tabi tutularak kallus oluşum yüzdesi olarak Çizelge 4.2’de verilmiştir. Varyans analiz sonuçlarına göre kallus oluşumunda şeker tipinin etkisi önemsiz bulunurken, uygulanan doz ve şeker tipi x uygulama dozu interaksiyonu %1 önemli bulunmuştur. Çizelge 4.2’ye bakıldığında 20 g/l şeker dozu uygulamasının (% 66.67) en yüksek kallus oluşturma yüzdesini vermiştir. Şeker tipi x uygulama dozu interaksiyonunda en yüksek kallus oluşturma oranı (% 100) ile 20 g/l sakkaroz uygulamasından elde edilirken en düşük kallus oluşturma oranı (17.77) ile 30 g/l sakkaroz uygulamasından elde edilmiştir.

Çizelge 4.2. Kök eksplantlarında kallus oluşum yüzdesi (%)

ġeker tipi Doz (g/l) Ort.

20 30 40

Sakkaroz 100a 17.77b 40.00b 52.59

Maltoz 33.33b 35.55b 48.90b 39.26

Ort. 66.67a 26.67b 44.45ab

LSD %1 DOZ: 23.51 LSD %1 TİP x DOZ:33.25

Ortalama kallus ağırlıkları varyans analizine tabi tutularak Çizelge 4.3’de verilmiştir. Varyans analiz sonuçlarına göre kallus ağırlıkları ölçümlerinde şeker tipi ve uygulama dozu %1 önemli bulunurken şeker tipi x uygulama dozu interaksiyonu %5 önemli bulunmuştur. Çizelge 4.3’e bakıldığında şeker tipi olarak maltoz ortamı 92.22 mg/l ile en yüksek kallus ağırlığını vermiştir. Şeker dozu olarak 40 mg/l’den en yüksek

(24)

kallus ağırlığı (95.00 mg) elde edilmiştir. Şeker tipi x uygulama dozu interaksiyonunda en yüksek kallus ağırlığı 120mg/l ile 40 g/l maltoz ortamından elde edilirken en düşük kallus ağırlığı 13.34 mg/l ile 30g/l sakkaroz ortamından elde edilmiştir. Yapılan araştırmalara bakıldığında genellikle kültür şartlarında 30 g/l sakkaroz ortamının uygun olduğunu kanıtlayan birçok çalışma bulunmaktadır (Razak ve ark., 2014; Kumari ve Chandra, 2015). Bu tez çalışmasında LSD gruplandırmasına göre kallus ağırlığını maltoz ortamının sakkaroz ortamının daha fazla etkilediği görülmektedir. Yıldırım (2017) ve Pratibha (2010) çalışmalarında 30 g/l sakkaroz ortamını kullanmışlardır. Bu bağlamda oransal kallus verimliliği bakımından 58.68 g/l ile maltoz ortamının daha etkin olduğu görülmektedir (Çizelge 4.4.)

Çizelge 4.3. Kök eksplantlarından elde edilen kallus ağırlığı (mg)

20 30 40

Sakkaroz 26.67c 13.34c 70.00b 36.67

Maltoz 116.67a 40.00bc 120.00a 92.22

Ort. 71.67a 26.67b 95.00a

LSD %1 DOZ: 32 LSD %1 TİP x DOZ:32.48

(25)

Çizelge 4.4. Oransal kallus verimliliği (mg/kallus)

ġeker tipi Doz (g/l)

20 30 40

Sakkaroz 26.67 2.37 28.00

Maltoz 38.85 14.20 58.68

Kök rejenerasyonu için kallus verimliliğine bakıldığı zaman en iyi şeker tipi maltoz olduğu görülmüştür. Doz olarak yine maltoz oranı arttığı zaman kallus verimliliğinin arttığı gözlemlenmiştir.

4.3.2. Gövde eksplantından rejenerasyon

Elde edilen steril stevia fidelerinden alınan eksplantlar yeterli düzeye ulaştıktan sonra farklı şeker tipi ve dozları bulunan MS ortamlarına aktarılmıştır. Kallus kültürlerinin 8 hafta sonunda kallus oluşturma durumları belirlenmiştir. Elde edilen veriler yüzde olarak ifade edilerek ortalama değerler varyans analizine tabi tutularak kallus oluşum yüzdesi Çizelge 4.5’de verilmiştir. Varyans analiz sonuçlarına göre kallus oluşumunda şeker tipi ve uygulama dozu istatistik olarak %1 önemli bulunurken şeker şeker tipi x uygulama dozu interaksiyonu önemsiz çıkmıştır. Çizelge 4.5’e bakıldığında gövde eksplantından en yüksek kallus oluşum yüzdesi şeker tipi olarak sakkaroz içeren ortamlardan (% 59.26) elde edilmiştir. Şeker dozu 20 g/l en yüksek kallus oluşum yüzdesini (% 71.11) vermiştir.

Çizelge 4.5. Gövde eksplantlarında kallus oluşum yüzdesi (%)

20 30 40

Sakkaroz 77.77 46.67 53.34 59.26

Maltoz 64.44 4.44 31.11 33.33

Ort. 71.11a 25.56b 42.22b

LSD %1 DOZ:26.02

Gövde eksplantlarından elde edilen kallusların ortalama ağırlıkları varyans analizine tabi tutularak Çizelge 4.6’da verilmiştir. Varyans analiz sonuçlarına göre

(26)

kallus ağırlıkları ölçümlerinde şeker tipi önemsiz bulunurken, dozu ve şeker tipi dozu interaksiyonu %1 önemli bulunmuştur. Çizelge 4.6’ya bakıldığında 20 g/l en yüksek şeker dozu yüzdesini (%85.83) vermiştir. Şeker tipi dozu interaksiyonunda en yüksek kallus ağırlığı 148 mg/l ile 20 g/l maltoz ortamından elde edilirken en düşük 3 mg/l ile 30 g/l maltoz ortamından elde edilmiştir. Çalışmamızda kallus ağırlığı olarak maltoz etkili görülüp diğer kaynaklarla farklılık görülmektedir. Fakat kallus oluşum yüzdesi olarak sakkaroz ortamının daha etkin olduğunu Ghorbani (2017) yaptığı çalışmada sakkaroz konsantrasyonlarını denemiş 34 g/l sakkaroz ortamının etkili olduğunu gözlemlemiştir.

Çizelge 4.6. Gövde eksplantlarından elde edilen kallus ağırlığı (mg)

20 30 40

Sakkaroz 23.67bc 44.33b 119.00a 62.33

Maltoz 148.00a 3.33c 46.33b 65.89

Ort. 85.83a 23.83b 82.67a

LSD %1 DOZ: 28.18 LSD %1 TİP x DOZ:32.78

(27)

20 30 40

Sakkaroz 18.39 20.70 63.43

Maltoz 95.31 1.48 14.41

Gövde eksplantları için şeker tipi sakkaroz ortamı daha etkili görülürken maltoz ortamının dozu düştüğü zaman kallus verimliliğinin arttığı sonucuna varılmıştır.

4.3.3. Yaprak eksplantından rejenerasyon

Steril Stevia rebaudiana Bertoni bitkisinden elde edilen yaprak eksplantları farklı şeker tipi ve dozları bulunan MS ortamlarına aktarılmıştır. Kültürlerin 8hafta sonunda kallus oluşturma durumları belirlenmiştir. Elde edilen veriler yüzde olarak ifade edilerek ortalama değerler varyans analizine tabi tutularak yaprak eksplantlarında kallus oluşum yüzdeleri Çizelge 4.8’de verilmiştir. Varyans analiz sonuçlarına göre şeker tipi, uygulama dozu ve şeker tipi x uygulama dozu interaksiyonu %1 önemli bulunmuştur. Çizelge 4.8’e bakıldığında şeker tipi en yüksek kallus oluşum yüzdesi sakkaroz ortamından (%56.29) elde edilmiştir. 20 mg/l şeker dozu ortalaması (%63.33) en yüksek kallus oluşturma yüzdesini vermiştir. Şeker tipi ve uygulama dozu interaksiyonu olarak en yüksek değer 73.33 mg/l ile 20 g/l sakkaroz ortamından elde edilirken en düşük değer hiçbir gelişim göstermeyen 40 g/l maltoz ortamında gözlemlenmemiştir.

Çizelge 4.8. Yaprak eksplantlarında kallus oluşum yüzdesi (%)

20 30 40

Sakkaroz 73.33a 35.54b 60.00ab 56.29

Maltoz 53.33ab 55.55ab 0.00c 36.30

Ort. 63.33a 45.55ab 30.00b

LSD %1 DOZ: 23.35 LSD %1 TİP x DOZ: 33.02

Yaprak eksplantlarından elde edilen kallusların ortalama kallus ağırlıkları varyans analizine tabi tutularak Çizelge 4.9’da verilmiştir. Varyans analiz sonuçlarına

(28)

göre uygulama dozu ve şeker tipi x uygulama dozu interaksiyonu olarak %1 önemli bulunurken şeker tipi önemsiz çıkmıştır. Çizelge 4.9’ya bakıldığında 20 mg/l en yüksek şeker dozu yüzdesini (%150.00) vermiştir. Şeker tipi dozu interaksiyonu en yüksek 176 mg/l ile 40 g/l sakkaroz ortamından elde edilirken en düşük değer hiçbir gelişim göstermeyen 40 g/l maltoz ortamında gözlenmemiştir. Çalışma da kallus oluşum yüzdesi ve kallus ağırlığı olarak sakkaroz kullanımının daha etkili olduğu görülmüştür.

Çizelge 4.9. Yaprak eksplantından elde edilen kallus ağırlığı (mg)

20 30 40

Sakkaroz 153.33a 50.00b 176.67a 126.67

Maltoz 146.67a 156.67a 0.00b 101.11

Ort. 150.00a 103.33ab 88.33b

LSD %1 .DOZ: 52.08 LSD %1 TİP x DOZ:73.66

ġekil 4.4. Yaprak eksplant rejenrasyonu

20 30 40

Sakkaroz 112.39 17.75 106.00

(29)

Yaprak eksplant rejenerasyonu için kallus verimliliği bakımından en etkili ortam sakkaroz ortamı ve doz olarak 20 g/l olduğu görülmektedir.

4.4. Köklendirme ve DıĢ Ortama Aktarma

Kök gelişimi için farklı hormon 1 mg/l IBA ve 1 mg/l NAA bulunan MS ortamlarında 2-3 cm uzunluğundaki sürgünler kültüre alınmıştır. Her iki ortamda 4 haftalık kültür süresinin sonunda fidelerin sağlıklı ve normal görüntüde kök oluşturduğu gözlemlenmiştir. Köklenmeyle birlikte gelişimini tamamlayan bitkicikler magenta kutularından çıkarılarak kökleri musluk suyunda zarar vermeden yıkanmış ve besin ortamı kalıntılarından temizlenmiştir. Fideler sonrasında steril torf ile doldurulmuş viyollere aktarılmıştır. Literatürlere bakıldığında Stevia rebaudiana Bertoni bitkisinde doku kültürü ortamında sürgün ve kök gelişimi genelde bitkilerin nod ve internod sürgün ucu kısımları kullanılarak araştırılmıştır (Janarthanam ve ark., 2009; Sairkar ve ark., 2009; Patel ve ark., 2009; Preethi ve ark., 2011; Razak ve ark., 2014). Elde ettiğimiz sonuçlar ve kullandığımız eksplant tipi belirtilen literatürler ile uyum göstermiştir.

(30)

4.5. Steviol Glikozit Analizleri

Farklı kültür ortamlardan elde edilen sekiz haftalık kalluslar Selçuk Üniversitesi İleri Teknoloji ve Araştırma Merkezinde liyafilizatörde kurutularak iyice toz haline getirildikten sonra steviol glikozit içeriklerinin belirlenmesi amacıyla Adana Alparslan Türkeş Bilim ve Teknoloji Üniversitesine gönderilmiştir. Yapılan analiz sonuçlarına göre örneklerde steviol glikozit içeriğine rastlanmamıştır. HPLC analizleri sonucunda elde edilen kromotograflardan bazıları aşağıda verilmiştir.

ġekil 4.5. Stevia rebaudiana Bertoni bitkisinden elde edilen standart steviol glikozit kromotograf grafiği

(31)

ġekil 4.6. 20 g/l sakkaroz ortamında bulunan yaprak eksplantlarından elde edilen kallus kromotograf grafiği

ġekil 4.7 30 g/l sakkaroz ortamında bulunan yaprak eksplantlarından elde edilen kallus kromotograf grafiği

ġekil 4.8. 40 g/l sakkaroz ortamında bulunan yaprak eksplantlarından elde edilen kallus kromotograf grafiği

(32)

ġekil 4.9. 20 g/l maltoz ortamında bulunan yaprak eksplantlarından elde edilen kallus kromotograf grafiği

ġekil 4.10. 30 g/l maltoz ortamında bulunan yaprak eksplantlarından elde edilen kallus kromotograf grafiği

(33)

ġekil 4.11. 40 g/l maltoz ortamında bulunan gövde eksplantlarından elde edilen kallus kromotograf grafiği

Farklı şeker ortamlarında 8 hafta kültür sonunda Stevia rebaudiana Bertoni bitkisinden elde edilen kallusların steviol glikozit içerikleri ölçülmüş ve kallusların hiçbirinde steviol glikozit içeriğine rastlanmamıştır. Bu durum daha önce benzer çalışmalarda gözlemlenmiştir. Fakat literatürlere bakıldığı zaman Durak (2017) yaptığı çalışmada bazı ortamlarda yaprak ve nod eksplantlarından alınan kalluslarda steviol glikozit içeriklerine rastlamazken BAP ortamındaki sürgünlerde steviol glikozitlere rastlamışlardır. Bu çalışmada Sakkaroz ve maltoz ortamlarının steviol glikozit üretimini uyarmadığı gözlemlenmiştir. Ayrıca literatürlerde bitkinin yeterli boyutlara geldiği zaman yapraktan alınan eksplantlarda steviol glikozitlere rastlanmaktadır. Daha sonra ki çalışmalarda farklı boyutlarda eksplantlar alınıp farklı elisatör uygulamaları denenebilir.

(34)

5. SONUÇLAR VE ÖNERĠLER

Bu çalışmada Stevia rebaudiana Bertoni bitkisinin doku kültürü teknikleriyle in vitro üretim yöntemi gerçekleştirilmiştir. Stevia rebaudiana Bertoni bitkisinin tohum çimlendirilmesi üzerine bazı uygulamalar denenmiş ancak tohumlardaki düşük çimlenme oranından dolayı yapılan uygulamalardan çimlenme elde edilememiştir. Bu yüzden steril eksplant kaynağı elde edebilmek için internet üzerinden elde edilen fidelerin nod kısımlarını kullanarak steril fideler elde edildi. Kök, yaprak ve gövde regenerasyonu için en iyi kallus oluşum yüzdesi sakkaroz ortamlarından 20g/l dozundan elde edilmiştir. Kök eksplantlarından alınan en iyi kallus ağırlıkları şeker tipi olarak maltoz ortamından 40g/l dozunun etkili olduğu sonucuna varılmıştır. Gövde eksplantarından alınan en iyi kallus ağırlığı maltoz ortamlarından 20g/l dozundan elde edilmiş ve doz oranı düştükçe kallus ağırlığında artış görülmüştür. Yaprak eksplantlarından alınan en iyi kallus ağırlığı sakkaroz ortamlarından 40g/l dozundan elde edilmiştir. Yaprak rejenerasyonu için sakkaroz dozunu artırdığımız zaman kallus ağırlıklarının arttığı görülmüştür. Böylece kallus oluşum yüzdesi ve kallus ağırlıkları için en etkili şeker tip ve dozları belirlenmiştir.

Sonuç olarak; tüm eksplant tipleri farklı sakkaroz ve maltoz dozlarında rejenerasyon tepkisi vererek kallus meydana getirmiştir. Kallus verimliliği açısından değerlendirildiğinde kök eksplantında 40 g/l maltoz ortamı, gövde eksplantında 20 g/l maltoz ortamı ve yaprak eksplantında 20 g/l sakkaroz ortamı etkin kallus verimliliği için tavsiye edilebilir.

Farklı şeker tipleri ve dozlarından elde edilen kallus kültürlerinde steviol glikozit içeriklerine bakıldığı zaman kalluslarda steviol glikozit rastlanmamıştır. Yapılan çalışmada şeker tip ve dozları bitkide steviol glikozit içeriğini uyarmadığı sonucuna varılmıştır. Bu gibi in vitro ve in vivo çalışmalar yapılarak Stevia rebaudiana Bertoni bitkisi çoğaltılarak farklı uyarıcı elisatörler denenebilir.

(35)

KAYNAKLAR

Ahmed, M., Salahin, M., Karim, R., Razvy, M., Hannan, M., Sultana, R., Hossain, M. ve Islam, R., 2007, An efficient method for in vitro clonal propagation of a newly introduced sweetener plant (Stevia rebaudiana Bertoni.) in Bangladesh, American-Eurasian Journal of Scientific Research, 2 (2), 121-125.

Alhady, M., 2011, Micropropagation of Stevia rebaudiana Bertoni. A new sweetening crop in Egypt, Global Journal of Biotechnology & Biochemistr, 6 (4), 178-182. Argueta, V.A. and Cano, A.L., 1993, El Atlas de las plantas de la medicina tradicional

mexicana. La investigation cientifica de la herbolaria medicinal mexicana, Secretaria de Salud. pp: 103-113, Mexico, DF.

Atalay, E., Erisen, S., Yorgancilar, M. ve Tanur, M., 2011, Micropropagation of Stevia rebaudiana Bertoni, Current Opinion in Biotechnology (22), S135.

Bayraktar, M., Naziri, E., Akgun, I. H., Karabey, F., Ilhan, E., Akyol, B., Bedir, E. ve Gurel, A., 2016, Elicitor induced stevioside production, in vitro shoot growth, and biomass accumulation in micropropagated Stevia rebaudiana, Plant Cell Tissue and Organ Culture, 127 (2), 289-300.

Das, A., Gantait, S. ve Mandal, N., 2011, Micropropagation of an elite medicinal plant; Stevia rebaudiana Bert. Int J. Agric. Res, 6, 40-48.

Dey, A., Kundu, S., Bandyopadhyay, A. ve Bhattacharjee, A., 2013, Efficient micropropagation and chlorocholine chloride induced stevioside production of Stevia rebaudiana Bertoni, Comptes Rendus Biologies, 336 (1), 17-28.

Cortes, R., Hernandez-Ceruelos, A., Torres-Valencia, J. M., Gonzales-Avila M., Arriaga-Alba, M. ve Mmadrigal, Bujaidar, E., 2007, Antimutagenicity of Stevia pilosa and Stevia eupatoria evaluated with the ames test. Toxicology in vitro, 21, 4, 691-697.

Durak, Z., 2017, Stevia rebaudiana Bertoni (Asteraceae)'da In Vitro Üretim Çalışmaları, Karadeniz Teknik Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü, 34.

Ghorbani, T., Kahrizi, D., Saeidi, M. ve Arji, I., 2017, Effect of sucrose concentrations on Stevia rebaudiana Bertoni tissue culture and gene expression, Cellular and Molecular Biology, 63 (8), 33-37.

Goettemoeller, J., and Ching, A., 1999, Seed Germination in Stevia rebaudiana. Perspects New Crops and New Uses. 510-511.

Gupta, R. and Chakrabarty, S.K., 2013, Gibberellic acid in plant. Still a mystery unresolved. Plant Signal Behav. 8(9): e25504.

İnanç, A.L. ve Çınar, İ., 2009, Alternatif Doğal Tatlandırıcı Stevya GIDA, 34(6): 411-415.

İnanç, M., Khan, M.K., Pandey, A., Tanur Erkoyuncu, M., Hamurcu, M., Yorgancılar, M., and Hakkı, E.E., 2018, Stevia: A New Generation Natural Sweetener, Internatıonal Agricultural, Biological & Life Science Conference, Edirne, Turkey.

Janarthanam, B., Gopalakrishnan, M., Lakshmi Sai, G. and Sekar, T., 2009, Plant Regeneration from leaf Derived Callus of Stevia rebaudiana Bertoni Plant Tissue Cult. Biotech. 19(2): 133-141.

Javed, R. ve Gurel, E., 2019, Salt stress by NaCl alters the physiology and biochemistry of tissue culture-grown Stevia rebaudiana Bertoni, Turkish Journal of Agriculture and Forestry, 43 (1), 11-20.

(36)

Karim, M. Z., Uesugi, D., Nakayama, N., Hossain, M. M., Ishihara, K. ve Hamada, H., 2016, Identification of Stevioside Using Tissue Culture-Derived Stevia (Stevia rebaudiana) Leaves, Biochemistry Insights, 9, 33-37.

Kim, J., Choi, Y.H., 2002, Use of stevioside and cultivation of Stevia rebaudiana in Korea. In: Stevia, the Genus Stevia. Medicinal and Aromatic Plants-Industrial Profiles,(Kinghorn AD Ed.) Taylor and Francis, London/NewYork, 196-202. Kovacevic, D.B., Maras, M., Barba, F.J., Granato, D., Roonhinejad, S., Mallikarjunan,

K., Montesano, D., Lorenzo, J.M., Putnik, P., 2018, Innovative tecnologies for the recovery of phytochemicals from Stevia rebaudiana Bertoni leaves: a review, Food Chem. 268, 513-521.

Kumari, M. ve Chandra, S., 2015, Stevioside glycosides from in vitro cultures of Stevia rebaudiana and antimicrobial assay, Brazilian Journal of Botany, 38 (4), 761-770.

Lemus-Mondaca, R., Vega-Gálvez, A., Zura-Bravo, L., Ah-Hen, K., 2012, Stevia rebaudiana Bertoni, source of a high potency natural sweetener: A comprehensive review on the biochemical, nutrional and functional aspects. Food Chemistry 132: 1121-1132.

Martins, P.M., Thorat, B.N., Lanchote, A.D., Freitas, L.A.P., 2016, Turbo extraction of glycosides from Stevia rebaudiana using a fractional factorial design. Rev. Bras. Farmacogn. 2, 247-253.

MIZUTANI, K. and TANAKA, O., 2002, Use of Stevia rebaudiana sweeteners in Japan. In: Kinghorn, A.D., (Ed.), Stevia, the genus Stevia. Medicinal and Aromatic Plants – Industrial Profiles, vol. 19. Taylor and Francis, pp. 178-195, London and NY. Okawa, M. Kinjo, J. Nohara, T. and Masature, O., 2001, DPPH (1,1- diphenyl-2-

picrylhydrazyl) radical scavengıng activity of Xavonaid optained from some medicinal plants. Biological & Pharmaceutical Bulletin, 24:1202-1205.

Pal, P.K, Prasad, R, Pathania, V., 2013, Effect of decapitation and nutrient applications on shoot branching, yield and accumulation of secondary metabolites in leaves of Stevia rebaudiana Bertoni , J. Plant Physiol, 170: 1526-1535.

Patel, R.M. and Shah, R.R., 2009, Regeneration of Stevia plant through callus culture. Indian J pharm Sci. 71:46-50.

Pratibha, G., Satyawati, S. and Sanjay, S., 2010, Micropropagatiton of Stevia rebaudiana (natural sweetener) using Kinetin for Steviol Glycoside Production. Research Journal of Biotechnology. 5(1).

Preethi, D., Sridhar, T.M., and Naidu, C.V., 2011, Efficient Protocol for Indirect Shoot Regeneration from Leaf Eksplants of Stevia rebaudiana (Bert.)- An Important Calorie Free Biosweetner. Journal of Phytology. 3(5):56-60.

Puri, M., Sharma., D. and Tiwari, A.K. 2011, Downstream processing of stevioside and its potential applications. Biotechnology Advances. Biotechnology Advances, 29:781-791.

Razak, U.N.A.A., Ong, C. B., Yu, T.S. ve Lau, L.K., 2014, In vitro Micropropagation of Stevia rebaudiana Bertoni in Malaysia, Brazilian Archives of Biology and Technology, 57 (1), 23-28.

Salazar, V.A.G., Encalada S.V., Cruz, A.C., 2018, Campos Stevia rebaudiana: a sweetener and potential bioactive ingredient in the development of functional cookies. J. Funct. Foods 44, 183-190.

Sairkar, P., Chandravanshi, MK., Shukla, NP., and Mehrotra, NN., 2009, Mass Production of an economically important medicinal plant Stevia rebaudiana using in vitro propagation techniques Journal of Medicinal Plants Research 3(4): 266-270.

(37)

Samadpourrigani, E., 2014, Çukurova Koşullarında Şeker Otu (Stevia rebaudiana B.)'nda Farklı Ekim Sıklıkları, Biçim Zamanları ve Biçim Sayılarının Verim ve Kaliteye Etkisi. Çukurova Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Yüksek Lisans Tezi.

Shock, C.C., 1982, Rebaudi's stevia: natural noncaloric. Shock 4-5.

Singh, P., Dwivedi, P., ve Atri, N., 2014, In Vitro Shoot Multiplication of Stevia and Assessment of Stevioside Content and Genetic Fidelity of the Regenerants, Sugar Tech, 16 (4), 430-439.

Sivaram, L., ve Mukundam, U., 2003, In vitro culture studies on Stevia rebaudiana, In vitro Cell Dev Biol Plant 39, 520-523.

Sözmen, E., 2015, Şeker otu (Stevia rebaudiana Bertoni) Bitkisinin Bazı Verim ve Kalite Özellikleri Üzerine Farklı Azot Dozlarının Etkisi, Akdeniz Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü, 111.

Srivastava, P.S., ve Steinbayer, A., 1981, Regenaration Of Birch Plants Catkin Tissue Cultures, Plant Science Letters, 22.

Swithers, S. E., 2013, Artificial sweeteners produce the counterintuitive effect of inducing metabolic derangements, Trends in Endocrinology and Metabolism, 24 (9), 431-441.

Tadhani, M. B., Patel, V. H., ve Subhash, R., 2007, In vitro antioxidant activities of Stevia rebaudiana leaves and callus, Journal of Food Composition and Analysis, 20 (3-4), 323-329.

Turgut, K., Ucar, E., Tutuncu, B., Ozyiğit, Y., 2015, Stevia rebaudiana Bertoni could be an alternative crop in the Mediterranean region of Turkey In Geuns, J.M.C., Ceunen, S. (Eds), Stevia Growth in Knowledge and Taste, Proceedings of the 8th EUSTAS Stevia Symposium.

Vives, K., Andujar, I., Lorenzo, J.C., Comcepcion, O., Hernandez, M., Escalona, M., 2017, Comparison of different in vitro micropropagation methods of Stevia rebaudiana B. including temporary immersion bioreactor. Plant Cell Tiss Organ Cult 131: 195-199.

Yadav, A.K., Sing, S.C., Dhyani, D., Ahuja, P.S., 2011, Review on the improvement of Stevia rebaudiana. Can. J. Plant Sci. 91, 1-27.

Yıldırım, K., 2017, Stevia rebaudiana Bertoni Bitkisinin İn Vitro Üretim Potansiyeli ve Tokat Şartlarına Adaptasyonu. Gaziosmanpaşa Üniversitesi Ziraat Fakültesi Dergisi, 34(1), 238-251.

Yücesan, B., Büyükgöçmen, R., Mohammed, A., Sameeullah, M., Altuğ, C., Gürel, S., Gürel, E., 2016a, An efficient regeneration system and Steviol glicoside analiysis of Stevia rebaudiana Bertoni, a source of natural highintensity sweetener. In Vitro Cell.Dev.Biol. Plant 52:330-337.

Yücesan, B., Mohamthed, A., Buyukgocmen, R., Altug, C., Kavas, O., Gürel, S., ve Gürel, E., 2016b, In vitro and ex vitro propagation of Stevia rebaudiana Bertoni with high Rebaudioside-A content-A commercial scale application, Scientia Horticulturae, 203, 20-28.

(38)

EKLER

EK-1 Kök kallus oluşum yüzdesi varyans analiz tablosu

Varyasyon Kaynağı SD Kareler Toplamı Kareler Ortalaması F Değeri P Değeri Şeker Tipi 1 800.013 800.013 4.4998 0.0554 Şeker Dozu 2 4820.090 2410.045 13.5556 0.0008** İnteraksiyon 2 6459.198 3229.599 18.1653 0.0002** Hata 12 2133.476 177.790 Genel 17 14212.77

ns: önemsiz (not significant)

*: önemli %5 seviyesinde (significant at level 5%) **: önemli %1 seviyesinde (significant at level 1%)

EK-2 Kök kallus ağırlığı varyans analiz tablosu

Varyasyon Kaynağı SD Kareler Toplamı Kareler Ortalaması F Değeri P Değeri Şeker Tipi 1 13888.33 13888.33 41.6678 0.000** Şeker Dozu 2 14777.022 7238.511 21.7170 0.0001* İnteraksiyon 2 3078.067 1539.033 4.6174 0.0326* Hata 12 3999.733 333.311 Genel 17 35443.157

(39)

EK-3 Yaprak kallus oluşum yüzdesi varyans analiz tablosu Varyasyon Kaynağı SD Kareler Toplamı Kareler Ortalaması F Değeri P Değeri Şeker Tipi 1 1799.540 1799.540 10.2690** 0.0076** Şeker Dozu 2 3337.898 1668.949 9.5238** 0.0033** İnteraksiyon 2 4801.080 2400.540 136986** 0.0008** Hata 12 2102.875 175.240 Genel 17 12041.392

EK-4 Yaprak kallus ağırlığı varyans analiz tablosu

Varyasyon Kaynağı SD Kareler Toplamı Kareler Ortalaması F Değeri P Değeri Şeker Tipi 1 2938.889 2938.889 3.3694 0.0913* Şeker Dozu 2 12411.111 6205.556 7.1146 0.0092** İnteraksiyon 2 61011.111 30505.556 34.9745 0.0000** Hata 12 10466.667 872.222 Genel 17 86827.778

(40)

EK-5 Gövde kallus oluşum yüzdesi varyans analiz tablosu Varyasyon Kaynağı SD Kareler Toplamı Kareler Ortalaması F Değeri P Değeri Şeker Tipi 1 3025.382 3025.382 13.9249 0.0029** Şeker Dozu 2 6374.647 3187.324 14.6703 0.0006** İnteraksiyon 2 656.958 328.479 1.5119 0.2597 Hata 12 2607.171 217.264 Genel 17 12664.158

EK-6 Gövde kallus ağırlığı varyans analiz tablosu

Varyasyon Kaynağı SD Kareler Toplamı Kareler Ortalaması F Değeri P Değeri Şeker Tipi 1 56.889 56.889 0.3294 -Şeker Dozu 2 14630.778 7315.389 42.3535 0.0000** İnteraksiyon 2 33573.444 16786.722 97.1891 0.0000** Hata 12 2072.667 172.722 Genel 17 50333.778

(41)

ÖZGEÇMĠġ

KĠġĠSEL BĠLGĠLER

Adı Soyadı : Ayşe SOYHAN

Uyruğu : TC

Doğum Yeri ve Tarihi : Seydişehir-19.10.1992

Telefon : 05380217321

Faks :

e-mail : aysealtindag0@gmail.com EĞĠTĠM

Derece Adı, Ġlçe, Ġl Bitirme Yılı

Lise : Cumhuriyet Lisesi, Selçuklu Konya 2010

Üniversite : Selçuk üniversitesi 2014