Gölcük Belediyesi Uygulamaları

Nas simula¸c˜oes com o potencial h´ıbrido (§1.6.4), a parti¸c˜ao das regi˜oes quˆantica (QM) e cl´assica (MM) foi alterada de acordo com o sistema ou processo estudado (figura 34 e tabela 27). Os ´atomos do substrato pertenceram `a regi˜ao QM em todas simula¸c˜oes rea- lizadas (exceto a simula¸c˜ao 11, tabela 27). Na simula¸c˜ao 2, o substrato foi metilfosfato

ácido geral nucleófilo (Ác.geral)−PTP ¯O X O C P O d(XP) d(PO) 2 H C PTP−R lg O O _CH2 Y H d(OH) _d(AcOH) MM QM MM substrato

Figura 34: Esquema das distˆancias e grupos reativos usados nas simula¸c˜oes enzim´aticas.

Tabela 27: Grupos reativos ou catal´ıticos e coordenadas de rea¸c˜ao usadas nas simula¸c˜oes enzim´aticas Simula¸c˜ao Xa _Ya _{Observa¸c˜ao}b _QMc _ξd VHR 1a S− _O− _{29 d(PO) − d(SP)} 1b S− _O− _{29 d(PO)} 1c S− _O− _{29 d(PO)} − d(OH) 1d S− _O− _{29 d(OH)} 1e S− _O− _{29 d(PO) − d(SP) − d(OH)} 2 S− _O− _{lg = metil 22 d(PO)} − d(SP)

3 S− _O− _{ASP→ALA 21 d(PO) − d(SP)}

4 S− _O− _{ARG→ALA 29 d(PO) − d(SP)}

5 S− _{OH 30 d(PO)}

− d(SP)

6 SH O− _{30 d(PO) − d(SP)}

7 O− _O− _{CYS→SER 29 d(PO) − d(OP)}

8 O− _{OH CYS}

→SER 30 d(PO) _{− d(OP)}

9 OH O− _{CYS→SER 30 d(PO) − d(OP)}

10 OH OH CYS_→SER 31 d(PO) _{− d(OP)}

CDC25B

11 S− _O− _{Ac. geral = GLU}´ _{0 d(OH)}

12 S− _O− _{Sem ´Ac. geral 21 d(PO) − d(SP)}

13 S− _{OH Sem ´Ac. geral 22 d(PO)}

− d(SP) 14a S− _O− _{Ac. geral = GLU}´ _{29 d(PO) − d(SP)}

14b S− _O− _{Ac. geral = GLU´ 29 d(PO)}

− d(OH)

14c S− _O− _{Ac. geral = GLU}´ _{29 d(PO) − d(SP) − d(OH)}

14d S− _O− _{Ac. geral = GLU´ 29 d(OH)}

a _{indicam os grupos X e Y da figura 34.} b _{indica mudan¸cas do grupo de sa´ıda (lg = fenil} para todas simula¸c˜oes exceto a 2, figura 34), muta¸c˜oes (por exemplo, CYS→SER) ou ´acido geral usado, no caso da CDC25B.c indica o n´umero de ´atomos que pertenceram a regi˜ao QM. d_{coordenada de rea¸c˜ao (veja a figura 34 para defini¸c˜ao das distˆancias de liga¸c˜ao usadas).}

dianiˆonico e, nas outras simula¸c˜oes, o substrato foi fenilfosfato mono ou dianiˆonico (ta- bela 27). Metilfosfato foi usado como modelo da fosfoserina ou fosfotreonina de prote´ınas fosforiladas, que tamb´em s˜ao os substratos naturais das DSPs e CDC25s (_{§1.3.1). O nu-} cle´ofilo enzim´atico corresponde `a cadeia lateral da ciste´ına (CYS124 para VHR e CYS473 para CDC25B, tabela 27) ou da serina para o mutante CYS124→SER. Assim, os ´atomos CβH2−X− ou CβH2−XH, onde X = S ou O, respectivamente para CYS ou SER, foram

representados na regi˜ao QM. Na VHR, o ´acido geral enzim´atico correspondeu `a cadeia lateral do ASP92 e os ´atomos CβH2−COOH estiveram na regi˜ao QM (figura 34). Na

CDC25B, a cadeia lateral dos res´ıduos GLU474 e GLU478 foram testadas como poss´ıveis ´acidos gerais (§1.3.3) e os ´atomos CγH2−COOH estiveram na regi˜ao QM. Na simula¸c˜ao 3

(tabela 27), a cadeia lateral da alanina mutante pertenceu `a regi˜ao MM. A carga total da regi˜ao QM foi_{−3 e nas simula¸c˜oes 1 a 4, 7, 12 e 14; −2 e nas simula¸c˜oes 5, 6, 8, 9 e 13; e} −1 e na simula¸c˜ao 9. Todos os ´atomos foram descritos pelo potencial MM na simula¸c˜ao 11.

Os outros ´atomos do MC solvatado foram representados na regi˜ao MM. Portanto, excluindo-se os ´atomos da cadeia lateral relacionados acima, o restante do amino´acido que teve fun¸c˜ao de nucle´ofilo ou de ´acido geral foi representado na regi˜ao MM. Na VHR, a fronteira entre as regi˜oes QM e MM foi definida entre a liga¸c˜ao Cα−Cβ para o nucle´ofilo

e para o ´acido geral. Na CDC25B, a fronteira foi definida entre a liga¸c˜ao Cα−Cβ para o

nucle´ofilo e na liga¸c˜ao Cβ−Cγ para o ´acido geral. O esquema de ´atomo fict´ıcio, como des-

crito em_{§1.6.4.2 e §3.1.4, foi empregado para saturar a valˆencia da regi˜ao QM. Os ´atomos} fict´ıcios necess´arios (um para o nucle´ofilo enzim´atico e outro para o ´acido geral) foram po- sicionados automaticamente (equa¸c˜ao 3.15), em cada passo da dinˆamica molecular (vide infra).

Assim, as mol´eculas que formaram a regi˜ao QM nas simula¸c˜oes foram idˆenticas ou muito semelhantes `as mol´eculas usadas na calibra¸c˜ao espec´ıfica da hamiltoniana semi- emp´ırica MNDO+G/CHOPS (§3.1.2). Por exemplo, a parte QM na simula¸c˜ao 1a (tabela 27) ´e composta por H3C−S−+ PhOP2−, que pode ser comparada `a rea¸c˜ao F (cap. 2), e

por H3C−COOH, cuja transferˆencia de H+ para o grupo de sa´ıda ´e idˆentica `a rea¸c˜ao 2.1

(p. 103).

A hamiltoniana semiemp´ırica calibrada MNDO+G/CHOPS (_{§3.2.1) foi usada para} descri¸c˜ao da parte QM, o campo de for¸ca OPLS-AA foi usado para a descri¸c˜ao da parte MM da prote´ına e o potencial TIP3P foi usado para a ´agua. A descri¸c˜ao geral do potencial h´ıbrido ´e aquela apresentada em _{§1.6.4. A intera¸c˜ao eletrost´atica QM/MM segundo a}

proposta de Field et al. foi usada (§1.6.4.1 e §3.2.3). Os parˆametros de LJ do OPLS- AA (e do AMBER para f´osforo do grupo fosfato) originais foram usados para os ´atomos QM (_{§3.2.3). As intera¸c˜oes covalentes e n˜ao ligantes na fronteira foram idˆenticas `aquelas} definidas em_§3.1.4.

A biblioteca de rotinas DYNAMO foi usada em todas as simula¸c˜oes enzim´aticas. Em- bora os parˆametros MNDO+G/CHOPS tenham sido calibrados utilizando o programa GEOMOP (§3.1.2), c´alculos de energia e otimiza¸c˜oes de geometria com a hamiltoniana semiemp´ırica (QM pura) para esp´ecies usadas no conjunto de treinamento da calibra¸c˜ao demonstraram (resultados n˜ao mostrados aqui) que os valores obtidos com o conjunto MNDO+G/CHOPS e a biblioteca DYNAMO s˜ao essencialmente idˆenticos aos resultados dos mesmos c´alculos realizados com o programa GEOMOP (as diferen¸cas nas energias calculadas n˜ao ultrapassaram 10−5 _{au e podem ser atribu´ıdas a diferen¸cas no arredonda-}

mento das constantes ou da precis˜ao num´erica usada em cada programa).

Dinˆamica molecular segundo um algoritmo de velocidade de Verlet-Langevin foi usada para propagar as coordenadas do sistema enzim´atico no tempo (§1.6.2). Um intervalo de tempo τ = 1 fs e um coeficiente de fric¸c˜ao γ = 10 ps−1 _{foram usados em todas as}

simula¸c˜oes. O esquema de truncagem com mudan¸ca da for¸ca com ron= 10 ˚A e rof f = 13

˚

A foi usado para as intera¸c˜oes n˜ao ligantes (tanto para as intera¸c˜oes entre dois centros MM, como entre centros MM e QM,§1.6.1 e apˆendice A). Testes em outros sistemas mostraram que os resultados obtidos com este esquema de truncagem s˜ao equivalentes aos resultados obtidos sem truncagem das intera¸c˜oes n˜ao ligantes[260, 261] (_{§4.3.1). Nenhuma condi¸c˜ao} de contorno peri´odica foi usada, j´a que as mol´eculas no exterior da caixa de solvata¸c˜ao tiveram suas coordenadas fixadas (§4.1.1).