Günümüzde tam kandan trombositten zengin ürün elde ettiği iddia edilen kırktan fazla ticari sistem mevcuttur. Ancak günlük pratikte kullanılması için standardize edilmiş bir teknik yoktur. Kullanılan protokol ve cihazlar arasındaki en önemli farklılıklar; alınan kan volümü ( 9-120ml), TZP volümü (3-32ml), kullanılan aktivatörler (CaCl2, trombin, batroxobin), santrifüj sayısı (1 veya 2 kez) vetrombosit konsantrasyonu (1x-18x)’dur (158). Bu nedenle farklı yöntemlerin TZP’nin içeriğini değiştirebileceği unutulmamalıdır (171). Örneğin lökositlerin varlığı ya da yokluğu VEGF miktarını, dolayısıyla TZP’ nin potansiyel etkilerini değiştirebilmektedir (172). TZP hazırlamak için 3 metod bulunur (18):
1)Ticari kitler ile otomasyon makinelerin kullanıldığı çift çevirmeli metod; yüksek trombosit konsantrasyonu (8 kata kadar) ve yüksek miktarda lökosit içerir.
2)Geleneksel laboratuar yöntemleri kullanıldığı, kanın santrifüj edilip manuel yolla TZP’nin ayrıştırıldığı tek çevirmeli metod; beyaz kan hücresinden fakir bazal düzeyin 3 katı kadar trombosit konsantrasyonu içerir, düşük maliyetlidir.
3)Ticari teknolojik imkânlar kullanılarak kanın filtre edilmesi metodu; düşük sayıda lökosit, yüksek trombosit ve PDGF konsantrasyonu içerir ancak yüksek maliyetlidir. Çift çevirmeli metot kullanıldığında hastadan alınan kanın %10’ u kadar platelet konsantresi elde edilirken, tek çevirmeli metotta aynı miktar platelet için daha fazla miktarda tam kan gerekmektedir (173). Kan pıhtılaştığında trombositler pıhtının bir parçası olacağından ayrıştırılma imkânı yoktur. Bu yüzden tam kan santrifüj edilmeden önce sitrat katılarak iyonize kalsiyum bağlanır ve pıhtılaşma kaskadı inhibe edilmektedir (170). 18-gauge gibi geniş uçlu iğnelerle kan alındığında trombositlerin daha az travmatize edildiği düşünülmekte, uygulama öncesinde inaktif durumda kalmasını sağlaması açısından önemlidir (155). Alınan kan santrifüj edilerek; kırmızı kan hücreleri en altta, hücresiz plazma (trombositten fakir plazma) en üstte, ‘buffy coat’ olarak adlandırılan trombositler ve lökositler arada olacak şekilde 3 katmana ayrılır (12, 13). “Buffy coat” kısmında trombositler çoğunluktadır ve bu kısmın bir kez daha santrifüj edilmesiyle TZP ve trombositten fakir plazmada (Platelet Poor Plasma-PPP) daha ileri ayrışma sağlanabileceği düşünülmektedir (163, 170, 171, 174). En sonda edilen içerik, trombosit aktivasyonunu ve fibrin polimerizasyonunu tetiklemek için çeşitli yöntemler uygulanır (175, 176). Trombositler 3 yolla aktifleştirilir. Kalsiyum klorür ve trombin eklenmesi yönteminde; Kalsiyum klorür (CaCl2) daha önce antikoagulan bağlı bağlanma bölgesini yeniden doldurarak, trombinproteolitik G-protein ilişkili resöptör yoluyla trombositleri aktifleştirmektedir (170). Trombin/CaCl2 oranının 10:1 olması önerilmektedir. Donma /çözülme yöntemi ile trombositlerde fiziksel hasar oluşturularak degranülasyon sağlanır. Bu döngülerde TZP oda sıcaklığında 5 gün bekletilir daha sonra dondurulur. Son olarak aktive olmadan TZP uygulanması da mümkündür (170). Yumuşak dokuya enjekte edildiğinde TZP endojen kollajenle temas ederek aktive olur (18). Trombositler aktive olduktan sonra alfa granüllerdeki faktörlerin %70’i ilk 10 dakikada, büyük bir kısmı ilk bi saatte salınır. Az miktarda büyüme faktörü ise trombositlerin ömrü süresince 8-10 gün salınmaya devam eder
(18, 155). Trombositlerden salındıktan sonra ilk önce fibrin ağı tarafından absorbe edilen faktörler, fibrin ağının ekstraselüler matriks gibi davranmasıyla tekrar ortama salınırlar. TZP ile oluşturulan bu salınım kinetiği oluşan fibrin içeriğine bağlıdır. Bu içerik trombosit ve fibrinojen konsantrasyonuna ve farklı prokoagulan enzimlerle oluşan fibrin yapı çeşitliliğine göre değişir ve jel formunu oluşturur. Aktivatör konulduktan sonra dakikalar içinde jel matriks oluştuğundan, en kısa sürede enjeksiyon yapılmalıdır (177).
Trombosit konsantratları lökosit ve fibrin içerikleri göz önünde bulundurularak 4 kategoriye ayrılır (158).
1)Saf trombositten zengin plazma (P-TZP); Lökositten fakir TZP olarak da adlandırılır. Düşük yoğunlukta fibrin ağı içerir. Plazmaferezle ya da 580 g 8 dakika santrifüj sonrası plazma fraksiyonu pipetle ayrılarak elde edilir. Sıvı solüsyon ya da aktive jel formunda İA / deri üzerine uygulanabilir.
2) Lökosit ve trombositten zengin plazma (L-TZP): Saf TZP’ ye göre daha yüksek miktarda trombosit, lökosit ve düşük yoğunlukta fibrin ağı içerir. Otomatik çift santrifüj sistemi ile üretilir. Harvest Smart- PreP, Biomet GPS III, Plateltex, Regen PRP gibi birçok ticari alternatif bulunur. Saf TZP ile benzer şekilde İA/ cilt üzerine jel formda uygulanır.
Bu iki yöntemde de trombin ve CaCl2 gibi moleküller aracılığıyla trombosit ve fibrinojen aktifleşerek aktif jel halini alır. Aradaki temel fark ise lökosit konsantrasyonlarıdır. Lökositlerin etkileriyle ilgili çelişkili sonuçlar söz konusudur. Daha fazla VEGF salınımına yol açmaları, antimikrobiyal etkileri ve içerdikleri metalloproteinazların hasarlı dokunun ortamdan uzaklaştırılmasında faydalı olabileceği düşünülürken, proinflamatuar mediatör salınımı katabolik etkileri nedeniyle myotübüllerde sekonder destrüksiyona, daha büyük inflamasyona, dolayısıyla daha fazla yan etkiye yol açmaktadırlar (170, 174, 177).
3)Saf trombositten zengin fibrin (P-TZF); Trombosit ve fibrinojen içeren plazmayı beyaz ve kırmızı kan hücrelerinden ayırmak için önce ~1000g ile yavaş santrifüj uygulanır. Ayrılan plazmaya aktivatör olarak CaCl2 eklenerek yüksek hızda ~3500g santrifüj edilir. CaCl2 pıhtılaşma kaskadını başlatır ve fibrin iskeletin presipitasyonuyla klasik TZP’ den daha katı trombositten zengin, düşük lökosit
içerikli pıhtı oluşur. Yüksek fibrin içeriğinden dolayı büyüme faktörleri daha geniş bir sürede salınır, bu süre 7 güne kadar uzayabilir. Jel formda olduğu için enjekte edilemez, lezyon üzerine direk uygulanır (18).
4)Lökosit ve trombositten zengin fibrin (L-TZF); Antikoagülan ve aktivatör eklenmeden tek santrifüjle elde edilir. Yüksek konsantrasyonda lökosit içerir. P-TZF gibi yüksek fibrin içerdiği için katı formdadır. Düşük maliyetli olması ve basit yöntemle büyük miktarda ürün sağlaması nedeniyle oral, maksilla fasial cerrahide ve ortopedide kullanılır (18).