Yalova Belediyesi Uygulamaları

Os modelos estruturais usados nas simula¸c˜oes enzim´aticas foram constru´ıdos a partir das estruturas tridimensionais cristalogr´aficas das prote´ınas obtidas no Banco de dados de prote´ınas (PDB)[255].

A VHR humana foi cristalizada (c´odigo PDB 1vhr)[88] na presen¸ca de HEPES [4- (2-hidroxietil)-1-piperazina ´acido etanosulfˆonico], um ´ester de sulfato, que se liga ao P- loop analogamente ao substrato natural. A prote´ına foi cristalizada sem os 7 primeiros amino´acidos (apenas os res´ıduos numerados de 8 a 185 est˜ao presentes na estrutura do PDB), mas engloba toda unidade catal´ıtica. O res´ıduo que funciona como ´acido geral ´e o ASP92 e o P-loop (_{§1.3) ´e: HIS123−CYS124−ARG125−GLU126−GLY127−TYR128−} SER129_{−ARG130−SER131 onde os amino´acidos est˜ao representados pelo c´odigo de trˆes} letras e os res´ıduos em negrito indicam a ciste´ına e a arginina conservadas na fam´ılia das PTPs. Duas mol´eculas prot´eicas est˜ao presentes na estrutura c´odigo 1vhr. Apenas a cadeia A (complexada a HEPES) foi usada. A estrutura foi determinada numa resolu¸c˜ao de 2.1 ˚A.

A CDC25B humana foi cristalizada (c´odigo PDB 1qb0)[107]na presen¸ca de ´ıons sulfato (SO2−

4 ), que tamb´em se ligam ao s´ıtio ativo como o substrato natural. Apenas a unidade

catal´ıtica da enzima foi cristalizada (res´ıduos numerados de 374 a 550 est˜ao presentes na estrutura do PDB). O P-loop ´e composto por: HIS472−CYS473−GLU474−PHE475− SER476_{−SER477−GLU478−ARG479−GLY480. A estrutura foi determinada em 1.9 ˚}A de resolu¸c˜ao.

As duas estruturas n˜ao apresentaram muta¸c˜oes e ambos fragmentos tˆem atividade catal´ıtica comprovada na hidr´olise de ´esteres de fosfatos[88, 93, 107]. Todas as ´aguas cris- talogr´aficas e outras mol´eculas diferentes da cadeia prot´eica, e do an´alogo do substrato complexado no P-loop foram removidas da estrutura obtida no PDB.

A constru¸c˜ao das posi¸c˜oes dos hidrogˆenios ausentes e do substrato para a VHR e para CDC25B foram ligeiramente diferentes. Fenilfosfato foi usado como modelo da fosfoti- rosina de prote´ınas fosforiladas, que s˜ao os substratos naturais das PTPs (§1.3.1). Para a VHR, Dillet, Van Etten e Bashford[119] constru´ıram as coordenadas dos hidrogˆenios, substitu´ıram o HEPES por fenilfosfato dianiˆonico e otimizaram somente as posi¸c˜oes dos hidrogˆenios, do substrato, e do enxofre (ionizado) da cadeia lateral da CYS124, usando um

algoritmo de otimiza¸c˜ao por gradiente conjugado (§1.5) e o campo de for¸ca CHARMM[256]

para descrever a energia de todo sistema. O restante da prote´ına foi fixada nas posi¸c˜oes ori- ginais dadas no PDB. As coordenadas otimizadas foram disponibilizadas pelos autores[119] e usadas nesta tese. Para a CDC25B, as coordenadas dos hidrogˆenios ausentes foram cons- tru´ıdas e fenilfosfato dianiˆonico foi sobreposto `as coordenadas do sulfato ligado ao s´ıtio ativo (o f´osforo foi sobreposto ao enxofre e os oxigˆenios do fosfato foram sobrepostos aos oxigˆenios do sulfato, de modo que o grupo fenil se localizasse no exterior do s´ıtio ativo). Somente as posi¸c˜oes dos hidrogˆenios e do fenilfosfato foram otimizadas, usando um algoritmo de otimiza¸c˜ao por gradiente conjugado at´e que a m´edia quadr´atica do gra- diente fosse inferior a 0.001 kj mol−1 _˚A−1_{. O restante da prote´ına foi fixada nas posi¸c˜oes}

originais dadas na estrutura do PDB. O campo de for¸ca OPLS-AA foi usado para des- crever a energia de todo sistema. Os parˆametros de LJ do campo de for¸ca AMBER foram usados para o f´osforo (tabela 25) e os parˆametros de oxigˆenio ionizado do grupo carboxilato no OPLS-AA foram atribu´ıdos aos oxigˆenios n˜ao ligantes do grupo fosfato (p. 144, _{§3.1.3.3). Os parˆametros necess´arios para c´alculo de V}cov (§1.6.1) dos termos

que envolviam f´osforo ou oxigˆenio n˜ao ligante tamb´em foram tirados do AMBER. Os parˆametros covalentes e de LJ do OPLS-AA para enxofre da CYS foram usados para o enxofre ionizado da CYS no P-loop e os parˆametros de oxigˆenio ligado ao anel arom´atico da tirosina foram atribu´ıdos ao oxigˆenio esterificado do fenilfosfato. As seguintes cargas parciais foram atribu´ıdas: qm = 0.895 e para o f´osforo, qm = −0.82 e para os oxigˆenios

n˜ao ligantes, qm =−0.90 e para o enxofre ionizado e qm =−0.22 e para o Cβ da CYS no

P-loop. Estas cargas parciais s˜ao bastante pr´oximas `aquelas usadas em outros estudos e simula¸c˜oes de PTPs com fenilfosfato dianiˆonico[110, 114, 119, 120], e s˜ao consistentes com uma an´alise populacional[124, p. 151 e 152]derivada do potencial eletrost´atico gerado por compos- tos modelo e calculado no n´ıvel MP2/6-311+G(2df,2p) (resultado n˜ao mostrado aqui). A constru¸c˜ao dos hidrogˆenios e otimiza¸c˜ao das coordenadas foram realizadas pela biblioteca de rotinas DYNAMO[179].

As estruturas finais das duas prote´ınas complexadas com fenilfosfato s˜ao equivalentes aos respectivos MCs no v´acuo (figura 10). Nas etapas seguintes de constru¸c˜ao do modelo, o tratamento dado `as duas prote´ınas foi idˆentico. Os parˆametros do campo de for¸ca descritos acima e atribu´ıdos para CDC25B foram mantidos e os mesmos parˆametros foram usados na VHR. Todos os res´ıduos ARG, LYS e HIS foram protonados em ambas prote´ınas, em acordo com o estado de protona¸c˜ao adotado em outras simula¸c˜oes de PTPs[110, 112, 114]. A protona¸c˜ao da HIS pode ser discutida, porque o pKa da cadeia lateral deste amino´acido

cam que os res´ıduos de HIS, como aquele que forma o P-loop na VHR[257] ou em outras PTPs[42, 258], ou mesmo res´ıduos de HIS sem fun¸c˜ao catal´ıtica definida e n˜ao conservados na fam´ılia das PTPs tˆem seu pKa aumentado[259] e devem estar protonados no pH ´otimo.

Este pH ´e _{≈ 5.5 para VHR}[103], portanto, a maior parte dos res´ıduos de HIS que n˜ao tiveram seu pKa alterado tamb´em deve estar protonada. Muta¸c˜oes da HIS do P-loop

(como a HIS123 na VHR)[257] resultam em diminui¸c˜oes de menos de 10 vezes em kcat e

o KIE medido para a rea¸c˜ao catalisada pelas PTPs n˜ao sofre altera¸c˜ao com mudan¸ca do pH (p. 40). Portanto, parece-nos que a protona¸c˜ao dos res´ıduos de HIS ´e adequada e n˜ao influencia significativamente as propriedades catal´ıticas das PTPs. Os res´ıduos GLU e ASP foram desprotonados, exceto o ASP92 na VHR, que funciona como ´acido geral. Na CDC25B, os res´ıduos GLU474 e GLU478 foram modelados na forma desprotonada, exceto nas simula¸c˜oes em que cada um dos grupos foi aproximado ao grupo de sa´ıda do substrato ou funcionou como um ´acido geral (simula¸c˜oes 11 e 14, tabela 27). Estes esta- dos de protona¸c˜ao s˜ao idˆenticos `aqueles adotados por Asthagiri et al.[114] e similares aos estados adotados por ˚Aqvist et al.[112, 113, 120] na simula¸c˜ao da cat´alise de uma LM-PTP. A carga total de ambas prote´ınas (excluindo a carga do substrato) foi de +5 e.

Para solvatar os MCs, cada prote´ına foi sobreposta a uma caixa de ´agua c´ubica pr´e- equilibrada, com dimens˜oes de 55.92 ˚A de lado, contendo 5832 mol´eculas de ´agua, repre- sentadas pelo potencial flex´ıvel TIP3P[247]. Estes valores correspondem a uma densidade de _{≈ 1.0 g/L para ´agua. A caixa foi constru´ıda a partir de replica¸c˜oes e transla¸c˜oes} de outra caixa pr´e-equilibrada, contendo 729 mol´eculas de ´agua e 27.96 ˚A de lado, e foi equilibrada a 300 K por 200 ps de dinˆamica molecular segundo um algoritmo de velo- cidade de Verlet-Langevin com intervalo τ = 1 fs e coeficiente de fric¸c˜ao γ = 10 ps−1

(γi = γ, qualquer que seja i, p. 69), usando condi¸c˜oes de contorno peri´odicas e um es-

quema de truncagem para as intera¸c˜oes n˜ao ligantes com mudan¸ca da for¸ca com ron = 8

˚

A e rof f = 12 ˚A (§1.6.2). A prote´ına foi centralizada na caixa de solvente e todas as

mol´eculas de ´agua sobrepostas ou localizadas a menos que 2.8 ˚A de algum ´atomo do MC foram removidas. Como a VHR e a CDC25B tˆem dimens˜oes de cerca de 50 por 40 por 32 ˚

A e 51 por 36 por 28 ˚A, respectivamente, toda prote´ına foi solvatada. Uma otimiza¸c˜ao de geometria por gradiente conjugado (at´e a m´edia quadr´atica do gradiente ser inferior a 0.1 kj mol−1 _˚A−1_{) e uma curta dinˆamica molecular (usando o campo de for¸ca e as condi¸c˜oes}

para a dinˆamica da caixa de ´agua descritos acima) de 500 fs, com os ´atomos do MC fixos, foram realizadas para relaxar contatos energeticamente desfavor´aveis entre o solvente e a prote´ına. O processo de sobreposi¸c˜ao e relaxa¸c˜ao das mol´eculas de ´agua foi repetido at´e que nenhuma mol´ecula de ´agua pudesse ser adicionada, o que ocorreu ap´os dois ciclos

de sobreposi¸c˜ao para ambas enzimas. O sistema solvatado para VHR apresenta 17197 ´atomos, sendo 178 res´ıduos prot´eicos, 1 substrato (16 ´atomos) e 4804 mol´eculas de ´agua. Para CDC25B, o sistema final cont´em 17212 ´atomos, sendo 177 res´ıduos, 1 substrato e 4756 mol´eculas de ´agua.

Em seguida, as posi¸c˜oes da prote´ına e do solvente foram gradualmente relaxadas e termalizadas por simula¸c˜oes de dinˆamica molecular (usando as mesmas condi¸c˜oes des- critas acima para o campo de for¸ca e para a dinˆamica). As posi¸c˜oes da prote´ına e do solvente foram restritas `as coordenadas cartesianas iniciais por potenciais harmˆonicos (op¸c˜ao “TETHER”[24, 179], como as equa¸c˜oes 1.61 ou 1.78). Entre 10 a 12 simula¸c˜oes de 1 ps foram realizadas, em que as constantes de for¸ca usadas nestes potenciais harmˆonicos foram gradualmente reduzidas de 1000 kj mol−1 _˚A−2 _{at´e zero. O RMSD da temperatura}

(em rela¸c˜ao `a T = 300 K) foi de 2 K, sugerindo que o sistema estava equilibrado ap´os as simula¸c˜oes. Procedimentos similares de equilibra¸c˜ao foram adotados na constru¸c˜ao dos modelos macromoleculares solvatados usados em outros estudos de reatividade en- zim´atica[120, 260, 261]

O sistema solvatado foi centralizado no ponto m´edio entre as coordenadas do f´osforo do fenilfosfato e do enxofre da CYS nucleof´ılica (_{§1.3). As posi¸c˜oes dos res´ıduos da} prote´ına ou das mol´eculas de ´agua com pelo menos um de seus ´atomos localizados a mais de 14 ˚A deste ponto m´edio foram fixadas (usando restri¸c˜oes “duras” ao inv´es de potenciais harmˆonicos, isto ´e, o gradiente em rela¸c˜ao `as coordenadas destas esp´ecies foi zerado em cada passo de simula¸c˜ao). A distˆancia dos ´atomos que se movem (ou seja, dentro da esfera de 14 ˚A de raio, figura 33) aos ´atomos congelados no exterior da caixa de solvata¸c˜ao (ou seja, pr´oximos `a lateral da caixa c´ubica idealizada, vide supra) foi sempre maior que 13 ˚A (correspondente ao rof f usado nas simula¸c˜oes para obten¸c˜ao dos PMFs,

§4.1.2). Embora os ´atomos da parte fixa n˜ao se movam, eles interagem normalmente (por intera¸c˜oes covalentes, eletrost´aticas e de LJ) com os ´atomos da regi˜ao central m´ovel. O congelamento das posi¸c˜oes dos centros distantes do s´ıtio ativo ´e usado para diminuir o custo computacional e tamb´em foi empregado em estudos com PTPs[110, 112, 115, 120] e outras enzimas[260, 261].

A regi˜ao central m´ovel foi re-equilibrada a 300 K ap´os o congelamento da parte exte- rior (figura 33) em 5 simula¸c˜oes de dinˆamica molecular de 2 ps (vide supra). Restri¸c˜oes harmˆonicas foram impostas `as coordenadas cartesianas e gradativamente relaxadas (redu- zindo as constantes de for¸ca de 400 kj mol−1_˚A−2 _{at´e zero). Finalmente, 10 ps de dinˆamica}

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Figura 33: Representa¸c˜ao das diferentes regi˜oes usadas nas simula¸c˜oes enzim´aticas. Para VHR, as partes fixa e m´ovel contˆem 16310 e 887 ´atomos, respectivamente. Para CDC25B, as partes fixa e m´ovel contˆem 16424 e 728 ´atomos, respectivamente.

RMSD da temperatura nestes 10 ps foi de 8 K. Este desvio ´e maior que aquele observado acima em virtude do congelamento de parte das posi¸c˜oes atˆomicas (figura 33). Para a VHR, o RMSD das coordenadas cartesianas obtidas ao final da etapa de constru¸c˜ao e equilibra¸c˜ao em compara¸c˜ao `as coordenadas obtidas da estrutura original do PDB, in- cluindo as cadeias laterais dos amino´acidos e o substrato ´e de 0.68 ˚A. Para CDC25B, este RMSD ´e de 0.55 ˚A. Estas foram as estruturas iniciais usadas em cada umas das simula¸c˜oes apresentadas na _{§4.2. Na simula¸c˜ao de mutantes ou de diferentes substratos (por exem-} plo, simula¸c˜ao 2 ou 3, tabela 27), as posi¸c˜oes dos novos centros foram introduzidas ou substitu´ıdas (por exemplo, o CβH3 da cadeia lateral da ALA foi colocado nas posi¸c˜oes do

CβH2C da cadeia lateral do ASP92 e os oxigˆenios do grupo carboxilato foram apagados

na simula¸c˜ao 3) e uma otimiza¸c˜ao de geometria por gradiente conjugado (at´e a que m´edia quadr´atica do gradiente fosse inferior a 0.1 kj mol−1 _˚A−1_{) foi realizada apenas para os}

novos centros, com o restante do sistema restrito por um potencial harmˆonico (km = 500

kj mol−1 _˚A−2_{) `as coordenadas cartesianas originais.}