3.4. Yatırım
3.4.2. Yatırım Tanımında Ev Sahibi Devlet/Ulusal Hukukların Rolü
Outro aspecto abordado durante este trabalho foi a caracterização do promotor gsn com o objetivo de determinar quais regiões são importantes para a transcrição gênica. Os ensaios para a determinação das principais regiões regulatórias foram realizados em células de S. cerevisiae e também no fungo N. crassa.
Nas células de levedura, a transcrição do gene repórter mediada pelos diferentes fragmentos de DNA do promotor gsn foi testada tanto na condição fisiológica de crescimento quanto na situação de choque térmico. Todas as construções analisadas tiveram como referência os níveis de atividade enzimática determinados pelo promotor do gene GSY2 da levedura. É sabido que a ativação da transcrição do gene GSY2 de S. cerevisiae na situação de choque térmico é dependente da presença de elementos STRE em seu promotor e dos transativadores Msn2p/4p (MARTINEZ-PASTOR et al., 1996, SCHMITT & MCENTEE, 1996). Quando células selvagens de levedura carregando a construção pm1 (promotor inteiro) foram submetidas ao choque térmico, foi observada uma indução na expressão gênica, com um perfil bastante semelhante ao apresentado pelo promotor GSY2. O oposto, no entanto, pode ser observado quando células mutantes msn2 msn4 carregando a construção pm1 foram submetidas ao choque térmico, mostrando que os fatores de transcrição na levedura são capazes de reconhecer e ligar os elementos regulatorios cis do promotor gsn e ocasionar um tipo de resposta ao estresse térmico semelhante ao gene GSY2 da levedura.
Quando a região contendo os elementos HSE foi removida (construção pm2), uma ausência de atividade enzimática foi observada tanto para a linhagem selvagem quanto para a linhagem mutante, em ambas as condições de cultivo, sugerindo que esta região abrigue elementos do tipo enhancer, cujas presenças mostraram ser fundamentais para a transcrição gênica na levedura e cujas atividades mostraram ser independentes do elemento STRE. Nas leveduras, os consensos HSE geralmente estão presentes em múltiplas cópias nos promotores de genes responsivos a aumentos de temperatura (PELHAM, 1985; BIENZ & PELHAM, 1987), conferindo indução na expressão gênica após choque térmico e podendo muitas vezes se comportar como elementos do tipo enhancer (PELHAM, 1982; PELHAM & BIENZ, 1982; BIENZ & PELHAM, 1986). Quando os elementos HSE e o consenso STRE1 foram simultaneamente removidos, podemos observar um comportamento semelhante ao apresentado pela construção pm1, sugerindo que a região contendo o consenso STRE tenha um papel repressor na transcrição, cuja atividade parece ser controlada pela região contendo os consensos HSE, visto que a remoção isolada do consenso STRE1 (construção pm5) não interfere na transcrição. O envolvimento do elemento STRE como repressor transcricional foi
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relatado anteriormente para o gene HSP12 de S. cerevisiae, quando células de levedura foram submetidas a baixas concentrações de glicose (GROOT et al., 2000).
As construções pm4 e pm8 mostraram que o consenso TATA-box não é essencial para transcrição gênica. A presença de atividade β-galactosidase nas construções pm4 e pm8 sugere fortemente que a transcrição seja favorecida pela presença de elementos regulatórios localizados no intron1 do gene gsn, diferentes de TATA-box. De fato, ensaios de imunoprecipitação em cromatina, utilizando anticorpos anti-RNA polimerase II mostraram que a freqüência de genes cuja ativação da transcrição é mediada pelos consensos TATA-box em humanos é significativamente baixa (KIM et al., 2005), sustentando as observações realizadas em estudos anteriores, onde o TATA-box mostrou estar presente em apenas um pequeno número de promotores em S. cerevisiae e Drosophila (OHLER et al., 2002).
A importância de introns no controle da expressão gênica em fungos é bem conhecida (XU & GONG, 2003; BERGERS et al., 1995). A importância do intron 1 no controle da transcrição gênica foi demonstrada em nosso trabalho, através de ensaios de retardamento em gel usando extratos nucleares preparados a partir de micélio submetido ou não ao choque térmico e sondas de DNA contendo os consensos localizados no intron1. Além disso, resultados anteriores obtidos em nosso laboratório mostraram que o fenótipo deficiente em glicogênio de uma linhagem de N. crassa (gsnrip) foi completamente revertido apenas pela inserção da cópia genômica do gene gsn. A inserção apenas da ORF gsn sob o controle de um promotor heterólogo não foi capaz de reverter o fenótipo para acumulo de glicogênio, sugerindo um papel regulatório para o intron localizado na região 5’-UTR.
As análises realizadas no fungo N. crassa ainda não são conclusivas uma vez que a purificação de homocários necessita ser realizada. Mas os resultados preliminares da exposição dos transformantes aos vapores de iodo mostraram que em todas as construções analisadas, pelo menos um clone foi capaz de acumular glicogênio. A inserção de pelo menos uma cópia extra do gene gsn no genoma dos transformantes foi comprovada por
Southern blot. Entretanto, a linhagem utilizada para a transformação favorece a inserção
ectópica das cópias de DNA extras, dificultando a interpretação dos resultados obtidos uma vez que não é conhecido o local de inserção da cópia extra no DNA genômico do fungo. Existem, atualmente, linhagens de N. crassa geneticamente modificadas nas quais os eventos de recombinação homóloga são aumentados, portanto a recombinação no lócus gsn levaria a resultados mais consistentes que os atualmente disponíveis. O uso destas linhagens para a análise do promotor mínimo gsn deverá resultar em dados mais consistentes que os atuais. É importante salientar que os testes de iodo foram realizados à temperatura ambiente, apenas nas construções pm1, pm2, pm3 e pm4 do promotor mínimo, as quais apresentam deletadas apenas as regiões do promotor apresentando seqüências consensos envolvidas na regulação da expressão gênica durante choque térmico. Uma vez que a transcrição do gene
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gsn é reduzida quando células do fungo são incubadas a 45°C, é necessário ainda
determinar o acúmulo de glicogênio destes transformantes na situação de choque térmico, a fim de validarmos nossos resultados.