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Neste estudo identificamos genotipicamente, pelo método spoligotyping, isolados de
M. tuberculosis multirresistentes e sensíveis, sendo uma amostragem da diversidade
genotípica de cepas de M. tuberculosis em Fortaleza. Sobre as características clinico- epidemiológicas da população estudada, não houve predominância estatisticamente significativa entre sexos, mas observou-se que o nível de escolaridade foi muito baixo entre os pacientes do estudo e os portadores de TB-R apresentavam menor renda mensal em relação aos com TB-S. Sobre a caracterização do tipo de contato, no grupo com TB-R houve valor estatístico maior com relação ao número de contatos prévios embora não tenha havido diferença entre exposição a familiares ou não. Também observamos que o tempo de convivência com alguém com TB foi relevante nos pacientes com TB-R. Não houve diferença estatisticamente significativa para a presença de DPOC, DM, etilismo, tabagismo ou uso de drogas ilícitas, contudo houve tendência estatística a uma maior predisposição no grupo com TB-R.
Foi encontrada elevada proporção de TB-MDR com relato de tratamento prévio (84,3%) irregular ou abandono de tratamento, estatisticamente significativa.
Os isolados de M. tuberculosis foram caracterizados genotipicamente e agrupados em 22 linhagens-padrão de spoligotyping, enquanto que 41 (36%) dos isolados foram identificados como novos genótipos (new). As famílias mais frequentes foram Mediterrâneo Latinamericana (LAM) (33%), Haarlem (H) (12%) e Universal (U) (5%). Não houve associação significante da distribuição geográfica dos pacientes com TB-R, TB-S ou com as diferentes famílias de spoligotipos.
A análise geoespacial revelou 24 pacientes (23%) que compartilhavam a mesma residência ou viviam próximo de um caso. Dentre os que viviam na mesma residência, eles apresentavam o mesmo padrão genotípico e de resistência.
Analisando a existência de focos de transmissão de TB-MDR primária, a partir dos resultados deste estudo, foi observado que a resistência a drogas anti-TB foi predominantemente do tipo secundária, e alguns casos foram do tipo primária.. Em alguns agrupamentos de cepas de M. tuberculosis foram encontrados padrões de resistência idênticos, mas em outros havia padrões de resistência a uma única droga. Evidenciou-se a existência de uma taxa de transmissão relevante entre TB-MDR e um padrão típico geográfico de cepas de
M. tuberculosis em Fortaleza, além de surtos de TB por transmissão ativa de bacilos entre os
casos em clusters, que acarreta para a população imunocompetente uma elevada prevalência de TB. Foi bem sucedida a combinação de spoligotyping, achados clínicos e análise geoespacial para estudar a TB-R, o que demonstra a utilidade desta estratégia em programas de controle da doença. A mapealização de cepas resistentes espoligotipadas foi útil em fornecer informações sobre a distribuição e suas características epidemiológicas, que podem ser aplicadas a fim de permitir melhor acompanhamento dos pacientes e definir estratégias de prevenção da doença em áreas de risco.
TB resistente a medicamentos é um importante problema de saúde pública no Brasil. Controle efetivo da sua transmissão na população em estudo tem por objetivo reduzir tanto a disseminação como a ocorrência de resistência adquirida. Este estudo demonstra que a integração de TSA com genotipagem e análise de dados epidemiológicos representa uma abordagem útil para compreensão da epidemiologia da TB-R. Nosso estudo serve para exemplificar como a integração de estudos fenotípicos e genotipagem podem fornecer percepções sobre a dinâmica e a epidemiologia da TB-R nos países em desenvolvimento, onde dados mais abrangentes como história do tratamento para TB são muitas vezes indisponíveis.
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ANEXO I - Teste de sensibilidade a drogas antimicobacterianas pelo método das proporções para M. tuberculosis:
As amostras foram manipuladas em cabine de luxo laminar tipo IIb, com pressão negativa, no Setor de Micobactérias do LACEN-CE. Antes de iniciar os trabalhos, a cabine era limpa com glutaraldeído a 2% e submetida à luz ultravioleta por 20 minutos. Eram utilizadas as medidas de biossegurança adequadas como uso de máscara.
Foi feita suspensão, equivalente à escala um de McFarland, de colônias de micobactérias isoladas em cultura pura. A suspensão foi preparada em solução salina (NaCl 0,9%) contendo Tween 80 (0,1%), e em seguida diluída serialmente até 10-4, sendo as suspensões homogeneizadas em vortex. As drogas foram adicionadas em concentrações específicas ao meio LJ conforme Quadro 1. Tubos, para cada droga a ser testada, foram repetidos em diluições seriadas do inóculo, sendo estes inoculados com 0,1ml de cada diluição da amostra (10-1a 10-4). Tubos sem drogas também foram inoculados com amostras, a fim de que fossem comparadas na interpretação do resultado. Os inóculos foram deixados secar ao ar dentro da capela de fluxo laminar antes de serem incubados à 37o C por três semanas.
A leitura dos tubos foi realizada quando houve crescimento de 50 a 150 unidades formadoras de colônias (CFU) no controle sem-droga. A interpretação foi dada pelo número de CFU nos tubos com droga, e os números de CFU observados foram anotados em percentual em relação aos respectivos tubos sem droga. A resistência à determinada droga, na
concentração testada, foi reportada quando o percentual de colônias foi superior ou igual a 1%, sob concentrações críticas das drogas (CANETTI et al., 1963)(Quadro 3).
Quadro 3 - Concentrações das drogas anti-tuberculose empregadas no Método das
Proporções
Droga Concentração (g/ml) em ágar LJ
Rifampicina (R) 1 Isoniazida (I) 0,2 Pirazinamida (P) ph 5,9 25 Etambutol (E) 5 Estreptomicina (S) 2 ANEXO II Solução SSPE 20×
Para o preparo de solução estoque de SSPE 20× com volume final de 200ml era empregado 0,2 M Na2HPO4.2 H2O (28,4 g), 36 M NaCl (210,24 g/l) e 20mM EDTA (7,4 g/l)
ou 40 µl de EDTA 0,5 M.
EDTA 0,5M
Para estoque de EDTA 0,5 M (pH 0,8), era pesado 93,065 g de EDTA para 500 ml de solução, sendo preparando sob agitação e adicionado NaOH até a solução ficar solubilizada, e com pH final de 8,0. Ao final a solução era esterilizada por autoclavação e mantida a temperatura ambiente até momento do uso.
SDS 1x
Para SDS a 1x com um volume total de 400 ml, obtivemos a concentração de SDS a 1%, colocando dentro da proveta 40 ml de SDS a 10 x, e o que faltava para chegar a 400 ml era completado com água destilada.
2× SSPE / 0,1 % SDS