As espécies de FMA são normalmente identificadas pela morfologia dos seus esporos de resistência, embora atualmente, métodos moleculares, bioquímicos e
59 imunológicos também têm sido utilizados (MORTON & REDECKER, 2001; WALKER, 1992). Os esporos de resistência podem variar em diâmetro de espécie para espécie, abrangendo desde 15 mm a 800 mm (MIRANDA, 2008), todavia, apesar de consistirem em unidades microscópicas, os esporos de FMA apresentam alta diversidade estrutural. O processo de esporulação desses fungos é dinâmico, dependendo de múltiplos fatores, como a espécie de FMA, a planta hospedeira e as características ambientais da área de ocorrência, podendo persistir em atividade por vários anos (SMITH & READ, 2008). Levando em consideração a natureza simbiôntica obrigatória dos FMA, a avaliação da diversidade envolve procedimentos complexos. Exemplo disso reside no fato de que os FMA podem ser encontrados tanto no solo como colonizando o córtex radicular, isto é, possuem uma fase intraradical e uma fase extraradical, sendo essa última a mais utilizada para as avaliações de diversidade, mediante a coleta de glomerosporos (CÓRDOBA, 1998).
A seleção de métodos eficientes de avaliação da diversidade dos FMA é imprescindível para uma avaliação compatível com a natureza da estrutura da comunidade. Muitas vezes a diversidade de FMA pode ser subestimada, pois nem sempre os componentes da comunidade estão sob forma identificável (exemplo: em período de esporulação). Nesse contexto, métodos de amostragem complementares são importantes, como é o caso das culturas armadilhas. As culturas armadilhas permitem,na maioria das vezes, recuperar espécies não detectadas em campo após a manutenção do solo nativo em casa de vegetação, inoculado com uma planta que induz a multiplicação dos propágulos presentes na amostra. Os resultados desse procedimento consistem na obtenção de esporos em diferentes estágios de desenvolvimento e com melhor viabilidade para a identificação taxonômica (BARTZ, 2008). Outro aspecto complicador, apontado por Souza et al. (2010) trata-se falta na padronização da amostragem, visto que o número e o período de coletas variam muito entre os estudos. Além disso, os procedimentos metodológicos envolvidos no recolhimento dos esporos possuem diferentes eficiências, aumentando o grau de variabilidade do erro amostral (SOUZA et al., 2010).
Exemplo de procedimento metodológico limitador nos estudos corresponde à restrição da amostragem da zona radicular (10 – 30 cm de profundidade do solo). A atividade e a biomassa dos fungos são influenciadas pelas propriedades do solo (SOUSA, 2013), como temperatura, umidade, pH, disponibilidade de oxigênio, gás carbônico, sais minerais e presença de microrganismos, propriedades que se modificam
60 ao longo de um perfil de solo. Poucos estudos, no entanto, dedicaram atenção a levar em consideração essa variável.
Jackobsen & Nielsen (1983), em estudo desenvolvido em latossolos vermelhos distróficos, encontraram decréscimo na proporção de hifas infectadas em profundidades inferiores a 40 cm, atribuindo essa observação à baixa densidade de glomerosporos e raízes nas zonas mais profundas. Estudos posteriores demonstraram a redução da densidade de propágulos com o aumento da profundidade, comprometendo dessa forma o estabelecimento das micorrizas (AN et al., 1990; KABIR et al., 1998; YANG et al., 2010). A tendência ao decréscimo na observação da colonização micorrízica também foi observada por Zajicek et al. (1986) em ecossistemas de pradarias, onde 69% das plantas apresentaram colonização por FMA em profundidade de 60 cm e 25% das espécies estavam colonizadas em profundidade de 100 cm, contudo, apesar desse decréscimo, algumas vesículas e arbúsculos foram encontrados em em zona situada entre 120 a 140 cm e algumas raízes colonizadas também foram encontradas em profundidade de 210 cm. A espécie G. fasciculatum foi encontrada ao longo de várias profundidades em até 220 cm, embora tenha ocorrido tendência ao decréscimo com o aumento da profundidade (ZAJICEK et al., 1986), achado em contraste com o observado por Smith (1978) e Bellgrad (1993) em outros ecossistemas, a respeito da restrição da ocorrência de FMA nas zonas mais superficiais do solo.
Diferenças na esporulação foram detectadas de acordo com a planta hospedeira. Friese & Koske (1991) detectaram maior esporulação em profundidades situadas entre 20 – 28 e 30 – 38 cm do que em 10 – 18 cm em raízes de Ammophila breviligulata Fern, ao passo que Verma e Tarafadar (2010) registraram maior instensidade entre 10 – 20 cm de profundidade em Prosopis cineraria (L.) Druce. Esses achados foram corroborados por Becerra et al. (2014), em avaliação de espécies de plantas pertencentes à família
Chenopodiaceae, na qual foi possível detectar a mediação da planta hospedeira em
relação a intensidade da esporulação em zonas situadas no topo ou mais profundas do solo.
No tocante à riqueza, Cuenca et al. (2010) registraram valores estáveis em até 45 cm de profundidade presente em vegetação esclerófila. An et al. (1990) observaram a ocorrência de Am. fecundispora, Gl. macrocarpum, Gl. microcarpum e Gi. gigantea restrita ao topo do solo (15 cm) e Gl. intraradices e Gi. margarita em grandes profundidade de 30 – 45 cm, sugerindo que as espécies podem variar em termos de papéis ecológicos ao longo do gradiente de profundidade. Oehl et al. (2005)
61 encontraram ampla diversidade em zonas situadas entre 50 a 70 cm, além de também constatarem a ocorrência da esporulação de espécies em zonas específicas, com espécies ocorrentes no topo do solo bem como em zonas de maior profundidade. A modulação da distribuição das espécies em função da disponibilidade de nutrientes, tais como CO2,
matéria orgânica, P e pH, entre outros fatores, ao longo do gradiente de profundidade foi proposta por diversos autores (ANDERSON et al., 1987; RILLIG & FIELD, 2003; VERMA & TARAFADAR, 2010; SHUKLA et al., 2013a). Contudo, Shukla et al. (2013a) alertam para o fato de que mais fatores devem ser levados em consideração para explicar a distribuição dos FMA ao longo do gradiente de profundidade do solo.
Os estudos realizados sobre a distribuição de FMA ao longo de gradiente de profundidade do solo indicam a importância de que essa variável seja levada em consideração nos estudos de diversidade e debatidas, a fim de que seja obtido o máximo possível de informações sobre a composição de espécies FMA nos ecosssistemas. Apenas o entendimento mais próximo da estrutura real permitirá que os estudos com vistas à conservação e manejo possam atuar de maneira eficiente para a consolidação de seus objetivos. Levando em consideração que não existem trabalhos que busquem verificar a influência da distribuição da composição de espécies de FMA ao longo de perfil de solo submetido ao processo de fragmentação florestal, a avaliação dessa variável nesses ambientes poderá, de acordo com os resultados demonstrados nos estudos pioneiros sobre o tema em outras áreas, contribuir para uma melhor compreensão da estrutura de comunidades de FMA nos ecossistemas, sobretudo em áreas fragilizadas pela interferência antrópica. Diante dessa lacuna do conhecimento, o presente trabalho teve como objetivo avaliar a composição de espécies de FMA em diferentes níveis de profundidade do solo de fragmentos florestais de Cerrado e Mata Atlântica, contribuindo para o conhecimento da diversidade e distribuição desse grupo de fungos no país.
3. OBJETIVOS
3.1. OBJETIVO GERAL
Avaliar a composição de espécies de FMA em diferentes níveis de profundidade do solo em fragmentos florestais no bioma Cerrado, contribuindo para o conhecimento da diversidade e distribuição desse grupo de fungos.
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3.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Inventariar a diversidade de FMA em fragmentos florestais de Cerrado na fazenda Embrapa Milho e Sorgo, Sete Lagoas, Minas Gerais;
Caracterizar a estrutura de comunidades no tocante à riqueza e diversidade de FMA em função da variação na profundidade do solo.
4. MATERIAIS E MÉTODOS
4.1. ÁREA DE ESTUDO
A Fazenda Experimental Embrapa Milho e Sorgo (FEEMS) encontra-se localizada no munícipio de Sete Lagoas, Minas Gerais (latitude 19º28’S, longitude 44º15’W). A área da Empresa possui um total de 1.932,80 hectares que incluem fragmentos que variam sua fisionomia entre Cerrado e Mata Atlântica (PANOSO et al., 2002). Apresenta predominância de solos característicos de latossolos vermelho-escuro e vermelho-amarelo, ocorrendo, em menor escala, cambissolos, aluviais e hidromórficos, com clima da região do tipo AW segundo classificação de Koopen (clima de savana com inverno seco) (PEREIRA et al., 2013).
A FEEMS consiste em área estratégica para a manutenção da biodiversidade, encontrando-se situada no limite extremo da mata atlântica em Minas Gerais, na transição para a fase de cerrado; além disso, situa-se, ainda, próxima à região de influência da Caatinga e da Serra do Cipó, que faz parte da cadeia de montanhas do complexo do Espinhaço, consequentemente, tais condições contribuem para a existência de ampla variação de solos e tipos de vegetação, apresentando características peculiares (COSTA et al., 2007). A despeito de sua importância biológica, a área encontra-se sob processo de fragmentação florestal e sujeita a forte pressão advinda do crescimento urbano, originada ao sul pela expansão do vetor Norte e ao norte pela urbanização intensa do crescimento da Cidade de Sete Lagoas (EMBRAPA, 2007).
4.2. AMOSTRAGEM
As amostras foram obtidas ao longo de oito fragmentos florestais da Fazenda Embrapa Milho e Sorgo (Figura 12, Quadro 1). Todos os fragmentos ocorrentes na
63 fazenda experimental da Embrapa foram amostrados usando-se o método de parcelas (MUELLER-DOMBOIS; ELLENBERG, 1974) levando-se em consideração as recomendações do Protocolo de Medições de Parcelas Permanentes da Rede de Manejo Florestal (CTC/RMFC, 2005), com parcelas de 20 x 20 m, orientadas no sentido N-S, L-O, distantes entre 70 e 100 metros da borda do fragmento. De posse do mapa da área e da estratificação dos fragmentos por feição (topo de morros, vegetação ciliar, encostas e interflúvio), as parcelas foram alocadas em quantidade definida de modo a oferecer segurança estatística de representatividade quanto à composição e estrutura. Todos os fragmentos foram amostrados com uma parcela, a exceção dos fragmentos A, E e H, que foram amostrados com duas parcelas (A1 e A2, E1 e E2, H1 e H2) a fim de obter uma representatividade completa da heterogeneidade espacial, totalizando dessa forma, 11 subáreas de amostragem.
Em cada parcela foram abertas trincheiras para a obtenção de amostras ao longo de perfil de solo, com profundidade máxima equivalente a 230 cm. Em cada perfil, foram identificadas camadas de acordo com classificação proposta por Panoso et al. (2002). Três amostras de solo foram coletadas por camada, tendo sido destinadas para a implantação de culturas armadilhas, com ciclo de três repetições, a fim de permitir a esporulação das espécies que não estavam presentes na forma de esporos no momento da coleta e consequentemente, facilitando a identificação e avaliação da diversidade. Dessa forma, o número de amostras obtido por perfil variou de acordo com o número de camadas identificadas, relativas à morfologia dos solos considerados. A obtenção dos glomerosporos foi baseada exclusivamente em análises de amostras provenientes de culturas armadilhas.
Amostras de solo compostas de cinco tradagens (quatro de canto e uma central), coletadas entre 0 a 20 cm de profundidade, foram coletadas e destinadas a EMBRAPA para analises de granulometria e fertilidade (macro, micronutrientes e matéria orgânica). Para obtenção do isolamento dos glomerosporos, o solo foi preparado pela técnica de peneiramento úmido (GERDEMANN & NICOLSON, 1963) e centrifugação em sacarose (JENKINS, 1964).
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Figura 12. Fragmentos florestais da Fazenda Experimental Embrapa Milho e Sorgo. Fonte: COSTA,
TCC.
Quadro 1. Características ambientais dos fragmentos da Fazenda Experimental Embrapa Milho e Sorgo.
Fragmento Características¹
A Possui declividade plana a suave ondulada, possui baixa diversidade de espécies vegetais, com menor acúmulo de serapilheira e características de latossolo. Devido à sua extensão, foi divido em duas subareas (A1 e A2), o 2º com vestígios de incêndio, com última ocorrência datada em outubro de 2012. A área há aproximadamente 50 anos, era utilizada como pastagem. B Ocorre transição de Cerrado para Floresta Estacional Semidecidual.
65 inclui vestígios de incêndio de última ocorrência datada em outubro de 2012.
C Devido à disponibilidade hídrica decorrente da proximidade do lençol freático à aproximadamente 2 metros, possui características de mata ciliar. São verificadas árvores de grande porte e a maior produção de serrapilheira entre os sítios. O relevo é plano.
D A vegetação de ocorrência no Fragmento D é a Floresta Estacional Semidecidual, e está situado em uma área de acentuada declividade.
E O Fragmento E foi amostrado em dois sítios E1 e E2, ambos caracterizados pela vegetação de Floresta Estacional Semidecidual, mas se diferenciam no grau de declividade, tendo o F5/2 maior declive.
F Também no Fragmento F verifica-se a ocorrência de Floresta Estacional Semidecidual. O relevo é ondulado.
G É verificada baixa densidade de árvores e significativas clareiras no sítio do Fragmento G, estando em um local de forte declive. Este fragmento tem o maior grau de perturbação, observados indícios de incêndio.
H No Fragmento H há também uma separação em dois sítios (H1 e H2), sendo estes ambientes mais úmidos, com maior diversidade de espécies, e espessa camada de material orgânico. Fortes características de mata ciliar.
Fonte: Carvalho et al. 2013.
4.3. ANÁLISES TAXONÔMICAS
Após a extração, os glomerosporos foram separados por tamanho e cor com auxílio de estereomicroscópio e dispostos em lâminas preparadas com PVLG (álcool- polivinilico e lactoglicerol) e PVLG + reagente de Melzer para observação em microscopia de luz transmitida e avaliação taxonômica. Para a identificação das espécies foram consultados manuais de identificação e chaves taxonômicas propostos por Schenck e Pérez (1990), Goto (2009), Błaszkowski (2012) e confronto com
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descrições disponíveis em coleções internacionais
(http://www.zor.zut.edu.pl/Glomeromycota/ e http://invam.wvu.edu/) e demais literaturas pertinentes, considerando a classificação proposta por Oehl et al. (2011a) e táxons adicionais propostos por Błaszkowki (2012, 2014), Goto et al. (2012), Marinho et al. (2014) e Oehl et al. (2014).
4.4. ANÁLISES ESTATÍSTICAS
A composição de espécies de FMA foi estimada através da avaliação do número de espécies por fragmento. Os dados obtidos foram submetidos à determinação do índice de Shannon-Wiener (H’ = - Σ pi ln pi) com auxílio do software PAST versão 1.81 (MAGURRAN, 1988; HAMMER et al., 2008).
A análise exploratória dos dados foi conduzida antes da aplicação das análises estatísticas de acordo com protocolo proposto por Zuur et al. (2010). A presença de
outliers na variável resposta (N) e as variáveis explicativas (atributos físico-químicos do
solo) foi avaliada por análise gráfica de Cleveland dotplots. Para avaliação da normalidade e homocedasticidade dos dados foram aplicados o teste de Shapiro-Wilk e teste de Levene, respectivamente (SHAPIRO & WILK, 1965; LEVENE, 1960). Uma matriz de gráfico de dispersão e de colinearidade foram elaboradas para a identificação do tipo de relação entre as variáveis (presença ou ausência de linearidade) e remoção de colinearidade. A análise exploratória de dados foi aplicada com auxílio do software R (versão 2.4) (R DEVELOPMENT CORE TEAM, 2011), com a utilização dos pacotes lawstat e lattice (SARKAR, 2008; GASTWIRTH et al., 2015).
As análises estatísticas foram conduzidas seguindo modelos não paramétricos, em conformidade com a ausência de normalidade e homocedasticidade observada nos dados. Para detectar a presença de correlação entre o número de espécies e os fragmentos e entre as variáveis ambientais consideradas, foi aplicada um teste de correlação de Kendall com auxílio do software PAST versão 1.81 (HAMMER et al., 2008). O teste de Kruskal-Wallis foi aplicado com auxílio do software R (versão 2.4) (R DEVELOPMENT CORE TEAM, 2011) para comparar a distribuição do número de espécies e índice de diversidade de Shannon-Wiener em relação aos fragmentos e as zonas de profundidade amostradas, respectivamente. Para aplicação do teste de Kruskal- Wallis, as zonas de profundidade foram classificadas em um total de sete intervalos: I: 0 – 20 cm; II: 20 – 40 cm; III: 40 – 60 cm; IV: 60 – 80 cm; V: 80 – 120 cm; VI: 120 – 160
67 cm e VII: 160 – 230 cm. As médias foram comparadas pelo teste de Tukey. Para todas as análises univariadas o nível de significância considerado foi de 5% (ZAR, 2010).
No tocante à similaridade da composição de espécies da área estudada, a diversidade beta foi quantificada de uma matriz binária (presença/ ausência das espécies por fragmento florestal) pelo índice de similaridade de Jaccard, definido pela fórmula a/(a + b + c) (JACCARD, 1901). A partir da matriz de similaridade obtida pelo cálculo do índice de Jaccard foi aplicada uma análise de agrupamento hierárquico utilizando-se o método da ligação média entre grupos (UPGMA) (LEGENDRE & LEGENDRE, 1988). Uma análise gráfica da largura da silhueta foi aplicada para a verificação do número de agrupamentos plausíveis de acordo com a configuração dos dados gerados pela análise de agrupamento hierárquico (ROUSSEEUW, 1987). As espécies indicadoras de cada fragmento foram obtidas pela Análise de Espécies Indicadoras (ISA), a fim de verificar a especificidade e fidelidade aos grupos de ocorrência (DUFRÊNE e LEGENDRE, 1997). As variáveis ambientais foram submetidas a uma análise de redundância (RDA) a fim de obter as variáveis explicativas mais relacionadas com a distribuição de FMA do solo (BONFIM et al., 2015). A significância da RDA foi analisada por uma ANOVA. Todas as análises multivariadas foram desenvolvidas com auxílio do software R (versão 2.14) (R DEVELOPMENT CORE TEAM, 2011), com a utilização dos pacotes ade4, cluster, FD, gclus, labdsv pvclust e vegan (DRAY & DUFOUR, 2007; HURLEY, 2012; LALIBERTÉ et al., 2014; MAECHLER, 2014; OKSANEN et al., 2013; ROBERTS, 2015; SUZUKI & SHIMODARIA, 2014).
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1. COMPOSIÇÃO DE ESPÉCIES DE FUNGOS MICORRÍZICOS