IV.1.1. Ensaios com secretoma bacteriano liofilizado
Numa primeira fase, procedeu-se à análise de quatro lotes de produto biológico, que foram testados em larvas de Cx. theileri, nos ensaios I, II e III, e em Cx. theileri e An. atroparvus no ensaio IV. Os ensaios foram acompanhados às 24 horas seguintes e os imaturos foram coletados para posteriormente serem observados ao microscópio ótico.
Nos ensaios I e II o secretoma foi testado nas concentrações de 25%, 50%, 75% e 100%. No primeiro ensaio, verificou-se mortalidade das larvas após 24 horas em todas as concentrações testadas (Figura 7). Embora a mortalidade média correspondente à concentração de 25% seja a mais baixa e a de 100% a mais elevada, a concentração de 75% obteve uma mortalidade média inferior à concentração de 50%, além de que esta registou também o maior valor de desvio padrão.
No ensaio II, cujos resultados se apresentam na Figura 8, após 24 horas houve um aumento gradual da mortalidade com a concentração, tendo-se registado 100% de mortalidade na concentração máxima de secretoma (100%). O desvio padrão da mortalidade na concentração de 25% foi o mais elevado.
Nos gráficos correspondentes aos resultados dos ensaios I (Figura 7) e II (Figura 8), é visível um resultado mais coerente por parte do ensaio II, em que a média de mortalidade cresce gradualmente com o aumento de concentração. No entanto, embora tenham sido testadas as mesmas concentrações em ambos os ensaios, as mortalidades obtidas não são semelhantes, sendo as do ensaio I inferiores às do ensaio II.
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Figura 7 - Mortalidade após 24 horas no Ensaio I, com representação da mortalidade média e dos
desvios padrão, para 2 réplicas por concentração, de 25 larvas cada.
Figura 8 - Mortalidade após 24 horas no Ensaio II, com representação da mortalidade média e
dos desvios padrão, para 3 réplicas por concentração, de 15 larvas cada.
Para o ensaio III, a gama de concentrações utilizadas foi mais vasta que as anteriores. Ao testar novas concentrações pretendeu-se atingir resultados que cumprissem os requisitos definidos por WHO (2005). Estes ditam que para a determinação da reta de regressão de probit mortalidade – log concentração, o produto a testar deve provocar entre
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0 25% 50% 75% 100% M é d ia d a mo rtal id ad e ( % ) Concentração de Produto (%)
Média da mortalidade após 24 horas -
Ensaio I, Cx. theileri
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0 25% 50% 75% 100% M é d ia d a mo rtal id ad e ( % ) Concentração de produto (%)Média da mortalidade após 24 horas-
Ensaio II, Cx. theileri
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10% a 90% de mortalidade. Idealmente a regressão deve ser feita com duas a três concentrações com mortalidade abaixo de 50%, e duas a três concentrações com mortalidades acima de 50%.
Às 24 horas foi registada a existência de larvas mortas em todas as concentrações. Num total de oito concentrações testadas, em seis destas foi atingido o valor de 100% de mortalidade. Globalmente, as mortalidades registadas foram superiores às dos ensaios anteriores. Os resultados estão apresentados na Figura 9.
Figura 9 - Mortalidade após 24 horas no Ensaio III, com representação da mortalidade média e
dos desvios padrão, para 2 réplicas por concentração, de 15 larvas cada.
Os resultados obtidos para Cx. theileri no ensaio IV estão apresentados na Figura 10. A mortalidade induzida pelo secretoma apresentou valores muito baixos e irregulares, em que a concentração com maior mortalidade foi de 15%, com média de mortalidade de 18,7%. Já a concentração mais elevada de secretoma, 20%, apresentou média de mortalidade inferior, 9%. Também se observou que a média de mortalidade foi superior no controlo negativo com água desclorada, com média de 6,7%, relativamente ao controlo negativo com meio de cultura estéril em que a média foi de 1,3% de mortalidade.
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0 10% 20% 30% 35% 40% 50% 65% 100% M é d ia d a mo rtal id ad e ( % ) Concentração de Produto (%)
Média da mortalidade às 24 horas- Ensaio
III, Cx. theileri
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Figura 10 - Mortalidade após 24 horas no Ensaio IV, com representação da mortalidade média e
dos desvios padrão de Cx. theileri, para 3 réplicas por concentração, de 25 larvas cada.
No ensaio com An. atroparvus, embora os valores de mortalidade sejam inferiores, registou-se um crescimento gradual com o aumento de concentração de secretoma (Figura 11). No entanto, para a concentração mais elevada deste ensaio, 7%, o desvio padrão registado atingiu um valor de 30,3. Este valor traduz a discrepância de mortalidades registadas nas réplicas de 7%, onde se observaram respectivamente valores de 14, 0 e 2 larvas mortas por réplica.
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
Controlo H₂O Controlo meio 10% 12,5% 15% 20% M é d ia d e M o rtal id ad e ( % ) Concentração de Produto (%)
Média de Mortalidade após 24 horas-
Ensaio IV, Cx. theileri
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Figura 11 - Mortalidade após 24 horas no Ensaio IV, com representação da mortalidade média e
dos desvios padrão de An. atroparvus, para 3 réplicas por concentração, de 25 larvas cada.
Em estudos anteriores, tal como se procedeu nos ensaios I, II, III e IV, os autores optaram também por aplicar o extrato de bactéria em água para a realização dos ensaios, nos quais a contagem de larvas mortas era igualmente realizada após 24 horas de exposição ao produto (Karthik et al., 2011).
IV.1.2. Ensaios com secretoma bacteriano filtrado
Os ensaios V e VI foram realizados em meio de cultura que por sua vez continha o secretoma bacteriano. O motivo desta alteração nos ensaios foi a maior facilidade de obter secretoma em meio de cultura, ao invés do secretoma liofilizado. Para estes ensaios foram também utilizadas larvas L3-L4 de Cx. theileri e An. atroparvus. Em cada ensaio foram testadas concentrações diferentes, de lotes também diferentes.
Os resultados do ensaio V para larvas de Cx. theileri estão representados na Figura 12. Tanto na concentração de 75% como a de 100% atingiu-se 100% de mortalidade, apresentando a concentração de 50% um valor de 96%. A concentração de 25%
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
Controlo H₂O Controlo meio 2% 4% 5% 7% M é d ia d e M o rtal id ad e ( % ) Concentração de Produto (%)
Média de Mortalidade após 24 horas-
Ensaio IV, An. atroparvus
40
apresentou o valor mais baixo de mortalidade, designadamente 68%. Nesta concentração, verificou-se uma elevada variabilidade entre as réplicas, justificando o mais elevado (20,8) valor de desvio padrão encontrado.
No ensaio VI com Cx. theileri, apenas duas concentrações se mantiveram semelhantes às do ensaio V, especificamente as de 25% e 50%. Os valores de mortalidade de ambas as concentrações não sofreram alterações significativas, sendo que neste ensaio, em 25% a mortalidade aumentou de 68% para 70,3% e em 50% diminuiu de 96% para 90,67%. Por sua vez, as novas concentrações testadas, de valores inferiores, resultaram em valores de mortalidade também menores.
Figura 12 - Mortalidade após 24 horas no Ensaio V, com representação da mortalidade média e
dos desvios padrão de Cx. theileri, para 3 réplicas por concentração, de 25 larvas cada. 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
Controlo H₂O Controlo meio 25% 50% 75% 100% M é d ia d a mo rtal id ad e ( % ) Concentração de Produto (%)
Média da mortalidade após 24 horas -
Ensaio V, Cx. theileri
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Figura 13 - Mortalidade após 24 horas no Ensaio VI, com representação da mortalidade média e
dos desvios padrão de Cx. theileri, para 3 réplicas por concentração, de 25 larvas cada.
Os resultados do ensaio V com larvas de An. atroparvus estão apresentados na Figura 14. Foram testadas concentrações superiores às usadas no ensaio IV, uma vez que as mortalidades registadas neste foram de, no máximo, 21,33%. Em todas as concentrações se registou 100% de mortalidade. No ensaio VI com An. atroparvus (Figura 15), em que se usaram concentrações intermédias às dos ensaios anteriores com esta espécie, registaram-se novamente valores muito elevados de mortalidade larvar, inclusivamente nas concentrações mais baixas. À exceção da concentração de 5%, que resultou numa média de mortalidade de 39,42%, nas restantes observaram-se valores bastante superiores, entre 93% e 100%. Independentemente da concentração de produto, a espécie An. atroparvus exibiu sempre resultados mais elevados de mortalidade que Cx. theileri. 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
Controlo H₂O Controlo meio 5% 10% 25% 50% M é d ia d a mo rtal id ad e ( % ) Concentração Produto (%)
Média da mortalidade após 24 horas -
Ensaio VI, Cx. theileri
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Figura 14 - Mortalidade após 24 horas no Ensaio V, com representação da mortalidade média e
dos desvios padrão de An. atroparvus, para 3 réplicas por concentração, de 25 larvas cada.
Figura 15 - Mortalidade após 24 horas no Ensaio VI, com representação da mortalidade média e
dos desvios padrão de An. atroparvus, para 3 réplicas por concentração, de 25 larvas cada.
Nos ensaios realizados por Elimam et al. (2009), em que foram testados extratos da planta Calotropis procera, também se observaram resultados de mortalidade variáveis para as duas espécies testadas, Culex quinquefasciatus e Anopheles arabiensis., em que
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
Controlo H₂O Controlo meio 25% 50% 75% 100% M é d ia d a mo rtal id ad e ( % ) Concentração de Produto (%)
Média da mortalidade após 24 horas -
Ensaio V, An. atroparvus
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
Controlo H₂O Controlo meio 5% 10% 15% 20% M é d ia d a mo rtal id ae ( % ) Concentração de Produto (%)
Média da mortalidade após 24 horas -
Ensaio VI, An. atroparvus
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as larvas de Cx. quinquefasciatus se revelaram mais susceptíveis aos extratos de Calotropis procera do que as larvas de An. arabiensis. Os autores sugerem que as diferenças de suscetibilidade das espécies face ao larvicida possam estar relacionadas com as características fisiológicas das mesmas. Também os autores Singh e Prakash (2012) comprovaram o efeito larvicida de Streptomyces citreofluorescens em larvas de Anopheles stepehensi, Culex quinquefasciatus e Aedes aegypti através de ensaios em meio bacteriano filtrado. Os ensaios foram realizados com larvas dos quatro estádios larvares, e as Concentrações Letais foram variáveis entre os mesmos e entre as espécies. Tal como se procedeu para os ensaios V e VI, as larvas eram diretamente colocadas no meio e os valores de mortalidade foram lidos após 24 horas.
IV.1.3. Ensaios com fração
Procedeu-se a um ensaio preliminar com fração de compostos de baixo peso molecular a concentração 100%, com o intuito de testar se esta manteria o efeito larvicida. A quantidade de produto biológico disponibilizada apenas permitia a realização de um ensaio preliminar com apenas uma espécie pelo que se optou por realizá-lo com Cx. theileri. Assim, foram feitas três réplicas da concentração 100%, com 15 larvas num volume final de 250 mL cada. Após 24 horas, havia registo de larvas mortas em todas as réplicas. Neste primeiro ensaio com fração, a média de mortalidade ultrapassou os 50% dado que em cada réplica o número de larvas mortas foi mais de metade do total. No controlo não se registou mortalidade em nenhuma réplica (Tabela 1).
Tabela 1 - Média da mortalidade e desvio padrão obtidos com a fração a concentração 100% em
Cx. theileri, após 24 horas. Fração - Cx. theileri Nº de larvas (0h) Nº de larvas mortas (24 h) Mortalidade (%) Média de Mortalidade Desvio Padrão I 15 11 73,33 64,44 10,18 II 15 10 66,67 III 15 8 53,33
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O segundo lote de fração posteriormente obtido foi utilizado em An. atroparvus, e foram testadas três concentrações diferentes: 30%, 60% e 100%. Foram feitos dois controlos negativos, com água desmineralizada e com água desclorada. Este ensaio foi realizado apenas com exemplares de An. atroparvus, dada não disponibilidade de mosquitos Cx. theileri.
Neste ensaio foi possível observar um aumento progressivo de mortalidade com o aumento de quantidade de produto, embora não se tenha atingido 100% de mortalidade (Figura 16). Foi registada mortalidade no controlo negativo, no entanto em valor reduzido e não implicando a invalidade do ensaio, podendo estar relacionado com a condição das larvas utilizadas ou o seu manuseamento. Em relação aos resultados de concentração 100% em Cx. theileri, em que se obteve mortalidade de 64,44%, e tal como nos ensaios anteriores, An atroparvus apresentou uma mortalidade superior (74,29%).
Figura 16- Mortalidade após 24 horas no ensaio com fração, com representação da mortalidade
média e dos desvios padrão de An. atroparvus, para 4 réplicas por concentração, de 25 larvas cada.
Nos ensaios com fração de compostos de baixo peso molecular em ambas as espécies, os resultados obtidos apontam para uma maior homogeneidade da resposta obtida com este produto, dada a menor variação de mortalidade entre as réplicas duma
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
H₂O desclorada H₂O desmineralizada 30% 60% 100% M é d ia d e M o rtal id ad e ( % ) Concentração da fração (%)
Média de mortalidade após 24 horas -
Fração, An. atroparvus
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mesma concentração de teste, e consequente redução do respetivo desvio padrão da mortalidade média. No entanto, não tendo sido possível em tempo útil prosseguir com novos ensaios, não foi também possível a quantificação da eventual relação concentração- mortalidade.
Para a determinação da reta de regressão probit mortalidade - log concentração, é necessário que os resultados obtidos ao testar o produto estejam de acordo com os requisitos estabelecidos para os testes de sensibilidade pela OMS (WHO, 2005), nomeadamente identificação de pelo menos quatro concentrações de larvicida com mortalidades associadas entre 10 e 90% e desvio padrão da mortalidade média de cada concentração inferior a 25% da mesma. Na eventualidade de ser possível determinar a reta de regressão probit mortalidade - log concentração para as concentrações testadas, foram examinados os resultados dos ensaios I, II e V, nos quais foram testadas as mesmas concentrações, especificamente, 25%, 50%, 75% e 100%. Procedeu-se ao cálculo da média de cada concentração, com base nas suas réplicas. Uma vez obtidas as médias, foi necessário confirmar se o desvio padrão das réplicas não era superior a 25% da média de mortalidade. Para determinar a reta de regressão probit mortalidade - log concentração, são consideradas para esta análise concentrações que atinjam níveis de mortalidade entre 10% e 90%, das quais duas a três das concentrações devem apresentar mortalidade inferior a 50% e duas ou três concentrações em que a mortalidade seja superior a 50%. No entanto, os resultados obtidos não corresponderam a estes requisitos. Os valores de desvio padrão foram sempre superiores a 25% da média de mortalidade, confirmando que não houve reprodutibilidade entre os ensaios onde foram testadas as mesmas concentrações, assim como também foi registado dentro do mesmo lote, uma grande variabilidade para a mesma concentração. De igual forma, em nenhum ensaio foram encontradas mortalidades entre 10% e 90%, em que duas fossem inferiores a 50% e as restantes duas superiores a 50% (Anexo I). Como tal, os resultados individuais dos ensaios não cumpriam os requisitos definidos pela OMS para se considerarem válidos para a determinação da reta de regressão probit mortalidade - log concentração dos mesmos, que posteriormente permitiria avançar para o cálculo das Concentrações Letais 50%, 90% e 99% do produto. Assim, apenas pôde confirmar-se a existência de ação larvicida do secretoma testado, sendo evidenciada uma correlação positiva entre a concentração e a mortalidade. A elevada variabilidade de resultados entre ensaios
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conduzem a admitir que a composição dos diferentes lotes de secretoma testados não seria idêntica. Esta dificuldade poderá ser futuramente ultrapassada com ensaios conduzidos com frações do secretoma total, com as quais será mais exequível testar as mesmas concentrações de composto(s) ativo(s).
Globalmente, os mosquitos representam uma ameaça considerável para humanos, e outros vertebrados, apresentando as doenças cujos agentes patogénicos transmitem elevados índices de morbilidade e mortalidade. Por ano, mais de 700 milhões de pessoas são afetadas com doenças transmitidas por mosquitos (Taubes, 2000), o que realçou a importância do controlo de mosquitos a nível de saúde pública, por todo o mundo (El- Sheikh et al., 2012). Os inseticidas sintéticos, quando aplicados indiscriminadamente, podem ser prejudiciais à saúde e ao ambiente, afetar outros organismos e contribuir para o desenvolvimento de resistências aos inseticidas por parte dos mosquitos (Nauen, 2007; Elimam et al., 2009). Todos estes factores contribuiram para a necessidade da criação de novas alternativas para controlo de mosquitos, com produtos não prejudiciais ao ambiente, de utilização biodegradável e com propriedades inseticidas que atinjam apenas as espécies alvo (Isman, 2006; Pavela, 2008; Jawale et al., 2010).
Neste contexto, vários estudos têm sido realizados com o intuito de encontrar novos produtos com capacidade inseticida e seguros para o ambiente (Edriss et al., 2013). Diversos autores promoveram a utilização de extratos provenientes de plantas como inseticidas naturais. Os autores Elimam et al. (2009) confirmaram a capacidade inseticida de produtos obtidos a partir de folhas de Calotropis procera em larvas de Anopheles arabiensis e de Culex quinquefasciatus, principais vetores de malária e filaríases, respetivamente. Extratos da planta Cestrum nocturnum foram testados como larvicida em larvas de Aedes aegypti com resultados eficazes, no estudo de Jawale et al. (2010). Organismos como a esponja marinha Cliona celata também provaram ter atividade ovicida, larvicida e repelente contra o vetor de malária Anopheles stephensi (Reegan et al., 2015).
Múltiplos estudos confirmaram o potencial inseticida de diferentes bactérias, além de Bti e Bs. Os autores Karthik et al. (2011) verificaram que extratos provenientes das actinobactérias marinhas Saccharomonospora spp., Streptomyces roseiscleroticus e Streptomyces gedanensis possuíam atividade ovicida, larvicida e repelente nas espécies
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Culex tritaeniorhynchus e Culex gelidus, apresentando diferentes desempenhos conforme o tipo de atividade. A bactéria Streptomyces citreofluorescens provou ser eficaz como larvicida para as espécies Anopheles stephensi, Culex quinquefasciatus e Aedes aegypti (Singh e Prakash, 2012). Produzido pelas neurotoxinas espinosina A e D da bactéria Saccharopolyspora spinosa, Spinosad foi testado como larvicida, em condições laboratoriais assim como em campo, para Anopheles stephensi. No estudo de Prabhu et al. (2011) mostrou-se eficaz ao induzir mortalidade em laboratório e em campo. No estudo realizado por Prabakaran et al. (2003) foi confirmado o potencial larvicida e pupicida da bactéria Pseudomonas fluorescens, face a três espécies de mosquitos vetores, Anopheles stephensi, Culex quinquefasciatus e Aedes aegypti. Foi preparada uma solução contendo metabolitos da bactéria e testada em larvas L4 e em pupas das três espécies, verificando-se que a mortalidade das pupas requeria menor dosagem, e que entre as três espécies, as larvas e pupas de Anopheles stephensi, foram as mais sensíveis à solução.Os autores Nabar e Lokegaonkar (2015) confirmaram o potencial larvicida de bactérias dos géneros Pseudomonas, Bacillus e Corynebacterium em larvas de Aedes aegypti e Culex quinquefasciatus, em que os metabolitos secundários de Bacillus e Pseudomonas causaram 100% de mortalidade nas larvas. As propriedades inseticidas das proteínas de Pseudomonas fluorescens foram também analisadas por Paily (2014) e Sadanandane et al. (2003) em larvas e pupas de Culex quinquefasciatus.
No presente estudo, os ensaios decorridos foram realizados de acordo com o protocolo definido pela OMS (WHO, 2005) e comprovou-se o potencial inseticida do secretoma de uma bactéria da família Pseudomonadaceae, para as espécies Culex theileri e Anopheles atroparvus. A variância de mortalidades observadas entre as mesmas concentrações poderá ser justificada por múltiplos fatores. A condição das larvas utilizadas poderia influenciar os resultados, designadamente, caso as larvas testadas numa concentração específica se encontrassem mais débeis. A preparação do produto também poderá ser considerada uma das principais causas para a diferença de mortalidades encontradas. Se o produto não estiver devidamente ressuspendido nas ampolas, poderá afetar a ação do mesmo, que por sua vez se irá refletir nas mortalidades obtidas para a concentração em questão. O facto de os lotes poderem apresentar diferentes composições, justificará também alguns dos resultados obtidos. As composições podem diferir entre si na concentração dos componentes do produto com efeito biocida. No caso de estar em
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maior quantidade num lote, justificaria os níveis elevados de mortalidade para o ensaio respetivo. Futuramente, deveria prosseguir-se com análise qualitativa e quantitativa da composição deste secretoma e ensaios de sensibilidade larvar a frações de composição fixa do mesmo.