T.C. EGE ÜNİVERSİTESİ. Sağlık Bilimleri Enstitüsü. Stevia rebaudiana Bertoni Yaprakları Üzerinde

(1)

T.C.

EGE ÜNİVERSİTESİ Sağlık Bilimleri Enstitüsü

Farmakognozi Anabilim Dalı Rahmi TOKER

Stevia rebaudiana Bertoni Yaprakları Üzerinde

Kalite Kontrol Çalışmaları ve Biyolojik Aktivite Araştırmaları

Yüksek Lisans Tezi

(2)

T.C.

EGE ÜNİVERSİTESİ Sağlık Bilimleri Enstitüsü

Stevia rebaudiana Bertoni Yaprakları Üzerinde

Kalite Kontrol Çalışmaları ve Biyolojik Aktivite Araştırmaları

Farmakognozi Ana Bilim Dalı Farmakognozi

Rahmi TOKER

Danışman

Prof. Dr. Hüsniye KAYALAR

İzmir

(3)

(4)

Önsöz

Fen Fakültesi Biyoloji bölümü Botanik Anabilim Dalı öğrencisi olmamın da etkisiyle Türkiye’de yabani olarak yayılış gösteren ya da kültürü yapılan, bilime ve ülke ekonomisine katma değeri olabilecek bitkileri araştırmak ana amacım olmuştur. Bu araştırmalarım neticesinde 2008 yılında bir tarımsal makalede Stevia rebaudiana Bertoni (S. rebaudiana) bitkisinin incelendiğini gördüm. S. rebaudiana, diyabet hastalarının kullanabileceği, güvenli ve tarımsal açıdan da katma değeri yüksek bir bitki olması nedeniyle oldukça ilgimi çekti. Bu yüzden 2009 yılında lisans bitirme tezi konusu olarak bu bitkiyi seçtim. S. rebaudiana’nın tohumlarından fide üretimi, doku kültürü ve biyolojik inceleme çalışmalarını gerçekleştirdim. 2011 yılında mezun olunca değerli hocalarımın yönlendirmesiyle çalışmalarımı ayrıntılı yapabilmek için Ege Üniversitesi Eczacılık Fakültesi Farmakognozi Anabilim Dalı’nda yüksek lisans eğitimime başladım. ―Stevia rebaudiana Bertoni Yaprakları Üzerinde Kalite Kontrol Çalışmaları ve Biyolojik Aktivite Araştırmaları’’ konulu tez çalışmamda, ülkemizde kültüre alınan Stevia bitkisinin yapraklarından hazırlamış olduğum droglarda farmakognozik araştırmalar gerçekleştirdim. Bu kapsamda, kurutmada kayıp, kül tayini, elementel içerik tayininin yanı sıra antimikrobiyal ve antioksidan aktivite ile HPLC-DAD yöntemi ile steviozit miktarını beş farklı yerden temin edilen tohumlardan yetiştirilmiş olan S. rebaudiana bitki örneklerinde araştırdım. S. rebaudiana bitkisi ile ileride yapılacak olan araştırmalara tez çalışmamın kapsamlı bir kaynak oluşturmasını ümit ediyorum

İzmir, 05.02.2019 Rahmi Toker

(5)

Özet

Stevia rebaudiana Bertoni Yaprakları Üzerinde Kalite Kontrol Çalışmaları ve Biyolojik Aktivite Araştırmaları

Bu tez çalışmasında, Güney Amerika kökenli, özellikle Paraguay ve Brezilya’ya özgü bir bitki olan Stevia rebaudiana Bertoni üzerinde farmakognozik araştırmalar yapılmıştır. Farklı ülkelerden temin edilmiş olan tohumlardan, Turgutlu, Manisa’da yetiştirilen bitkilerin yapraklarından hazırlanan droglar üzerinde kalite kontrol, miktar tayini çalışmaları ve biyolojik aktivite araştırmaları yapılmıştır. Avrupa Farmakopesi’nde yer alan yöntemler esas alınarak kalite kontrol ve miktar tayini çalışmaları yürütülmüştür. Kurutmada kayıp, total kül, hidroklorik asitte çözünmeyen kül, sülfat külü tayini, X-ray floresans spektroskopisi ile elementel içerik tayini ve yüksek basınçlı sıvı kromatografisi (HPLC) ile steviozit miktarı tayin edilmiştir.

Ayrıca toplam fenolik madde ve toplam flavonoit miktarı da tespit edilmiştir.

Antimikrobiyal aktivite ve antioksidan aktivite sırasıyla mikrodilüsyon yöntemi ile ve DPPH radikali yakalama yöntemi ile belirlenmiştir.

Anahtar Kelimeler; Stevia rebaudiana, steviozit, antioksidan, antimikrobiyal, HPLC, X-ray floresans spektroskopi

(6)

Abstract

Quality Control Studies and Biological Activity Research On Stevia rebaudiana Bertoni Leaves

In this thesis, pharmacognosy research has been conducted on Stevia rebaudiana Bertoni, a South American originated plant that is native to Paraguay and Brazil.

Quality control, quantitative analyses and biological activity researches were conducted on the leaves prepared from the plants cultivated in Turgutlu, Manisa of which the seeds were obtained from five different countries. Quality control and quantitative analyses were carried out based on the methods in European Pharmacopoeia. Loss on drying, total ash, ash insoluble in hydrochloric acid, determination of sulfate ash, determination of elemental content by X-ray fluorescence spectroscopy and quantitative determination of stevioside by high pressure liquid chromatography (HPLC) were conducted. Total phenolics and total flavonoid content were also determined. Antimicrobial and antioxidant activities were determined by microdiution method and DPPH radical scavenging capacity respectively.

Keywords; Stevia rebaudiana Bertoni, stevioside, antioxidant, antimicrobial, HPLC, X-ray fluorescence spectroscopy

(7)

İçindekiler

Önsöz ... II Özet... III Abstract ... IV İçindekiler ... V Tablolar Dizini ... VII Şekiller Dizini ... XVIII Kısaltmalar Listesi ... XIX

Giriş ... 2

Genel Bilgiler ... 4

2.1. Kalite Kontrol, Biyolojik Aktivite Ve Miktar Tayini Çalışmaları ...11

Gereç ve Yöntem ...14

3.1. Kalite Kontrol ve Miktar Tayini Araştırmaları ...14

3.1.1. Gereç ...14

3.1.2. Yöntemler ...15

3.1.2.1. Bitki Ekstrelerinin Hazırlanışı ...15

3.1.2.2. Kurutmada Kayıp Miktar Tayini ...15

3.1.2.3. Total Kül Miktar Tayini ...16

3.1.2.4. Sülfat Külü Miktar Tayini ...16

3.1.2.5. Hidroklorik Asitte Çözünmeyen Kül Miktar Tayini ...17

3.1.2.6. Yüksek Basınçlı Sıvı Kromatografisi (HPLC) ile Steviozit Miktar Tayini ...17

3.1.2.7. X-ray Floresans Spektoskobi ile Element Analizi ...18

3.2 Biyolojik Aktivite Tayinleri ...18

3.2.1. Gereç ...18

3.2.2. Yöntem ...19

3.2.2.1. Bitki Ekstrelerinin Hazırlanışı ...19

3.2.2.2. Antioksidan Aktivite ...19

3.2.2.3. Toplam Fenolik Madde Analizi ...20

3.2.2.4. Toplam Flavonoit Analizi ...20

3.2.2.5. Antimikrobiyal Aktivite Tayini ...20

Bulgular ...22

(8)

4.1. Stevia rebaudiana Bertoni Yaprakları Üzerinde Yapılan Kalite Kontrol ve

Miktar Tayini Çalışmalarına Ait Bulgular ...22

4.1.1. Kurutmada Kayıp Miktarı ...22

4.1.2. Total Kül Miktar Tayini Sonuçları...24

4.1.3. Sülfat Külü Miktar Tayini Sonuçları ...26

4.1.4. HCl’de Çözünmeyen Kül Miktar Tayini Sonuçları ...29

4.1.5 Yüksek Basınçlı Sıvı Kromatografisi (HPLC) ile Steviozit Miktar Tayini 31 4.1.6. X-ray Floresans Spektoskobi ile Element Analizi ...32

4.2 Stevia rebaudiana Bertoni Yaprakları Üzerinde Yapılan Biyolojik Aktivite Tayinlerine Ait Bulgular ...43

4.2.1. Antioksidan Aktiviteye Ait Bulgular ...43

4.2.1.1. DPPH Radikali Yakalama Aktivitesine Ait Bulgular ...43

4.2.1.2 Toplam Fenolik Madde Analizine Ait Bulgular ... 105

4.2.1.3. Toplam Flavonoit Analizine Ait Bulgular ... 115

4.2.2. Antimikrobiyal Aktivite Tayinine Ait Bulgular ... 125

Tartışma ... 130

Sonuç ve Öneriler... 138

Kaynaklar ... 140

Ekler ... 151

Teşekkür ... 152

Özgeçmiş ... 153

(9)

Tablolar Dizini

Tablo 1 Kurutulmuş S. rebaudiana yapraklarının nem ve kül analizleri ...12

Tablo 2 Kurutulmuş S. rebaudiana yapraklarında % glikozit miktarı ...13

Tablo 3 S. rebaudiana’nın farklı yaprak ekstrelerinin DPPH inhibisyon yüzdeleri...13

Tablo 4 1S kodlu örneğe ait kurutmada kayıp miktar tayini sonuçları ...22

Tablo 7 4Skodlu örneğe ait kurutmada kayıp miktar tayini sonuçları ...23

Tablo 8 5Skodlu örneğe ait kurutmada kayıp miktar tayini sonuçları ...24

Tablo 9 1Skodlu örneğe ait % total kül miktar tayini sonuçları ...24

Tablo 14 1S kodlu örneğe ait % sülfat külü miktar tayini sonuçları ...26

Tablo 19 1S kodlu örneğe ait % hidroklorik asitte çözünmeyen kül miktar tayini sonuçları ...29

Tablo 24 Örneklerin HPLC kromatogramında steviozite karşılık gelen retansiyon zamanında okunan alan değerleri ve droglarda hesaplanan % steviozit miktarları ....32

Tablo 25 1SD kodlu örneğin elementel analizi ...33

Tablo 26 1SAD kodlu örneğin elementel analizi ...34

(10)

Tablo 35 1SAD kodlu örneğin 0,25 mg/ml konsantrasyonda % DPPH inhibisyon ve α-Tokoferol ekivalen değeri ...44

Tablo 38 1SD kodlu örneğin 0,25 mg/ml konsantrasyonda % DPPH inhibisyon ve α- Tokoferol ekivalen değeri ...45

Tablo 41 1SE kodlu örneğin 0,25 mg/ml konsantrasyonda % DPPH inhibisyon ve α- Tokoferol ekivalen değeri ...47

Tablo 44 1SM kodlu örneğin 0,25 mg/ml konsantrasyonda % DPPH inhibisyon ve α- Tokoferol ekivalen değeri ...48

Tablo 45 1SM kodlu örneğin 0,50 mg/ml konsantrasyonda % DPPH inhibisyon ve α- Tokoferol ekivalen değeri ...49 Tablo 46 1SM kodlu örneğin 1,00 mg/ml konsantrasyonda % DPPH inhibisyon ve α-

(11)

Tablo 48 2SAD kodlu örneğin 0,50 mg/ml konsantrasyonda % DPPH inhibisyon ve α-Tokoferol ekivalen değeri ...50 Tablo 49 2SAD kodlu örneğin 1,00 mg/ml konsantrasyonda % DPPH inhibisyon ve α-Tokoferol ekivalen değeri ...51 Tablo 50 2SD kodlu örneğin 0,25 mg/ml konsantrasyonda % DPPH inhibisyon ve α- Tokoferol ekivalen değeri ...51 Tablo 51 2SD kodlu örneğin 0,50 mg/ml konsantrasyonda % DPPH inhibisyon ve α- Tokoferol ekivalen değeri ...52 Tablo 52 2SD kodlu örneğin 1,00 mg/ml konsantrasyonda % DPPH inhibisyon ve α- Tokoferol ekivalen değeri ...52 Tablo 53 2SE kodlu örneğin 0,25 mg/ml konsantrasyonda % DPPH inhibisyon ve α- Tokoferol ekivalen değeri ...53 Tablo 542SE kodlu örneğin 0,50 mg/ml konsantrasyonda % DPPH inhibisyon ve α- Tokoferol ekivalen değeri ...53 Tablo 55 2SE kodlu örneğin 1,00 mg/ml konsantrasyonda % DPPH inhibisyon ve α- Tokoferol ekivalen değeri ...54 Tablo 56 2SM kodlu örneğin 0,25 mg/ml konsantrasyonda % DPPH inhibisyon ve α- Tokoferol ekivalen değeri ...54 Tablo 57 2SM kodlu örneğin 0,50 mg/ml konsantrasyonda % DPPH inhibisyon ve α- Tokoferol ekivalen değeri ...55 Tablo 58 2SM kodlu örneğin 1,00 mg/ml konsantrasyonda % DPPH inhibisyon ve α- Tokoferol ekivalen değeri ...55 Tablo 59 3SAD kodlu örneğin 0,25 mg/ml konsantrasyonda % DPPH inhibisyon ve α-Tokoferol ekivalen değeri ...56 Tablo 60 3SAD kodlu örneğin 0,50 mg/ml konsantrasyonda % DPPH inhibisyon ve α-Tokoferol ekivalen değeri ...56 Tablo 61 3SAD kodlu örneğin 1,00 mg/ml konsantrasyonda % DPPH inhibisyon ve α-Tokoferol ekivalen değeri ...57 Tablo 62 3SD kodlu örneğin 0,25 mg/ml konsantrasyonda % DPPH inhibisyon ve α- Tokoferol ekivalen değeri ...57 Tablo 63 3SD kodlu örneğin 0,50 mg/ml konsantrasyonda % DPPH inhibisyon ve α- Tokoferol ekivalen değeri ...58 Tablo 64 3SD kodlu örneğin 1,00 mg/ml konsantrasyonda % DPPH inhibisyon ve α- Tokoferol ekivalen değeri ...58

(12)

Tablo 65 3SE kodlu örneğin 0,25 mg/ml konsantrasyonda % DPPH inhibisyon ve α- Tokoferol ekivalen değeri ...59 Tablo 66 3SE kodlu örneğin 0,50 mg/ml konsantrasyonda % DPPH inhibisyon ve α- Tokoferol ekivalen değeri ...60 Tablo 67 3SE kodlu örneğin 1,00 mg/ml konsantrasyonda % DPPH inhibisyon ve α- Tokoferol ekivalen değeri ...60 Tablo 68 3SM kodlu örneğin 0,25 mg/ml konsantrasyonda % DPPH inhibisyon ve α- Tokoferol ekivalen değeri ...61 Tablo 69 3SM kodlu örneğin 0,50 mg/ml konsantrasyonda % DPPH inhibisyon ve α- Tokoferol ekivalen değeri ...61 Tablo 70 3SM kodlu örneğin 1,00 mg/ml konsantrasyonda % DPPH inhibisyon ve α- Tokoferol ekivalen değeri ...62 Tablo 71 4SAD kodlu örneğin 0,25 mg/ml konsantrasyonda % DPPH inhibisyon ve α-Tokoferol ekivalen değeri ...62 Tablo 72 4SAD kodlu örneğin 0,50 mg/ml konsantrasyonda % DPPH inhibisyon ve α-Tokoferol ekivalen değeri ...63 Tablo 73 4SAD kodlu örneğin 1,00 mg/ml konsantrasyonda % DPPH inhibisyon ve α-Tokoferol ekivalen değeri ...63 Tablo 74 4SD kodlu örneğin 0,25 mg/ml konsantrasyonda % DPPH inhibisyon ve α- Tokoferol ekivalen değeri ...64 Tablo 75 4SD kodlu örneğin 0,50 mg/ml konsantrasyonda % DPPH inhibisyon ve α- Tokoferol ekivalen değeri ...64 Tablo 76 4SD kodlu örneğin 0,50 mg/ml konsantrasyonda % DPPH inhibisyon ve α- Tokoferol ekivalen değeri ...65 Tablo 77 4SE kodlu örneğin 0,25 mg/ml konsantrasyonda % DPPH inhibisyon ve α- Tokoferol ekivalen değeri ...65 Tablo 78 4SE kodlu örneğin 0,50 mg/ml konsantrasyonda % DPPH inhibisyon ve α- Tokoferol ekivalen değeri ...66 Tablo 79 4SE kodlu örneğin 1,00 mg/ml konsantrasyonda % DPPH inhibisyon ve α- Tokoferol ekivalen değeri ...66 Tablo 80 4SM kodlu örneğin 0,25 mg/ml konsantrasyonda % DPPH inhibisyon ve α-

(13)

Tablo 82 4SM kodlu örneğin 1,00 mg/ml konsantrasyonda % DPPH inhibisyon ve α- Tokoferol ekivalen değeri ...68 Tablo 83 5SAD kodlu örneğin 0,25 mg/ml konsantrasyonda % DPPH inhibisyon ve α-Tokoferol ekivalen değeri ...68 Tablo 84 5SAD kodlu örneğin 0,50 mg/ml konsantrasyonda % DPPH inhibisyon ve α-Tokoferol ekivalen değeri ...69 Tablo 85 5SAD kodlu örneğin 1,00 mg/ml konsantrasyonda % DPPH inhibisyon ve α-Tokoferol ekivalen değeri ...69 Tablo 86 5SD kodlu örneğin 0,25 mg/ml konsantrasyonda % DPPH inhibisyon ve α- Tokoferol ekivalen değeri ...70 Tablo 87 5SD kodlu örneğin 0,50 mg/ml konsantrasyonda % DPPH inhibisyon ve α- Tokoferol ekivalen değeri ...70 Tablo 88 5SD kodlu örneğin 1,00 mg/ml konsantrasyonda % DPPH inhibisyon ve α- Tokoferol ekivalen değeri ...71 Tablo 89 5SE kodlu örneğin 0,25 mg/ml konsantrasyonda % DPPH inhibisyon ve α- Tokoferol ekivalen değeri ...71 Tablo 90 5SE kodlu örneğin 0,50 mg/ml konsantrasyonda % DPPH inhibisyon ve α- Tokoferol ekivalen değeri ...72 Tablo 91 5SE kodlu örneğin 1,00 mg/ml konsantrasyonda % DPPH inhibisyon ve α- Tokoferol ekivalen değeri ...72 Tablo 92 5SM kodlu örneğin 0,25 mg/ml konsantrasyonda % DPPH inhibisyon ve α- Tokoferol ekivalen değeri ...73 Tablo 93 5SM kodlu örneğin 0,50 mg/ml konsantrasyonda % DPPH inhibisyon ve α- Tokoferol ekivalen değeri ...73 Tablo 94 5SM kodlu örneğin 1,00 mg/ml konsantrasyonda % DPPH inhibisyon ve α- Tokoferol ekivalen değeri ...74 Tablo 95 1SAD kodlu örneğin 0,25 mg/ml konsantrasyonda % DPPH inhibisyon ve Kersetin ekivalen değeri ...75 Tablo 96 1SAD kodlu örneğin 0,25 mg/ml konsantrasyonda % DPPH inhibisyon ve Kersetin ekivalen değeri ...75 Tablo 97 1SAD kodlu örneğin 1,00 mg/ml konsantrasyonda % DPPH inhibisyon ve Kersetin ekivalen değeri ...76 Tablo 98 1SD kodlu örneğin 0,25 mg/ml konsantrasyonda % DPPH inhibisyon ve Kersetin ekivalen değeri ...76

(14)

Tablo 99 1SD kodlu örneğin 0,50 mg/ml konsantrasyonda % DPPH inhibisyon ve Kersetin ekivalen değeri ...77 Tablo 100 1SD kodlu örneğin 1,00 mg/ml konsantrasyonda % DPPH inhibisyon ve Kersetin ekivalen değeri ...77 Tablo 101 1SE kodlu örneğin 0,25 mg/ml konsantrasyonda % DPPH inhibisyon ve Kersetin ekivalen değeri ...78 Tablo 102 1SE kodlu örneğin 0,50 mg/ml konsantrasyonda % DPPH inhibisyon ve Kersetin ekivalen değeri ...78 Tablo 103 1SE kodlu örneğin 1,00 mg/ml konsantrasyonda % DPPH inhibisyon ve Kersetin ekivalen değeri ...79 Tablo 104 1SM kodlu örneğin 0,25 mg/ml konsantrasyonda % DPPH inhibisyon ve Kersetin ekivalen değeri ...79 Tablo 105 1SM kodlu örneğin 0,50 mg/ml konsantrasyonda % DPPH inhibisyon ve Kersetin ekivalen değeri ...80 Tablo 106 1SM kodlu örneğin 1,00 mg/ml konsantrasyonda % DPPH inhibisyon ve Kersetin ekivalen değeri ...80 Tablo 107 2SAD kodlu örneğin 0,25 mg/ml konsantrasyonda % DPPH inhibisyon ve Kersetin ekivalen değeri ...81 Tablo 108 2SAD kodlu örneğin 0,50 mg/ml konsantrasyonda % DPPH inhibisyon ve Kersetin ekivalen değeri ...81 Tablo 109 2SAD kodlu örneğin 1,00 mg/ml konsantrasyonda % DPPH inhibisyon ve Kersetin ekivalen değeri ...82 Tablo 110 2SD kodlu örneğin 0,25 mg/ml konsantrasyonda % DPPH inhibisyon ve Kersetin ekivalen değeri ...82 Tablo 111 2SD kodlu örneğin 0,50 mg/ml konsantrasyonda % DPPH inhibisyon ve Kersetin ekivalen değeri ...83 Tablo 112 2SD kodlu örneğin 1,00 mg/ml konsantrasyonda % DPPH inhibisyon ve Kersetin ekivalen değeri ...83 Tablo 113 2SE kodlu örneğin 0,25 mg/ml konsantrasyonda % DPPH inhibisyon ve Kersetin ekivalen değeri ...84 Tablo 114 2SE kodlu örneğin 0,50 mg/ml konsantrasyonda % DPPH inhibisyon ve

(15)

Tablo 116 2SM kodlu örneğin 0,25 mg/ml konsantrasyonda % DPPH inhibisyon ve Kersetin ekivalen değeri ...85 Tablo 117 2SM kodlu örneğin 0,50 mg/ml konsantrasyonda % DPPH inhibisyon ve Kersetin ekivalen değeri ...86 Tablo 118 2SM kodlu örneğin 1,00 mg/ml konsantrasyonda % DPPH inhibisyon ve Kersetin ekivalen değeri ...86 Tablo 119 3SAD kodlu örneğin 0,25 mg/ml konsantrasyonda % DPPH inhibisyon ve Kersetin ekivalen değeri ...87 Tablo 120 3SAD kodlu örneğin 0,50 mg/ml konsantrasyonda % DPPH inhibisyon ve Kersetin ekivalen değeri ...87 Tablo 121 3SAD kodlu örneğin 1,00 mg/ml konsantrasyonda % DPPH inhibisyon ve Kersetin ekivalen değeri ...88 Tablo 122 3SD kodlu örneğin 0,25 mg/ml konsantrasyonda % DPPH inhibisyon ve Kersetin ekivalen değeri ...88 Tablo 123 3SD kodlu örneğin 0,50 mg/ml konsantrasyonda % DPPH inhibisyon ve Kersetin ekivalen değeri ...89 Tablo 124 3SD kodlu örneğin 1,00 mg/ml konsantrasyonda % DPPH inhibisyon ve Kersetin ekivalen değeri ...89 Tablo 125 3SE kodlu örneğin 0,25 mg/ml konsantrasyonda % DPPH inhibisyon ve Kersetin ekivalen değeri ...90 Tablo 126 3SE kodlu örneğin 0,50 mg/ml konsantrasyonda % DPPH inhibisyon ve Kersetin ekivalen değeri ...90 Tablo 127 3SE kodlu örneğin 1,00 mg/ml konsantrasyonda % DPPH inhibisyon ve Kersetin ekivalen değeri ...91 Tablo 128 3SM kodlu örneğin 0,25 mg/ml konsantrasyonda % DPPH inhibisyon ve Kersetin ekivalen değeri ...91 Tablo 129 3SM kodlu örneğin 0,50 mg/ml konsantrasyonda % DPPH inhibisyon ve Kersetin ekivalen değeri ...92 Tablo 130 3SM kodlu örneğin 1,00 mg/ml konsantrasyonda % DPPH inhibisyon ve Kersetin ekivalen değeri ...92 Tablo 131 4SAD kodlu örneğin 0,25 mg/ml konsantrasyonda % DPPH inhibisyon ve Kersetin ekivalen değeri ...93 Tablo 132 4SAD kodlu örneğin 0,50 mg/ml konsantrasyonda % DPPH inhibisyon ve Kersetin ekivalen değeri ...93

(16)

Tablo 133 4SAD kodlu örneğin 1,00 mg/ml konsantrasyonda % DPPH inhibisyon ve Kersetin ekivalen değeri ...94 Tablo 134 4SD kodlu örneğin 0,25 mg/ml konsantrasyonda % DPPH inhibisyon ve Kersetin ekivalen değeri ...94 Tablo 135 4SD kodlu örneğin 0,50 mg/ml konsantrasyonda % DPPH inhibisyon ve Kersetin ekivalen değeri ...95 Tablo 136 4SD kodlu örneğin 1,00 mg/ml konsantrasyonda % DPPH inhibisyon ve Kersetin ekivalen değeri ...95 Tablo 137 4SE kodlu örneğin 0,25 mg/ml konsantrasyonda % DPPH inhibisyon ve Kersetin ekivalen değeri ...96 Tablo 138 4SE kodlu örneğin 0,50 mg/ml konsantrasyonda % DPPH inhibisyon ve Kersetin ekivalen değeri ...96 Tablo 139 4SE kodlu örneğin 1,00 mg/ml konsantrasyonda % DPPH inhibisyon ve Kersetin ekivalen değeri ...97 Tablo 140 4SM kodlu örneğin 0,25 mg/ml konsantrasyonda % DPPH inhibisyon ve Kersetin ekivalen değeri ...97 Tablo 141 4SM kodlu örneğin 0,50 mg/ml konsantrasyonda % DPPH inhibisyon ve Kersetin ekivalen değeri ...98 Tablo 142 4SM kodlu örneğin 1,00 mg/ml konsantrasyonda % DPPH inhibisyon ve Kersetin ekivalen değeri ...98 Tablo 143 5SAD kodlu örneğin 0,25 mg/ml konsantrasyonda % DPPH inhibisyon ve Kersetin ekivalen değeri ...99 Tablo 144 5SAD kodlu örneğin 0,50 mg/ml konsantrasyonda % DPPH inhibisyon ve Kersetin ekivalen değeri ...99 Tablo 145 5SAD kodlu örneğin 1,00 mg/ml konsantrasyonda % DPPH inhibisyon ve Kersetin ekivalen değeri ... 100 Tablo 146 5SD kodlu örneğin 0,25 mg/ml konsantrasyonda % DPPH inhibisyon ve Kersetin ekivalen değeri ... 100 Tablo 147 5SD kodlu örneğin 0,50 mg/ml konsantrasyonda % DPPH inhibisyon ve Kersetin ekivalen değeri ... 101 Tablo 148 5SD kodlu örneğin 1,00 mg/ml konsantrasyonda % DPPH inhibisyon ve

(17)

Tablo 150 5SE kodlu örneğin 0,50 mg/ml konsantrasyonda % DPPH inhibisyon ve Kersetin ekivalen değeri ... 102 Tablo 151 5SE kodlu örneğin 1,00 mg/ml konsantrasyonda % DPPH inhibisyon ve Kersetin ekivalen değeri ... 103 Tablo 152 5SM kodlu örneğin 0,25 mg/ml konsantrasyonda % DPPH inhibisyon ve Kersetin ekivalen değeri ... 103 Tablo 153 5SM kodlu örneğin 0,50 mg/ml konsantrasyonda % DPPH inhibisyon ve Kersetin ekivalen değeri ... 104 Tablo 154 5SM kodlu örneğin 1,00 mg/ml konsantrasyonda % DPPH inhibisyon ve Kersetin ekivalen değeri ... 104 Tablo 155 1SAD kodlu örneğin 1,00 mg/ml konsantrasyonda toplam fenolik madde miktarı ... 105 Tablo 156 1SD kodlu örneğin 1,00 mg/ml konsantrasyonda toplam fenolik madde miktarı ... 106 Tablo 157 1SE kodlu örneğin 1,00 mg/ml konsantrasyonda toplam fenolik madde miktarı ... 106 Tablo 158 1SM kodlu örneğin 1,00 mg/ml konsantrasyonda toplam fenolik madde miktarı ... 107 Tablo 159 2SAD kodlu örneğin 1,00 mg/ml konsantrasyonda toplam fenolik madde miktarı ... 107 Tablo 160 2SD kodlu örneğin 1,00 mg/ml konsantrasyonda toplam fenolik madde miktarı ... 108 Tablo 161 2SE kodlu örneğin 1,00 mg/ml konsantrasyonda toplam fenolik madde miktarı ... 108 Tablo 162 2SM kodlu örneğin 1,00 mg/ml konsantrasyonda toplam fenolik madde miktarı ... 109 Tablo 163 3SAD kodlu örneğin 1,00 mg/ml konsantrasyonda toplam fenolik madde miktarı ... 109 Tablo 164 3SD kodlu örneğin 1,00 mg/ml konsantrasyonda toplam fenolik madde miktarı ... 110 Tablo 165 3SE kodlu örneğin 1,00 mg/ml konsantrasyonda toplam fenolik madde miktarı ... 110 Tablo 166 3SM kodlu örneğin 1,00 mg/ml konsantrasyonda toplam fenolik madde miktarı ... 111

(18)

Tablo 167 4SAD kodlu örneğin 1,00 mg/ml konsantrasyonda toplam fenolik madde miktarı ... 111 Tablo 168 4SD kodlu örneğin 1,00 mg/ml konsantrasyonda toplam fenolik madde miktarı ... 112 Tablo 169 4SE kodlu örneğin 1,00 mg/ml konsantrasyonda toplam fenolik madde miktarı ... 112 Tablo 170 4SM kodlu örneğin 1,00 mg/ml konsantrasyonda toplam fenolik madde miktarı ... 113 Tablo 171 5SAD kodlu örneğin 1,00 mg/ml konsantrasyonda toplam fenolik madde miktarı ... 113 Tablo 172 5SD kodlu örneğin 1,00 mg/ml konsantrasyonda toplam fenolik madde miktarı ... 114 Tablo 173 5SE kodlu örneğin 1,00 mg/ml konsantrasyonda toplam fenolik madde miktarı ... 114 Tablo 174 5SM kodlu örneğin 1,00 mg/ml konsantrasyonda toplam fenolik madde miktarı ... 115 Tablo 175 1SAD kodlu örneğin 1,00 mg/ml konsantrasyonda toplam flavonoit

madde miktarı ... 116 Tablo 176 1SD kodlu örneğin 1,00 mg/ml konsantrasyonda toplam flavonoit madde miktarı ... 116 Tablo 177 1SE kodlu örneğin 1,00 mg/ml konsantrasyonda toplam flavonoit madde miktarı ... 117 Tablo 178 1SM kodlu örneğin 1,00 mg/ml konsantrasyonda toplam flavonoit madde miktarı ... 117 Tablo 179 2SAD kodlu örneğin 1,00 mg/ml konsantrasyonda toplam flavonoit

madde miktarı ... 118 Tablo 180 2SD kodlu örneğin 1,00 mg/ml konsantrasyonda toplam flavonoit madde miktarı ... 118 Tablo 181 2SEkodlu örneğin 1,00 mg/ml konsantrasyonda toplam flavonoit madde miktarı ... 119 Tablo 182 2SM kodlu örneğin 1,00 mg/ml konsantrasyonda toplam flavonoit madde

(19)

Tablo 184 3SD kodlu örneğin 1,00 mg/ml konsantrasyonda toplam flavonoit madde

miktarı ... 120

Tablo 185 3SE kodlu örneğin 1,00 mg/ml konsantrasyonda toplam flavonoit madde miktarı ... 121

Tablo 186 3SM kodlu örneğin 1,00 mg/ml konsantrasyonda toplam flavonoit madde miktarı ... 121

Tablo 187 4SAD kodlu örneğin 1,00 mg/ml konsantrasyonda toplam flavonoit madde miktarı ... 122

Tablo 188 4SD kodlu örneğin 1,00 mg/ml konsantrasyonda toplam flavonoit madde miktarı ... 122

Tablo 189 4SE kodlu örneğin 1,00 mg/ml konsantrasyonda toplam flavonoit madde miktarı ... 123

Tablo 191 5SAD kodlu örneğin 1,00 mg/ml konsantrasyonda toplam flavonoit madde miktarı ... 124

Tablo 192 5SD kodlu örneğin 1,00 mg/ml konsantrasyonda toplam flavonoit madde miktarı ... 124

Tablo 193 5SEkodlu örneğin 1,00 mg/ml konsantrasyonda toplam flavonoit madde miktarı ... 125

Tablo 195 1SAD, 1SD, 1SE, 1SM kodlu örneklerin antimikrobiyal aktiviteleri ... 126

Tablo 198 4SAD, 4SD, 4SE, 4SEM kodlu örneklerin antimikrobiyal aktiviteleri .. 128

(20)

Şekiller Dizini

Şekil 1 Stevia rebaudiana Bertoni bitkisinin genel görünüşü. . ... 4

Şekil 2 Tatlandırıcıların sınıflandırılması. ... 6

Şekil 3 Steviozit Miktar Tayininde Kullanılan Agilent HP 1100 Serisi HPLC cihazı ...18

Şekil 4 S3-M Kodlu Ekstreye Ait HPLC-DAD Kromatogramı ...31

Şekil 5. Steviozit Standart Ölçü Eğrisi Regresyon Denklemi ...32

Şekil 6 DPPH Yakalama Aktivitesine Ait α-Tokoferol Kalibrasyon Eğrisi ...43

Şekil 7 DPPH Radikal Yakalama Aktvitesine Ait Kersetin ile çizilen standart ölçü eğrisi ...74

Şekil 8 Gallik Asit Kalibrasyon Eğrisi ... 105

Şekil 9 Kersetin Kalibrasyon Eğrisi... 115

(21)

Kısaltmalar Listesi µg: mikrogram

µl: mikrolitre µm: mikrometre

2D-RPLC/HILIC: two dimensional- reversed-phase liquid chromatography/

hydophilicin teraction liquid chormatography (2-dimensiyonlu ters faz sıvı kromatografisi/hidrofilik etkileşim sıvı kromatografisi)

BHT: 2,6-bis(1,1-dimethylethyl)-4-methylphenol DPPH: 1-1-diphenyl 2-picryl hydrazyl

GC/MS: Gas Chromatography/Mass Spectrometry (Gaz Kromatografisi/Kütle Spektrometresi)

HCl: Hidroklorik asit

HPLC: High Performance Liquid Chromatography (Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografisi)

HPLC-DAD: High-Performance Liquid Chromatography with Diode-Array Detection (Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografisi-Diod Array Dedektör) kg: Kilogram

mg: miligram ml: mililitre nm: nanometre

PDA: Potato Dextrose Agar (Patates dekstroz agar) UV: Ultraviyole

(22)

Giriş

Stevia rebaudiana Bertoni bitkisi Güney Amerika kökenli olup özellikle Paraguay ve Brezilya’ya özgü bir bitkidir. Yerli halk tarafından şeker bitkisi olarak adlandırılmaktadır. Stevia, Asteraceae (Compositae) familyasına ait çok yıllık bir çalı bitkisidir (Soejarto, 2002). Stevia, dünya pazarında ümit verici bir bitki olup yapay tatlandırıcılara bir alternatif olarak, şeker yerine kullanılan ve yaprakları çiğ olarak da tüketilen bir gıda bitkisidir (Anton ve diğerleri, 2010; Das, Dang ve Shivananda, 2006)

Çalışmamızın ana amacı, yüzyılın en büyük sağlık problemlerinden olan obezite ve diyabette kullanılan yapay tatlandırıcıların yerine kullanılmaya başlanan ve hızla bu tatlandırıcıların yerini alma potansiyeli olan S. rebaudiana’nın üzerinde kalite kontrol analizleri, miktar tayini ve biyolojik aktivite araştırmaları yapmaktır.

Farklı ülkelerden (Almanya, Fransa, İngiltere, İsrail, Hollanda) temin edilen tohumlar, Manisa Turgutlu’da Agrotalya firması tarafından kültüre alınmıştır.

Yetiştirilen S. rebaudiana bitkilerinden elde edilen yapraklar bu tez çalışmasında drog olarak kullanılmıştır.

Son yıllarda araştırmacılar, tatlandırıcı özelliğinin yanı sıra Stevia bitkisinde antimikrobiyal ve antioksidan etkiler ile çeşitli miktar tayini çalışmaları yürütmüşlerdir (Bajčan ve diğerleri, 2013; Kobus-Moryson ve Gramza- Michałowska, 2015; Savita, Sheela, Sunanda, Shankar ve Ramakrishna, 2004).

Bu tez çalışması, miktar tayini ve biyolojik aktivite çalışmaları olmak üzere iki bölümden oluşmaktadır. Öncelikle droğun kalitesinin belirlenmesinde önemli olan Avrupa Farmakopesi’ndeki yöntemler esas alınarak, drog üzerinde kalite kontrol çalışmaları (kurutmada kayıp, total kül, sülfat külü ve hidroklorik asitte çözünmeyen kül miktar tayinleri) ayrıca, X-ray Floresans spektroskopisi ile sodyumdan zirkonyuma kadar elementel içeriğinin tayini amaçlanmıştır. S. rebaudiana’nın tatlandırıcı özelliğinden sorumlu majör bileşenlerden olan steviozit bileşiğinin yapraklardaki miktarının yüksek basınçlı sıvı kromatografisi (HPLC) yöntemi kullanılarak tayini amaçlanmıştır. Yapraklar üzerinde biyolojik aktivite araştırmaları

(23)

Yapılan literatür araştırmalarına göre, Türkiye’de yetiştirilen S. rebaudiana bitkisi üzerinde kalite kontrol, miktar tayini ve biyolojik aktivite çalışmalarına rastlanmamıştır. İlk kez bu araştırma ile Türkiye’de yetiştirilmiş olan Stevia bitkisi üzerinde kapsamlı farmakognozik araştırmalar yürütülmüştür.

(24)

Genel Bilgiler

Stevia genusu, 200 civarında tür içermektedir. Bu türlerden biri olan S. rebaudiana, Asteraceae (Compositae) familyasına ait olup, Paraguay’ın kuzey batısında yer alan Amambay’a özgü bir bitkidir. Bu bitki, Brezilya ve Arjantin’in Paraguay’a yakın olan bölgelerinde de yetişmektedir (Gentry, 1996; Soejarto, 2002). Günümüzde, dünyanın birçok yerinde, Kanada, Asya ve Avrupa’nın belirli bölgelerinde olmak üzere yaygın bir kültür alanı oluşturulmuştur.

Boyu 1 metreye kadar uzayabilen (Amzad-Hossain, Siddique, Mizanur-Rahman ve Amzad-Hossain, 2010; Gardana, Simonetti, Canzi, Zanchi ve Pietta, 2003; Nunes ve diğerleri, 2007), kökleri geniş alana yayılan, gövdeleri kırılgan olup, yaprakları kısa ve eliptik bir bitkidir (Shock, 1982). Yapraklar sapsız olup, 3-4 cm uzunluğunda, mızrak ya da spatül şeklinde sapsız olarak gövdeye bağlıdır. Yaprakların kenarları tırtıklıdır. Gövdesi odunsu olup alt kısımları hafifçe tüylüdür. Kök sapı hafifçe dallanmış köklere sahiptir. Çiçekleri küçük ve beyazdır. Soluk mor renkli çanak yapraklara sahiptir. Aken tipi meyveleri beş bölümlüdür (Blumenthal, 1996;

Katayama, Sumida, Hayashi ve Mitsuhashi, 1976).

Şekil 1 Stevia rebaudiana Bertoni bitkisinin genel görünüşü. ‘’Stevia rebaudiana Bertoni, source of a high-potency natural sweetener: A comprehensive review on the biochemical, nutritional and functional aspects’’Lemus-Mondaca, Vega-Galvez, Zura-Bravo, L. ve Ah-Hen, K, 2012, Food Chemistry, 132, s.1122 makalesinden aynen alnımıştır.

(25)

S. rebaudiana yapraklarını, Brezilya ve Paraguay yerlileri 100 yılı aşkın süredir tatlandırıcı olarak kulanmaktadır (Soejarto, 2002). Paraguay yerlileri bu bitkiyi kaajheé olarak adlandırmakta (Hanson ve De Oliveira, 1993) ve geleneksel çayları olan mate çaylarına tatlandırıcı olarak eklemektedirler. Çay ve çeşitli tatlılara, tatlandırıcı olarak ilavesi dışında, kardiyotonik olarak, obezitede, hipertansiyonda ve mide yanması şikayetlerinde de tıbbi amaçlarla kullanıldığı kayıtlıdır (Lemus- Mondaca, Vega-Galvez, Zura-Bravo ve Ah-Hen, 2012).

Crammer ve Ikan (1986), 95°C'de dahi stabilitesini koruması nedeniyle pişirilen gıdalar için steviozitin uygun bir tatlandırıcı katkı maddesi olduğunu rapor etmiştir.

Steviozit ve diğer tatlandırıcı bileşikler bakımından zengin olan Stevia ekstrelerinin 200°C'ye kadar olan sıcaklıklarda termostabil olduğu açıklanmıştır (Serio, 2010).

Isıya dayanıklı olması, dolayısıyla pişirilen gıdalara ilave edilebilmesinin yanı sıra toksik olmaması, ağızda acı tat bırakmaması ve lif içeriğinin yüksek olması gibi özellikleri, Stevia bitkisini diğer tatlandırıcı özelliği olan sentetik bileşenlere göre üstün kılmaktadır. (Gantait ve Das Mandal, 2015; İnanç ve Çınar, 2009).

Çeşitli gıda ve gıda takviyelerinde kullanılan tatlandırıcıların sınıflandırılmasına Şekil 2’de yer verilmiştir. Stevia, kalori içermeyen, doğal kaynaklı, güçlü etkili tatlandırıcılar sınıfında yer almaktadır.

(26)

Şekil 2 Tatlandırıcıların sınıflandırılması.’’ Stevia rebaudiana Bitkisinin Tatlandırıcı, Antioksidan ve Antimikrobiyal Özellikleri’’, Ş. Karagöz ve A. Demirdöven, 2018, Akademik Gıda, 24, s.431-438 makalesinden aynen alınmıştır.

S. rebaudiana’nın tatlandırıcı olarak kullanımı dışında özellikle Brezilya’da hipoglisemik, hipotansif, diüretik, kardiyotonik ve tonik olarak tıbbi amaçlarla kullanılmaktadır. Yapraklarından, diyabette, obezitede, yorgunlukta, depresyonda ve çeşitli enfeksiyonlarda yararlanılmaktadır (Chatsudthipong ve Muanprasat, 2009;

Chen ve diğeleri, 2006; Jeppesen, Gregersen, Poulsen ve Hermansen, 2000; Pól, Hohnová ve Hyötyläinen, 2007).

Bu bitki doğal olarak yetiştiği yerlerde şeker bitkisi olarak adlandırılmaktadır (Brandle ve Telmer, 2007). Halk arasında çeşitli kullanımları vardır ve daha çok yapraklarının kullanımı tercih edilir. En çok geleneksel çayları olan mate çayını tatlandırmak için ayrıca yerli halk tarafından yapraklarının infüzyonları gebeliği önleyici olarak kullanılmaktadır (Brondegaard, 1973; Felippe, 1977; Planas ve Kuc, 1968). Yaprakların dekoksiyonu ise diyabette kulanılmaktadır. Brezilya’da yaraların tedavisinde, depresyonda, diyabette, yorgunlukta, kalp destekleyici, hipertansiyonda,

(27)

olarak kullanılmaktadır. (Hsieh ve diğerleri, 2003, Marcinek ve Krejpcio, 2016;

Sehar, Kaul, Bani, Pal ve Saxena, 2008; Siddique, Rahman, Hossain ve Rashid, 2014).

Hsu ve diğerleri (2002) tarafından yapılan bir çalışmada bitkinin antihipertansif etkisi araştırılmıştır. Wistar-Kyoto sıçanlarının kullanıldığı bu çalışmada ilk önce sıçanlarda hipertansif model oluşturulmuş belirli dozajlarda sıçanlara bitkiden izole edilen steviozit verilmiştir. Çalışma sonunda steviozitin hipotansif etkisi olduğu tespit edilmiştir

Liu ve diğeleri (2003) tarafından yapılan bir çalışmada köpekler üzerinde S.

rebaudiana bitkisinden izole edilen Steviozitin köpekler üzerinde antihipertansif etkisi araştırılmıştır. Anestezi altında köpeklere 200 mg/kg steviozit toz olarak verilmiş ve etkileri belirli aralıklarla izlenmiştir. Çalışma sonunda bitkiden elde edilen steviozitin etkili bir antihipertansif ajan olabileceği bildirilmiştir.

Shivanna, Naika, Khanum ve Kaul (2013) tarafından S. rebaudiana yaprakları kullanılarak sıçanlar üzerinde antidiyabetik aktivite çalışması yapılmıştır. Bu çalışmada kullanılan sıçanlar pankreas hasarı yapılmak suretiyle diyabet modeli oluşturulmuş ve sıçanlara bitkinin yaprakları gıdalarına takviye olarak verilmiştir.

Çalışma sonunda sıçanların, hasar görmüş pankreasların iyileştiği ve önemli bir antidiyabetik aktivite gösterdiği gözlenmiştir

Kujur ve diğerleri (2010) tarafından S. rebaudiana yapraklarından hazırlanan sulu, eterli ve metanollü ekstreler ile diyabetik sıçanlar üzerinde bir çalışma yapılmıştır.

Belirli dozlarda sıçanlara bu ekstreler 28 gün boyunca verilmiş ve periyodik olarak kandaki şeker oranları ölçülmüştür. 28. gün yapılan ölçümlerde sıçanların kan şekeri düzeylerinde azalma saptanmıştır.

Gregersen, Jeppesen, Holst ve Hermansen (2004) tarafından S. rebaudiana yapraklarından elde edilen steviozit kullanılarak tip 2 diabet modeli oluşturulan sıçanlar üzerinde bir çalışma yapılmıştır. Yapılan deneyde sıçanlara yemek sonrasında belirli dozlarda steviozit verilmiş ve kan şekeri değerleri ölçülmüştür.

Elde edilen veriler steviozitin yemek sonrası kan şekerini düşürdüğü ve tip 2 diyabet hastalığında insülin seviyesini düzenlediğini açıkça göstermiştir.

(28)

Sumon, Mostofa, Jahan, Kayesh ve Haque (2008) tarafından yapılan bir çalışmada toz S. rebaudiana yaprakları ile bir diyabet ilacı olan Glimepirid’in karşılaştırılması yapılmıştır. Değişik dozlarda (150 mg/kg, 200 mg/kg ve 250 mg/kg) bitkinin tozu sıçanlara verilmiş ve sıçanların düzenli olarak kan şekeri seviyesi ve kiloları kontrol edilmiştir. Deney sonucunda bitkinin toz droğunun etkileri glimepirid ile karşılaştırıldığında, S. rebaudiana’nın Glimepirid’e göre kan şekerini artan doza bağımlı olarak daha iyi düşürdüğü gözlenmiştir.

Misra ve diğerleri (2011) tarafından, S. rebaudiana yapraklarının orta polariteli çözücüde hazırlanmış ekstresi ile diyabet modeli oluşturulmuş sıçanlar üzerinde bir çalışma yapılmıştır. Bu çalışmada sıçanlara 10 gün boyunca, 200 ve 400 mg/kg dozlarda bitki ekstreleri verilmiştir. Çalışma sonunda bitkinin diyabetli farelerin kan şekerini önemli bir oranda düşürdüğü gözlenmiştir.

Kujur ve diğerleri (2010) tarafından S. rebaudiana yapraklarından hazırlanan ekstrelerle diyabetik sıçan modeli üzerinde çalışmalar yapılmıştır. Çalışmada bitkinin su, etanol ve metanol ekstreleri belirli dozlarda sıçanlara uygulanmıştır. Sıçanların kan şekeri düzeyleri her gün ölçülerek kaydedilmiştir. 28. gün sonunda bitkinin tüm ekstrelerinin kan şekerini önemli oranda düşürdüğü saptanmıştır

Shukla, Mehta ve Bajpai (2013) tarafından S. rebaudiana yaprakları üzerinde antihelmentik ve antifungal çalışmalar yapmıştır. Bu çalışmada bitki yapraklarının etanol ve su esktreleri belirli dozlarda Pheretimaposthuma ve Ascardiagalli kurtları üzerinde araştırılmıştır. Çalışma sonunda hem etanol hem de su esktrelerinin antihelmentik aktivite gösterdiği rapor edilmiştir. Antifungal araştırma için PDA (Patates Dekstroz Agar) katı agarında disk difüzyon yöntemi kullanılmıştır. Bitkinin su ve etanol ekstreleri patojenik funguslar olan Botrytis cinera ve Fusarium oxysporum üzerine uygulanmıştır. 25^oC’de, 5-7 gün arası inkübasyona bırakılmış ve bitki yapraklarının su ve etanol ekstrelerinin antifungal aktivite gösterdiği belirtilmiştir.

Shukla ve arkadaşları tarafından S. rebaudiana yaprakları üzerinde antioksidan etki araştırması yapılmştır. Bu çalışmada bitkinin su ekstreleri hazırlanmış ve DPPH (1-1-

(29)

Mehta ve Bajpai, 2011). Yine Bharani ve arkadaşları, S. rebaudiana’nın serbest radikal süpürücü etkiyecsahip olduğunu ve güçlü antioksidan aktivitesi olduğunu bildirmişlerdir (Bharani, Ganguly ve Bhargava, 1995).

Gopalakrishnan, Bawane, Akki ve Hukkeri (2006) tarafından yapılan çalışmada, S.

rebaudiana’nın antioksidan özelliği araştırılmıştır. Bitkinin etanol, etanol-bütanol ve bütanol ekstreleri hazırlanmış ve DPPH radikaline karşı gösterdiği aktivite izlenmiştir. Hazırlanan tüm ekstrelerin antioksidan özellik gösterdiği en yüksek antioksidan kapasiteye etanol-bütanol karışımı ile hazırlanmış olan ekstresinin sahip olduğu bildirilmiştir.

Qing ve diğerleri (2012) tarafından S. rebaudiana yapraklarında kapsamlı bir kimyasal içerik tayini çalışması araştırması yapılmıştır. Bu çalışmada bitkinin sulu ekstreleri hazırlanmış ve iki dimensiyonlu ters faz sıvı kromatografisi/hidrofilik etkileşim sıvı kromatografisi (2D-RPLC/HILIC) sistemi kullanılarak kimyasal karakterizasyon çalışmaları yürütülmüştür. Çalışma sonunda bitki yapraklarının sulu ekstrelerinde steviolbiozit, dulkozit A, rebaudiozit B, steviozit, rebaudiozit C, rebaudiozit F, rebaudiozit A, rebaudiozit E, ve rebaudiozit D saptanmıştır.

Bergs, Burghoff, Joehnck, Martin ve Schembecker (2012) HPLC yöntemi ile S.

rebaudiana yaprakları üzerinde steviol glikozitleri üzerine bir araştırma yapmışlardır.

Çalışmada bitkinin sulu ekstreleri kullanılmıştır. Çalışma sonunda steviol glikozitlerden rebaudiozit D, rebaudiozit A, steviozit, rebaudiozit F, rebaudiozit C, dulkozit A, rubusozit, rebaudiozit B, steviolbiozit tespit edilmiştir.

Rieck, Lankes, Wawrzun ve Wüst (2010) tarafından S. rebaudiana yaprakları üzerinde HPLC metodu kullanılarak bir çalışma yapılmıştır. Stevia su ekstresinde steviol, steviolbiosit, steviozit, rebaudiozit A, rebaudiozit B, rebaudiozit C, rebaudiozit D, rebaudiozit E, rebaudiosit F, dulkozit A glikozitleri bulunmuştur.

Muanda ve diğerleri, S. rebaudiana yapraklarından elde edilen uçucu yağ üzerinde çalışmalar yapmışlardır. Bu çalışmada Gaz Kromatografisi /Kütle (GC/MS) analizi sonucunda aralarında farnesol, miristik asit, limonen, pinen, azulen gibi uçucu bileşenlerin olduğu toplam 34 adet bileşik tepit edilmiştir (Muanda, Soulimani, Diop ve Dicko, 2010).

(30)

Muanda, Soulimani, Diop ve Dicko (2010) tarafından S. rebaudiana yapraklarından elde edilen su ile sulu metanol ekstrelerinin ve uçucu yağının antienflamatuar aktivitesi araştırılmış ve uçucu yağın su ve sulu metanol ekstrelerinden çok daha yüksek oranda antienflamatuar aktivite gösterdiği bildirilmiştir.

Dacome ve diğerleri (2005) tarafından yapılan bir çalışmada, S. rebaudiana yapraklarından elde edilen diterpenik glikozitler araştırılmış ve stigmasterol ile β- sitosterol ve bu bileşiklerin glikozitleri elde edilmiştir.

Kolb, Herrera, Ferreyra ve Uliana (2001) tarafından gerçekleştirilen bir çalışmada S.

rebaudiana yaprakları üzerinde bitkinin tatlı özellikte diterpenik glikozitleri araştırılmıştır. Bu çalışmada Kolb ve diğerlerinin (2001) geliştirmiş olduğu HPLC metodu kullanılmıştır. Bitkinin etanollü ekstresi kullanılmış ve HPLC’de gradient ve izokratik sistemde ayrıştırma yapılmıştır. Yapılan çalışmaların sonucunda tatlı diterpen glikozit olarak her iki yöntemde farklı retensiyon zamanlarında steviozit ve rebaudiozit A ayrıştırılmıştır.

Chaturvedula ve Prakash’ın (2011a, 2011b) yaptığı bir çalışmada S. rebaudiana yaprakları üzerinde izolasyon ile NMR (nükleer manyetik rezonans) ve MS (kütle) gibi spektral analiz yöntemleri ile yapı tayini çalışmaları yürütülmüştür. Steviozit, rebaudiozit, rebaudiozit A-F, rubusozit ve dulkozit A’dan farklı olarak yeni bir diterpen glikozit izole edilmiştir.

Chan ve diğerleri (1998) S. rebaudiana yapraklarından elde edilen steviozitin hipotansif sıçanlar üzerinde kan basıncını nasıl etkilediği araştırılmıştır. Bu çalışmada anestezi altındaki sıçanlar 50, 100 ve 200 mg/kg dozlarında steviozit verilmiştir. Çalışma sonunda steviozitin kan basıncı artışını engellediği ve serum katekolamin seviyesinde bir değişime sebep olmadığı anlaşılmıştır.

Ferri ve diğerleri (2006), tedavi edilemeyen hafif hipertansiyon tanısı konulmuş hastalar üzerinde S. rebaudiana yaprağından elde edilen steviozitin etkilerini araştırmışlar. Belirli dozda steviozit verilen hastaların kan basıncı düzenli olarak 4 hafta boyunca ölçülmüş ve kaydedilmiştir. Bu araştırmalar sırasında steviozit ile tedavi edilen hastaların sistolik ve diyastolik kan basıncında düşüş gözlenmiştir.

(31)

Nunes ve diğerleri (2007), S. rebaudiana’dan elde edilen ekstrenin çeşitli dozlarda klinik çalışmalarını yapmışlardır. Bu çalışmada sağlıklı 60 belirli dozlarda bitkinin ekstreleri verilmiş ve kan şekeri değerlerine bakılmıştır. Çalışma sonunda 50 mg’lık dozda etki gözlenmemiş ancak 200 mg dozda ise kan şekeri düzeyini önemli derecede azalttığı gözlenmiştir.

Nunes ve diğerleri, S. rebaudiana’dan elde edilen ekstrenin çeşitli dozlarda klinik çalışmalarını yapmışlardır. Bu çalışmada sağlıklı 60 belirli dozlarda bitkinin ekstreleri verilmiş ve kan şekeri değerlerine bakılmıştır. Çalışma sonunda 50 mg’lık dozda etki gözlenmemiş ancak 200 mg dozda ise kan şekeri düzeyini önemli derecede azalttığı gözlenmiştir (Nunes ve diğerleri, 2007).

Shiozaki, Fujii, Nakano, Yamaguchi ve Sato (2006), Gine domuzları (Guinea pig) üzerinde S. rebaudiana yaprağından elde edilen steviozitin mide koruyucu etkisin araştırmışlar ve steviozitin mide koruyucu etkiye sahip olduğunu rapor etmişlerdir.

2.1. Kalite Kontrol, Biyolojik Aktivite Ve Miktar Tayini Çalışmaları

Mishra, Singh, Kumar ve Prakash (2010) S. rebaudiana yaprağında 0.443 ml/gkütle yoğunluğu, 4.7 ml/ g su tutma kapasitesi, 4.5 ml/g yağ emme kapasitesi, 5.0 ml/g emülsifikasyon değeri, 5.01 g/g şişme indeksi, 0.365 g/g çözünürlük ve pH 5,95 olarak bulmuşlardır. Tablo 1’de S. rebaudiana yaprakları üzerinde yapılmış nem ve kül tayininlerine ait bazı çalışmaların sonuçları bulunmaktadır.

Debnath (2008) S. rebaudiana yaprakları üzerinde antimikrobiyal aktivite araştırması gerçekleştirmiştir. Çalışmada bitkinin su, kloroform ve metanol ekstrelerinin Escherichia coli, Streptococcus mutans, Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, Aspergillus, Curvularia, Rhizopus, Alternaria ve Microsporium Sarracenia mikoorganizmaları üzerine etkileri incelenmiştir. Çalışma sonucunda bitkinin en yüksek antimikrobiyal aktiviteyi sırasıyla Staphylococcus aureus, Streptococcus mutans, Bacillus subtilis, Escherichia coli bakterilerine karşı gösterdiği saptanmıştır.

Tomita ve diğerleri (1997) S. rebaudiana’dan fermente edilmiş sıcak su ekstresinin Escherichia coli ve diğer gıda kaynaklı patojenik bakterilere yönelik bakterisit aktivitesini incelemişler. Bu bakterilerin yanı sıra, Salmonella typhimurium, Bacillus

(32)

subtilis ve Staphylococcus aureus gibi diğer mikroorganizmalara karşı da fermente sulu yaprak ekstresinin etkili olduğu görülmüştür.

Yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC), steviol glikozitlerin belirlenmesi için tercih edilen yöntemdir. 200 veya 210 nm'de, UV detektör yardımıyla steviol glikozitleri sıklıkla tayin edilmektedir (Rieck, Lankes, Wawrzun ve Wüst, 2010).

Tablo 2’de HPLC yöntemi ile yapılmış bazı çalışmaların sonuçları bulunmaktadır.

S. rebaudiana yaprak ekstrelerinin yüksek derecede antioksidan aktivite sergilediği ve sardalya yağında hidrojen peroksit oluşumunu, dl-α-tokoferol ve yeşil çay ekstresinden daha yüksek kapasite ile inhibe ettiği bildirilmiştir (Thomas ve Glade, 2010). Bitkinin yaprak ekstresinin antioksidan aktivitesi, serbest radikal elektronlarının ve süperoksitin atılmasına bağlanmıştır. S. rebaudiana'nın etanollü yaprak ekstresinin güçlü antioksidan aktivitesi nedeniyle, doğal bir antioksidan olarak kullanım potansiyeli olabileceği bildirilmiştir (Shukla ve diğerleri, 2011).

Tablo 3’te S. rebaudiana yapraklarının çeşitli ekstrelerinin antioksidan aktivite çalışmalarına ait bazı örnekler bulunmaktadır.

Tablo 1 Kurutulmuş S. rebaudiana yapraklarının nem ve kül analizleri

ÇALIŞMA REFERANS

1 2 3 4 5

Kurutmada

Kayıp (%) 5,37 4,65 7,7 7 7

Total Kül (%) 7,41 6,3 8,4 11 10,5

1: (Abou-Arab, Abou-Arab ve Abu-Salem,2010), 2: (S.Goyal, Samsher ve R.Goyal, 2010), 3: (Kaushik, Pradeep, Vamshi, Geetha ve Usha, 2010), 4: (Mishra, Singh, Kumar ve Prakash, 2010), 5: (Savita, Sheela, Sunanda, Shankar ve Ramakrishna, 2004)

(33)

Tablo 2 Kurutulmuş S. rebaudiana yapraklarında % glikozit miktarı

GLİKOZİT REFERANS

1 2 3

Steviosit 5.8 ± 1.3 9,1 5-10

Rebaudiosit A 1.8 ± 1.2 3,8 2-4

Rebaudiosit C 1.3 ± 1.4 0,6 1-2

Dulkosit A - 0,3 0,4-0,7

1: (Gardana, Scaglianti ve Simonetti, 2010), 2: (S.Goyal, Samsher ve R.Goyal, 2010) 3: (Kinghorn ve Soejarto, 1985)

Tablo 3 S. rebaudiana’nın farklı yaprak ekstrelerinin DPPH inhibisyon yüzdeleri

% İNHİBİSYON EKSTRE REFERANS

77,67 Metanol (10 g/50 ml) 1

67,08 Etanol (10 g/50 ml) 1

82,86 Su (500 g/1000 ml) 2

62,76 Etanol (50 g/500 ml) 3

64,26 Su (50g/500 ml) 4

39,86 Su (150 mg/50 ml) 5

33,17 Metanol (150 mg/50 ml) 5

1: (Ahmad, Fazal, Abbasi ve Farooq, 2010), 2: (Muanda, Soulimani, Diop ve Dicko, 2010), 3: (Shukla, Mehta, Bajpai ve Shukla, 2009), 4: (Shukla, A. Mehta, P. Mehta ve Bajpai, 2011), 5: (Tadhani, Patel ve Subhash, 2007)

(34)

Gereç ve Yöntem 3.1. Kalite Kontrol ve Miktar Tayini Araştırmaları 3.1.1. Gereç

Yaptığımız literatür araştırmalarında, S. rebaudiana’nın, Amerikan Farmakopesi’nde yer aldığı tespit edilmiştir (Upton, Graff, Jolliffe, Länger ve Williamson, 2011).

Dünya genelinde kültürü hızla yayılan bu bitki üzerinde son yıllarda bilimsel araştırmalar da artmıştır. Ülkemizde de çeşitli projelerle desteklenerek üretimi mevcut olan bu bitkinin ileriki dönemlerde önemli bir kültür bitkisi olacağı düşünüldüğünde yapmış olduğumuz bu çalışmaların araştırmacılar ve özellikle üreticiler için önemli bir kaynak olacağı inancındayız.

Bu tez kapsamında, Agrotalya firmasından 2012 Mayıs ayında 5 farklı ülkeden temin edilen tohumlardan, Manisa Turgutlu’da yetiştirilmiş olan S. rebaudiana bitkileri, temin edilmiştir. Stevia örneklerinin yaprakları ayrılıp gölgede ve oda sıcaklığında kurutulduktan sonra, Retsch Gmbh SK 1 marka değirmende toz edilmiştir (elek çapı

= 1 mm). Bu droglara 1S, 2S, 3S, 4S ve 5S kodları verilmiştir. Kodlanmış droglar üzerinde, kalite kontrol, miktar tayini ve aktivite çalışmaları gerçekleştirilmiştir.

Yapılan kalite kontrol çalışmalarında, Avrupa Farmakopesi’nin genel kısmında yer alan ana yöntemler esas alınmıştır. Stevia yapraklarında, kurutmada kayıp miktarı, total kül miktarı, sülfat külü miktarı ve hidroklorik asitte çözünmeyen kül miktarı tayin edilmiştir. Kurutmada kayıp miktarı için Heraeus marka etüv ve kül tayinleri için Heraeus marka yüksek fırınından yararlanılmıştır.

Yüksek basınçlı sıvı kromatografisi (hplc) ile steviozit miktar tayini HP1100 Agilent HPLC cihazında çalışılmıştır. HP1200 diode array detector (DAD) dedektörü kullanılmıştır. Analizler GL Sciences İnterstil® ODS-3 5µm 4,6x250 mm kolon ve Hamilton marka enjektörden yararlanılmıştır.

X-ray floresans spektroskopisi ile tüm örneklerin sodyumdan zirkonyuma kadar elementel içeriği ise İzmir Yüksek Teknoloji Enstitüsü Malzeme Araştırma Merkezinde (İYTE-MAM) görevli olan Uzman Biyolog Zehra Sinem Yılmaz tarafından SPectro IQ II (SPECTRO IQ II, Ametek, Germany) cihazında tayin edildi.

(35)

altında örnekler 300 s, 25 kV ve 50 Kv, 0,5-1,0 mA akımda, helyum gazında analiz edilmiştir.

3.1.2. Yöntemler

3.1.2.1. Bitki Ekstrelerinin Hazırlanışı

1S, 2S, 3S, 4S ve 5S kodlu S. rebaudiana toz droglarında steviozit miktar tayini çalışması için iki farklı ekstre hazırlandı. Bir ekstre metanol ile hazırlanırken diğer ekstre mobil faz karışımında (asetonitril-distile su) (14:86) hazırlandı. Ağzı kapalı ependorf tüpün içine 100 mg toz edilmiş yaprak örneği ve 5 ml çözücü eklendi.

90˚C’lik su banyosunda 1 saat ekstre edildi. Ardından 5000 rpm devir hızında santrifüj edildi ve üstteki kısım 0.45 µm naylon enjektör filtresinden süzüldü.

Bitkilerden HPLC-DAD yöntemi ile steviozit miktar tayini çalışması için hazırlanan metanol ekstrelerine ise S1-M, S2-M, S3-M, S4-M ve S5-M kodları verildi. HPLC mobil fazı ile hazırlanan ekstrelere ise S1-H, S2-H, S3-H, S4-H ve S5-H kodları verildi.

X-ray floresans spektroskopisi ile element analizi için 1S, 2S, 3S, 4S ve 5S kodlu S.

rebaudina toz droglarından %2’lik infüzyon olacak şekilde su ekstresi hazırlandı. Bu ekstrelere 1SD, 2SD, 3SD, 4SD ve 5SD kodları verilmiştir. Ayrıca asetonitril-distile su (1:1) ekstresi de çalkalamalı maserasyon tekniğine göre hazırlandı. Bu ekstrelere 1SAD, 2SAD, 3SAD, 4SAD ve 5SAD kod adı verildi. Tüm çözücüler alçak basınçta rotavaporda kuruluğa kadar uçuruldu ve ardından Christ marka liyofilizatörde 45 saat liyofilize edildi.

3.1.2.2. Kurutmada Kayıp Miktar Tayini

Kurutmada kayıp miktar tayinine başlamadan önce tayinde kullanılacak cam tartım kapları 105˚C’lik sıcaklıkta olan etüvde 1 saat ısıtılıp, desikatör soğutuldu. İki tartım arasındaki fark 0,5 mg’dan fazla olmayacak şekilde sabit vezne gelene kadar bu işlem yapıldı. Sabit vezne gelmiş cam tartım kabının içine daha önceden iyice toz haline getirilmiş 1S, 2S, 3S, 4S ve 5S kodlu örneklerden 1 g civarında tam olarak tartılmış droglar sırayla konuldu ve 105˚C’lik etüvde 1 saat süreyle tutuldu. Etüvden çıkartılarak desikatörde bir süre soğuması için bekletildikten sonra hassas terazide tartıldı. Bu işlemlere son iki tartım arasında 0,5 mg’dan fazla fark olmayacak şekilde

(36)

sabit vezne gelinceye kadar devam edilerek, droglardaki kurutmada kayıp miktarı % (a/a kuru drog) olarak hesaplandı.

3.1.2.3. Total Kül Miktar Tayini

Total kül miktar tayinine başlamadan önce, tayinde kullanılacak porselen krozeler 600+25˚C’lik yakma fırınında 1 saat süreyle tutulup daha sonra desikatörde soğutuldu. Bu işlem iki tartım arası fark 0,5 mg’dan fazla olmayacak şekilde sabit vezne gelene kadar tekrar edildi. Sabit vezne gelmiş porselen krozenin içinde daha önceden iyice toz haline getirilmiş 1S, 2S, 3S, 4S ve 5S kodlu örneklerden 1 g civarında tam olarak tartılmış droglar sırayla konuldu. Yakma fırınına konulmadan önce duman çıkışı bitene kadar kroze tablalı ısıtıcıda ısıtıldı. Ardından kroze 600±25˚C’lik yakma fırınında 1 saat süreyle yakılıp desikatörde soğutuldu. Bu işleme külü içeren krozenin ağırlığında son iki tartım arasındaki fark 0,5 mg’dan fazla olmayacak şekilde sabit vezne gelinceye kadar devam edilerek, droğun içerdiği total kül miktarı % olarak (a/a kuru drog) hesaplandı.

3.1.2.4. Sülfat Külü Miktar Tayini

Sülfat külü miktar tayinine başlamadan önce; tayinde kullanılacak porselen krozeler 600+25˚C’lik yakma fırınında 1 saat yakılıp desikatörde soğutuldu. Bu işleme 2 tartım arasındaki fark 0,5 mg’dan fazla olmayacak şekilde sabit vezne gelene kadar tekrar edildi. Sabit vezne gelmiş porselen krozenin içine daha önceden iyice toz haline getirilmiş 1S, 2S, 3S, 4S ve 5S kodlu örneklerden 1 g civarında tam olarak tartılmış droglar sırayla konuldu. Droğun üzerine %10’luk sülfürik asitten 2 ml alınarak damla damla ilave edilip ardından su banyosu üzerinde kuruluğa kadar bekletilip tablalı ısıtıcıda duman çıkışı bitene kadar ısıtıldı. Daha sonra 600+25˚C’lik yakma fırınında 1 saat süreyle yakıldı. Yüksek fırından çıkartılarak desikatörde kroze soğuması için bekletildi. Kroze soğuduktan sonra üzerine %10’luk sülfürik asit eklenip, aynı işlemler tekrar edildi. Kroze soğuduktan sonra %15,8’lik amonyum karbonat çözeltisi ilave edilip ısıtılıp, tablalı ısıtıcıda duman çıkışı gözlenmeyene kadar yakıldı. Kroze daha sonra yakma fırınına alınıp iki tartım arası 0,5 mg’dan fazla olmayacak şekilde sabit vezine gelene kadar yakılıp, soğutuldu. Daha sonra droğun sülfat külü miktarı % olarak (a/a kuru drog) hesaplandı.

(37)

3.1.2.5. Hidroklorik Asitte Çözünmeyen Kül Miktar Tayini

Hidroklorik asitte çözünmeyen kül miktar tayinine başlamadan önce tayinde kullanılacak porselen krozeler 600+25˚C’lik yakma fırınında 1 saat yakılıp desikatörde soğutuldu. Bu işlem 2 tartım arası fark 0,5 mg’dan fazla olmayacak şekilde sabit vezne gelene kadar tekrar edildi. Sabit vezne gelmiş porselen krozenin içerisine daha önceden iyice toz haline getirilmiş 1S, 2S, 3S, 4S ve 5S kodlu örneklerden 1 g civarında tam olarak tartılmış droglar sırayla konulup, yakma fırınına konulmadan önce tablalı bir ısıtıcıda duman çıkışı bitene kadar drog yakıldı.

Bu işlemden sonra külü içeren kroze 600+25˚C’lik yakma fırınında 1 saat süreyle yakılıp desitkatörde soğutuldu. Bu işleme külü içeren krozenin ağırlığında son iki tartım arasındaki fark 0,5 mg’dan fazla olmayacak şekilde sabit vezne gelinceye kadar devam edildi. Daha sonra krozede kalan bakiye üzerine 25 ml %10 HCl ilave edildi. Krozenin ağzı saat camıyla kapatılıp tablalı ısıtıcıda kaynama gözlenene kadar bekletildi. Soğuması sağlandıktan sonra kül bırakmayan süzgeç kâğıdı (589¹ Black ribbon) kullanılarak süzüldü. Süzüntü renksiz hale gelene kadar bakiye sıcak distile suyla yıkandı. Daha sonra üzerinde kalan bakiyeyle birlikte bir pens yardımıyla alınan süzgeç kâğıdı krozenin içerisine konulup tablalı ısıtıcıda duman çıkışı bitene kadar yakıldı. Bu işlem sonrasında kroze içindeki bakiyeyle birlikte yakma fırınında 1 saat süreyle yakılıp desikatörde soğutuldu. Bu işlem iki tartım arasındaki fark 0,5 mg’dan fazla olmayacak şekilde sabit vezne gelene kadar tekrarlandı ve droğun hidroklorik asitte çözünmeyen kül miktarı % (a/a kuru drog) olarak hesaplandı.

3.1.2.6. Yüksek Basınçlı Sıvı Kromatografisi (HPLC) ile Steviozit Miktar Tayini

Sigmadan temin edilen steviozit standardı (S352) mobil faz olan asetonitril: %0,4 fosforik asit içeren su çözücü karışımının (14:86) çözüldü (1 mg/ml) ve 0,45µm naylon filtereden süzüldü. Bu çözeltiden 10, 12.5, 15, ve 20 µl HPLC kolonuna enjektör ile tatbik edildi. Ön çalışma olarak 205 nm, 210 nm ve 220 nm dalga boyları denendi ve maksimum absorbansın gözlendiği 210 nm dalga boyunda çalışmaya devam edildi.

(38)

Şekil 3 Steviozit Miktar Tayininde Kullanılan Agilent HP 1100 Serisi HPLC cihazı İzokratik olarak çalışılan bu yöntemde basınç 86 bar, kolon sıcaklığı 55˚C ve mobil faz akış hızı 1 ml/dk olarak çalışıldı. S1-M, S2-M, S3-M, S4-M ve S5-M, S1-H, S2- H, S3-H, S4-H ve S5-H kodlu esktreler HPLC kolonuna 20 µl olarak tatbik edildi.

HPLC çalışması 2 paralel olarak yapıldı ve çalışmaların ortalaması alındı.

3.1.2.7. X-ray Floresans Spektoskobi ile Element Analizi

1SD, 2SD, 3SD, 4SD ve 5SD, 1SAD, 2SAD, 3SAD, 4SAD ve 5SAD kodlu ekstrelerin liyofilize halde örneklerin (1,0 g) elementel içeriği x-ray floresans spektroskobisi ile analiz edildi. Analizlerde 10000 vuruş çözünürlükte 145 eV slikon drift dedektör kullanılmıştır. Bragg cristal ve Highly Pyrolytic Grapgite (HOPG) polarize ışık altında örnekler 300 s, 25 kV ve 50 Kv, 0,5-1,0 mA akımda, helyum gazında analiz edilmiştir.

3.2 Biyolojik Aktivite Tayinleri 3.2.1. Gereç

DPPH yöntemi ile antioksidan aktivite, Folin Ciocalteu yöntemi ile total fenolik madde ve Alüminyum klorit yöntemi ile toplam flavonoit tayini UV spektrofotometrik esaslı yöntemler olup bu çalışmalarda ölçüm içim Optima SP 3000 Nano UV-Vis spetrofotometresinden yararlanılmıştır.

Antimikrobiyal aktivite araştırmalarında test mikroorganizmaları olarak; Bacillus cereus, Staphylococcus aureus, S. epidermidis, Enterococcus faecalis gram-pozitif bakterileri, Escherichia coli, Salmonella, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae gram-negatif bakterileri kullanılmıştır.

(39)

3.2.2. Yöntem

3.2.2.1. Bitki Ekstrelerinin Hazırlanışı

1S, 2S, 3S, 4S ve 5S kodlu toz droglardan herbirinden ayrı ayrı olarak alınan 2 gram toz drog, etanol (50 ml), metanol (50 ml), distile su (100 ml) ve asetonitril-distile su (15 ml – 35 ml) ile 130 dk ultrasonik karışıtırıcıda, 2 saat manyetik bir karıştırıcıda karıştırıldıktan sonra süzme işlemini takiben alçak basınç altında kuruluğa kadar uçurularak çalışmalarda kullanılacak esktreler elde edilmiştir. Elde edilen ekstrelere 1SAD, 1SD, 1SE, 1SM, 2SAD, 2SD, 2SE, 2SM, 3SAD, 3SD, 3SE, 3SM, 4SAD, 4SD, 4SE, 4SM, 5SAD, 5SD, 5SE, 5SM kodları verilmiştir.

3.2.2.2. Antioksidan Aktivite

Hazırlanan esktrelerin total antioksidan kapasite ölçümleri M. A. Esmaeili ve arkadaşlarının uyguladığı yönteme göre yapılmıştır (Esmaeili ve Sonboli, 2010). Bu yöntemde, 0,5 mg/ml, 0,75 mg/ml, 1 mg/ml konsantrasyonlarda hazırlanmış ekstrelerden 1 ml alınıp üzerine 4 ml DPPH stok çözeltisi (4 mg DPPH/100 ml metanol) eklendikten sonra, 30 dakika oda sıcaklığında ara sıra çalkalamak suretiyle karanlıkta bekletilmiştir. Bu süre sonunda absorbans değerleri, Optima SP 3000 Nano UV-Vis Spektrofotometresinde 517 nm’de metanole karşı ölçülmüştür (Aörnek).

Ekstre içermeyen sadece çözücü ve DPPH stok çözeltisinden oluşan karışım da 30 dk bekletilmiş ve absorbansı ölçülmüştür (Aboş). Standart antioksidan madde olarak α- tokoferol (y=0,6177x R²=0,9957) ile de DPPH yüzde inhibisyonu tespit edilmiş ve kalibrasyon eğrisi çizilip regresyon denklemi hesaplanmıştır. Tüm örneklerin antioksidan aktiviteleri % DPPH inhibisyonu ve α-tokoferole eşdeğer aktivite olarak hesaplanmıştır. Yapılan tüm deneyler 3 tekrarlı olarak gerçekleştirilmiş ve sonuçların ortalaması alınmıştır

İ = İnhibisyon

Aboş = 1 ml Ekstre içermeyen çözücü + 4 ml DPPH stok çözeltisi karışımının absorbansı

Aörnek = 1 ml Örnek + 4 ml DPPH stok çözeltisi karışımının absorbansı

(40)

İ (%) = [ (Aboş - Aörnek) / Aboş ] x 100 formülü kullanılarak % DPPH inhibisyon değeri hesaplanmış ve α-tokoferol ile hesaplanan regresyon denklemi vasıtasıyla tüm örneklerin % DPPH inhibitör aktivite sonuçları α-tokoferole ekivalen değerler olarak hesaplanmıştır

3.2.2.3. Toplam Fenolik Madde Analizi

Toplam fenolik madde analizi Folin-Ciocalteu yöntemine göre yapılmıştır (Singleton ve Rossi, 1965). Bu yönteme göre, uygun oranlarda seyreltilmiş 100 µl ekstre üzerine, 2.8 ml distile su ilave edilmiş, ardından 2 ml %2’lik Na₂CO₃ eklenmiştir.

Karışımın üzerine 0.1 ml %50’lik Folin-Ciocalteu reaktifi eklenerek, 2 ˚C’de karanlıkta 30 dakika bekletildikten sonra karışımın absorbansı 750 nm’de distile suya karşı ölçülmüştür. Toplam fenolik madde miktarı, gallik asit ile hazırlanan kalibrasyon eğrisinden yararlanılarak gallik asite eşdeğer miktarlar olarak hesaplanmıştır. Deneyler 3 tekrarlı gerçekleştirlilmiş ve sonuçların ortalaması alınmıştır.

3.2.2.4. Toplam Flavonoit Analizi

Toplam flavonoit miktarı, Zhinsen ve uyguladığı yönteme göre spektrokolorimetrik hesaplanmıştır. (Zhinsen, Meng, Cheng T. ve Jianming, 1999). Bu yönteme göre uygun oranlarda seyreltilmiş 500 µl (0.5 ml) ekstre üzerine 1.5 ml %95’lik etanol ilave edildi. Ardından 100 µl AlCl3 ve 2.8 ml de distile su konularak 40 dakika karanlıkta oda sıcaklığında ara sıra çalkalamak suretiyle inkübasyona bırakıdı.

Karışımın absorbansı 415 nm’de etanole karşı ölçüldü. Deneyler 3 kez tekrar edildi sonuçların ortalaması alınmıştır. Standart madde olarak kersetin ile hazırlanan ölçü eğrisi ve regresyon denkleminden yararlanılarak örneklerdeki toplam flavonoit miktarı kersetine eşdeğer flavonoit miktarı olarak hesaplandı (Atasağangil, 1996;

Tamczyk ve Gudej, 2003).

3.2.2.5. Antimikrobiyal Aktivite Tayini

Mikroorganizmalar -80˚C’de %10 gliserinli Brain Heart Infusion Broth (BHIB) (Oxoid) besiyeri içerisinde saklandı. Kullanılmadan önce bakteriler Mueller Hinton Broth (MHB) (Merck) içerisinde 35˚C’de 24 saat ve Sabouraud Dextrose Broth

(41)

belirlenmiştir. Bakteri suşları aktifleştirildikten sonra serum fizyolojik solüsyonu içerisinde 0,5 McFarland (bakteri: 1×107-1×108 koloni oluşturan birim (kob/ml);

maya: 1×105-1×106 (kob/ml)) standart yoğunluğuna ayarlanmış ve buradan 0,1’er ml alınarak Mueller Hinton Broth (MHB) ve Sabouraud Dekstroz Broth (SDB) besiyerinde 100 kat dilüe edilmiştir. Bakteri süspansiyonları eşit hacimde tüm kuyucuklara eklendikten sonra bakteriler 35˚C’de 18-24 saat inkübasyona bırakıldı.

Süre sonunda gözle görülebilir üremenin olmadığı en düşük konsantrasyon MİK olarak ifade edildi. Denemeler üç tekrarlı olarak yürütülmüştür. Standart antimikrobiyal olarak Ampisilin kullanılmıştır (Sigma-Aldrich).