5.1. Sonuçlar
ÇalıĢma, E. pallida (Nutt.) Nutt. ve E. purpurea L. Moench türlerinde, kallus ve sürgün kültürlerinin oluĢturulması ile etkili bir rejenerasyon sisteminin belirlenmesi, in
vitro Ģartlar altında sekonder metabolit içeriğinin artırılmasına yönelik kültür
koĢullarının optimizasyonu ve farklı elisitör uygulamalarının araĢtırılması olmak üzere üç ana konu üzerinde yürütülmüĢtür.
Her iki türün kallus kültürlerinde yaprak, yaprak sapı, kotiledon ve kök eksplantlarının her birinde farklı büyüme düzenleyicisi kombinasyonlarında baĢarılı bir Ģekilde kallus oluĢumu sağlanmıĢtır. Kallus ağırlığı bakımından eksplant tipine ve büyüme düzenleyicilerine bağlı olarak farklı sonuçlar elde edilmekle birlikte, genellikle her iki türde de kotiledon eksplantından elde edilen kallus dokularında en yüksek kallus taze ağırlığına (E. purpurea L. türünde 2179 mg, E. pallida türünde 1148 mg) ulaĢılmıĢtır.
Farklı eksplant tiplerinde kallus kültürlerinin baĢlatılmasında, etkili ve tekrar edilebilen bir rejenerasyon sisteminin kurulmasının yanı sıra her eksplant tipinde en iyi kallus geliĢimini sağlayan büyüme düzenleyicisinin belirlenmesi ve bu büyüme düzenleyicilerinin kallus dokularında sekonder metabolit miktarlarına etkisinin tespit edilmesi amaçlanmıĢtır. Bu amaçla her eksplant tipi için kallus verimliliği değeri hesaplanmıĢ ve bu sonuca göre her bir bitki türü ve eksplant tipi için en yüksek kallus verim değerine sahip büyüme düzenleyicisi tipi ve konsantrasyonu belirlenmiĢtir.
E. purpurea L. türü için kallus verimliliği değerlerine göre; yaprak eksplantı için
1.0 mg/l 2,4-D + 2.0 mg/l BAP, yaprak sapı için 1.0 mg/l NAA + 0.5 mg/l TDZ, kotiledon eksplantı için 2.0 mg/l NAA + 1.0 mg/l TDZ ve kök eksplantı için 0.5 mg/l NAA + 0.5 mg/l BAP büyüme düzenleyicisi kombinasyonları belirlenmiĢtir.
E. pallida türü için kallus verimliliği değerlerine göre; yaprak eksplantı için 0.2
mg/l NAA + 1.0 mg/l TDZ, yaprak sapı eksplantı için 4.0 mg/l NAA + 0.5 mg/l TDZ, kotiledon eksplantı için 4.0 mg/l NAA + 0.2 mg/l TDZ ve kök eksplantı için 0.5 mg/l NAA + 0.2 mg/L TDZ büyüme düzenleyicisi kombinasyonları belirlenmiĢtir.
ÇalıĢmanın bundan sonraki kallus kültürü aĢamaları, her eksplant tipi için belirlenen büyüme düzenleyicisi kombinasyonlarında devam etmiĢtir. Her iki bitki türünün, dört farklı eksplant tipi belirlenen büyüme düzenleyicilerinde 4, 6, 8 ve 10
hafta boyunca kültüre alınmıĢ ve elde edilen kallus dokularında kaftarik asit, klorojenik asit, kafeik asit ve kikorik asit miktarları belirlenmiĢtir. Böylece bu büyüme düzenleyicilerinde bitkinin farklı kısımlarından elde edilen kallus dokularında, farklı kültür sürelerinin kafeik asit türevlerinin miktarları üzerine etkileri belirlenmiĢ olmaktadır. Elde edilen sonuçlara göre en yüksek kaftarik asit (4.11 mg/g), klorojenik asit (8.83 mg/g) ve kikorik asit (57.89 mg/g) miktarlarına E. purpurea L. türünün yaprak sapı ve kök eksplantlarından 10 haftalık kültür süresi sonunda elde edilen kalluslarda ulaĢılmıĢtır. Genel olarak değerlendirildiğinde; özellikle E. purpurea L. türünde kafeik asit türevlerinin miktarları kültür süresinin artmasına bağlı olarak artıĢ göstermiĢtir.
Kallus kültürlerinde sekonder metabolit üretimini artırmaya yönelik uygulamalar en yüksek kaftarik asit, klorojenik asit ve kikorik asit miktarlarının elde edildiği E.
purpurea L. türünün kök ve yaprak sapı eksplant tiplerinde ve 10 haftalık kültür süresi
boyunca devam etmiĢtir. Besin ortamında yer alan beslenme faktörlerinin (azot miktarı, karbon kaynağı tipi ve miktarı) değiĢiminin ve besin ortamında oluĢturulan abiyotik elisitörin (kuraklık) kafeik asit türevlerinin miktarlarına etkisi belirlenmiĢtir. Bu uygulamalar arasında, en yüksek kaftarik asit (9.38 mg/g), klorojenik asit (0.71 mg/g), kafeik asit (0.29 mg/g) ve kikorik asit (34.77 mg/g) miktarlarına, 0:35 mM amonyum/nitrat oranı içeren besin ortamında 10 haftalık kültür süresi sonunda kök eksplantından elde edilen kallus dokularında ulaĢılmıĢtır.
ÇalıĢmanın in vitro çoğaltım basamaklarından biri olan sürgün kültürlerinde, rejenerasyon ve mikroçoğaltımı gerçekleĢtirebilmek için her iki türde indirekt ve direkt sürgün uyarımı oluĢturulmuĢtur. E. purpurea L. türünde indirekt sürgün uyarımı gerçekleĢtirilememiĢ, E. pallida türünde ise indirekt sürgün uyarımında, en yüksek sürgün oluĢturan eksplant yüzde değeri (%81) 1.0 mg/l NAA içeren besin ortamında kotiledon eksplantlarından elde edilip, 0.5 mg/l BAP içeren ortama aktarılan kalluslarda elde edilmiĢtir. En yüksek eksplant baĢına sürgün sayısı değerine (2.58 adet) 0.5 mg/l NAA içeren besin ortamında kök eksplantından elde edilen kalluslarda ulaĢılmıĢtır.
Direkt sürgün kültürleri her iki türde de baĢarılı bir Ģekilde gerçekleĢtirilmiĢtir.
E. purpurea L. türünde en yüksek sürgün oluĢturan eksplant oranı (%90) farklı
konsantrasyonlarda BAP ve KIN içeren ortamlarda, eksplant baĢına sürgün sayısı değeri ise (3.47 adet) 0.50 mg/l BAP + 0.10 mg/l NAA içeren ortamda elde edilmiĢtir. E.
pallida türünde ise en yüksek sürgün oluĢturan eksplant oranı (%90) BAP ve BAP‘ın
adet) 0.50 mg/l BAP + 0.50 mg/l NAA içeren ortamda elde edilmiĢtir. Her iki türde de elde edilen sürgünler IBA içeren ve içermeyen ortamlarda köklendirilmiĢ, E. purpurea L. türünde en yüksek köklenme oranı %29, E. pallida türünde ise %6 oranında IBA içermeyen ortamlarda elde edilmiĢtir.
Elde edilen sürgünlerde farklı tip ve konsantrasyonlardaki büyüme düzenleyicilerinin kaftarik asit, klorojenik asit, kafeik asit ve kikorik asit miktarlarına etkileri tespit edilmiĢtir. Böylece çoklu sürgün uyarımını teĢvik eden büyüme düzenleyicisinin belirlenmesinin yanı sıra en yüksek kaftarik asit, klorojenik asit, kafeik asit ve kikorik asit miktarlarının elde edildiği büyüme düzenleyicisi tipi ve konsantrasyonu da belirlenmiĢ olmaktadır. E. purpurea L. türünde, en yüksek kaftarik asit miktarı (7.41 mg/g) 4.0 mg/l BAP, klorojenik asit miktarı (5.04 mg/g) 2.0 mg/l KIN, en yüksek kikorik asit miktarları ise (46.27 ve 45.22 mg/g) sırasıyla 4.0 mg/l KIN + 0.5 mg/l NAA ve 2.0 mg/l BAP + 0.5 mg/l NAA içeren ortamlardan elde edilen sürgünlerde tespit edilmiĢtir. Kafeik asit miktarı, BAP dıĢındaki diğer büyüme düzenleyicisi konsantrasyonlarında tespit edilememiĢtir. E. pallida türünde ise en yüksek kaftarik asit miktarı (6.43 mg/g) 4.0 mg/l BAP + 0.1 mg/l NAA, en yüksek klorojenik asit miktarı (3.47 mg/g) 0.50 mg/l BAP + 0.1 mg/l NAA, en yüksek kikorik asit miktarı ise (24.83 mg/g) 1.0 mg/l BAP içeren ortamlarda elde edilen sürgünlerde tespit edilmiĢtir. Kafeik asit miktarları genelde tüm büyüme düzenleyicilerinde düĢük ve birbirine yakın miktarlarda elde edilmiĢ olup, en yüksek değer (0.24 mg/g) 4.0 mg/l BAP + 0.1 mg/l NAA içeren ortamdan elde edilen sürgünlerde belirlenmiĢtir. Genel olarak değerlendirildiğinde; E. purpurea L. sürgün kültürlerinde kafeik asit türevlerinin
miktarları bakımından sitokinin kaynakları arasında BAP ve KIN, TDZ‘ye göre daha etkili bulunurken, E. pallida sürgün kültürlerinde ise sitokinin kaynakları arasında BAP‘ın, KIN ve TDZ‘ye göre daha etkili olduğu belirlenmiĢtir.
In vitro fide ve köklerde, farklı uygulamalar sonucunda elde edilen sürgünlerde,
köklerde ve kallus dokularında en yüksek kafeik asit türevlerinin miktarları % ve mg/g olarak belirlenmiĢ Çizelge 5.1‘de verilmiĢtir. Ex vitro da elde edilen değerlerle (Gülpınar, 2009) kıyaslandığında, çalıĢmamızda in vitro sürgün, kök ve kallus dokularında tarla Ģartlarına göre bazı uygulamalarda daha yüksek kafeik asit türevleri elde edildiği tespit edilmiĢtir. Bu değerler Avrupa Farmakopesine göre değerlendirildiğinde in vitro Ģartlarda tespit edilen bazı kafeik asit türevlerinin E.U. Farmakope standartlarını karĢıladığı görülmüĢtür.
Çizelge 5.1. Farklı ortam koĢullarında elde edilen ekinezya türlerinin kafeik asit türevlerinin miktarları (% kuru madde üzerinden)
E. purpurea E. pallida
Kafeik asit
türevleri Kök Herba Kök Herba
Ex vitro bitki (Tarla Ģartları)
Kaftarik asit 0.24-0.41 0.18-0.82 0.06-0.10 0.02 Klorojenik asit - 0.01-0.08 - - Kafeik asit - - - - Kikorik asit 0.6-2.4 0.52-4.93 0.04-0.5 0.12 In vitro fide Kaftarik asit 0.12 (1.28mg/g) 0.05 (0.51mg/g) 0.12 (1.22mg/g) 0.22 (2.16mg/g) Klorojenik asit 0.02 (0.19mg/g) - 0.01 (0.15mg/g) - Kafeik asit - 0.008 (0.08mg/g) 0.01 (0.09mg/g) 0.03 (0.26mg/g) Kikorik asit 0.26 (2.66mg/g) 0.10 (0.98mg/g) 0.04 (0.35mg/g) 0.29 (2.86mg/g) In vitro sürgün Kaftarik asit 0.02 (2.41mg/g) 1.5 (14.97mg/g) 0.64 (6.43mg/g) - Klorojenik asit 0.05 (5.04mg/g) 0.04 (3.65mg/g) 0.35 (3.47mg/g) - Kafeik asit 0.02 (0.18mg/g) 0.01 (0.07mg/g) 0.02 (0.24mg/g) - Kikorik asit 4.63 (46.27mg/g) 7.22 (72.26mg/g) 2.48 (24.83mg/g) - In vitro kallus Kaftarik asit 0.09 (9.38 mg/g) 0.04 (0.40 mg/g) Klorojenik asit 0.09 (8.83mg/g) 0.37 (3.73 mg/g) Kafeik asit 0.01 (0.12 mg/g) - Kikorik asit 5.80 (57.89 mg/g) 0.20 (1.98 mg/g)
Bu tez çalıĢmasının sonucunda, hem tıbbi hem ekonomik açıdan değerli iki ekinezya türünde kallus ve sürgün kültürleri aracılığıyla etkili ve tekrarlanabilen rejenerasyon ve mikroçoğaltım protokolleri belirlenmiĢ olup, aynı zamanda in vitro koĢullarda kafeik asit türevlerinin içeriğinin artırılmasına yönelik kültür koĢullarının optimizasyonu gerçekleĢtirilmiĢ ve farklı uygulamaların etkileri belirlenmiĢtir.
5.2. Öneriler
Ġnsanların bilinçlenerek sağlıklarına daha fazla önem göstermesiyle birlikte sadece besinlerde değil kullanılan ilaçlar, kozmetik ürünleri, temizlik maddeleri, tarım ilaçlarında da doğal olanlara talep hızla artmıĢtır. Bunun sonucunda hammadde kaynağı olan bitkilerin araĢtırılması, yetiĢtirilmesi ve ürün miktarının arttırılması çalıĢmaları hız kazanmıĢtır. BaĢta Avrupa ülkeleri olmak üzere birçok ülke özellikle ilaç ve kozmetik sanayinin hammaddelerini oluĢturan bitkileri üreterek ve iĢleyerek ekonomilerine büyük katkılar sağlamaktadır. Ülkemizde bu çalıĢmalar son yıllarda hız kazanmıĢ olmakla birlikte istenilen düzeye henüz ulaĢamamıĢtır
Türkiye‘nin ilaç ham maddesine ödediği dövizi bir miktar azaltmak ve ülkemizin kendi imkânları ile kendi ilacının ham maddesini karĢılamasını sağlayabilmesi için tıbbi bitkilerin kültürünün yaygınlaĢtırılması ve in vitro koĢullarda
sekonder metabolitlerin elde edilmesi oldukça önemlidir. Bu bağlamda, ekinezya türlerinde ülkemizde yapılan agronomik çalıĢmaların yanı sıra alternatif bir yöntem olan bitki hücre ve doku kültürleri yoluyla sekonder metabolitlerin üretilmesi ve optimum in
vitro kültür koĢulları belirlenerek sekonder metabolit içeriğinin artırılmasına yönelik
araĢtırmalar, endüstriyel anlamda üretiminin geliĢmesi özellikle ilaç sanayinde değerlendirilmesi sağlanarak ekonomimize kazandırılması açısından büyük önem arz etmektedir.
KAYNAKLAR
Abbasi, B. H., Saxena, P. K., Murch, S. J. ve Liu, C.-Z., 2007a, Echinacea biotechnology: Challenges and opportunities, In Vitro Cellular & Developmental Biology - Plant, 43 (6), 481-492.
Abbasi, B. H., Tian, C.-L., Murch, S. J., Saxena, P. K. ve Liu, C.-Z., 2007b, Light- enhanced caffeic acid derivatives biosynthesis in hairy root cultures of Echinacea purpurea, Plant cell reports, 26 (8), 1367-1372.
Abbasi, B. H., Stiles, A. R., Saxena, P. K. ve Liu, C.-Z., 2012, Gibberellic acid increases secondary metabolite production in Echinacea purpurea hairy roots,
Applied biochemistry and biotechnology, 168 (7), 2057-2066.
Açıkgöz, M. A., Kara, ġ. M., Ebru, B. ve OdabaĢ, S., 2018a, Effect of light on biosynthesis of alkamide, caffeic acid derivatives and echinacoside in Echinacea purpurea L. callus cultures, Akademik Ziraat Dergisi, 7 (2), 179-184.
Açıkgöz, M. A., Yarılgac, T. ve Kara, S. M., 2018b, Enhancement of Phytochemical Compounds Using Biotic and Abiotic Elicitors in Purple Coneflower (Echinacea purpurea L.), Indian Journal of Pharmaceutical Education and Research, 52 (4s), s140-s145.
Ahmed, M. R. ve Anis, M., 2012, Role of TDZ in the quick regeneration of multiple shoots from nodal explant of Vitex trifolia L.—an important medicinal plant,
Applied biochemistry and biotechnology, 168 (5), 957-966.
Akbudak, M. A. ve Babaoglu, M., 2005, Callus induction in small flowered willow herb (Epilobium parviflorum Schreb), Journal of plant biochemistry and
biotechnology, 14 (2), 189-191.
Ali, M. ve Abbasi, B. H., 2014, Thidiazuron-induced changes in biomass parameters, total phenolic content, and antioxidant activity in callus cultures of Artemisia absinthium L, Applied biochemistry and biotechnology, 172 (5), 2363-2376. Ali, M., Abbasi, B. H., Ahmad, N., Ali, S. S., Ali, S. ve Ali, G. S., 2016, Sucrose-
enhanced biosynthesis of medicinally important antioxidant secondary metabolites in cell suspension cultures of Artemisia absinthium L, Bioprocess
and biosystems engineering, 39 (12), 1945-1954.
Amoo, S. O. ve Van Staden, J., 2013, Influence of plant growth regulators on shoot proliferation and secondary metabolite production in micropropagated Huernia hystrix, Plant Cell, Tissue and Organ Culture (PCTOC), 112 (2), 249-256. Ardjomand-Woelkart, K. ve Bauer, R., 2016, Review and assessment of medicinal
safety data of orally used Echinacea preparations, Planta Medica, 82 (01/02), 17-31.
Azay-Milhau, J., Ferrare, K., Leroy, J., Aubaterre, J., Tournier, M., Lajoix, A.-D. ve Tousch, D., 2013, Antihyperglycemic effect of a natural chicoric acid extract of chicory (Cichorium intybus L.): a comparative in vitro study with the effects of caffeic and ferulic acids, Journal of ethnopharmacology, 150 (2), 755-760. Barnes, J., Anderson, L. A., Gibbons, S. ve Phillipson, J. D., 2005, Echinacea species
(Echinacea angustifolia (DC.) Hell., Echinacea pallida (Nutt.) Nutt., Echinacea purpurea (L.) Moench): a review of their chemistry, pharmacology and clinical properties, Journal of Pharmacy and Pharmacology, 57 (8), 929-954.
Barrett, B., 2003, Medicinal properties of Echinacea: a critical review, Phytomedicine, 10 (1), 66-86.
Barz, W., Daniel, S., Hinderer, W., Jaques, U., Kessmann, H., Köster, J. ve Tiemann, K., 1988, Elicitation and metabolism of phytoalexins in plant cell cultures, In: Plant cell biotechnology, Eds: Springer, p. 211-230.
Basalma, D., Uranbey, S., Gürlek, D. ve Özcan, S., 2008, TDZ-induced plant regeneration in Astragalus cicer L, African Journal of Biotechnology, 7 (8). Bauer, R. ve Remiger, P., 1989, TLC and HPLC analysis of alkamides in Echinacea
drugs1, 2, Planta Medica, 55 (04), 367-371.
Bauer, R., Remiger, P., Jurcic, K. ve Wagner, H., 1989, Influence of Echinacea extracts on phagocytotic activity, Z. Phytother, 10, 43-48.
Bauer, R. ve Wagner, H., 1990, Echinacea: handbuch für ärzte, apotheker und andere naturwissenschaftler, Wissenschaftliche Verlagsgesellschaft Stuttgart, p.
Bergeron, C., Gafner, S., Batcha, L. L. ve Angerhofer, C. K., 2002, Stabilization of caffeic acid derivatives in Echinacea purpurea L. glycerin extract, Journal of
Agricultural and Food Chemistry, 50 (14), 3967-3970.
Bhagyalakshmi, N., Thimmaraju, R. ve Narayan, M., 2004, Various hexoses and di- hexoses differently influence growth, morphology and pigment synthesis in transformed root cultures of red beet (Beta vulgaris), Plant cell, tissue and organ
culture, 78 (2), 183-195.
Binns, S., Baum, B. ve Arnason, J., 2002a, A taxonomic revision of the genus Echinacea (Heliantheae; Asteraceae), Systematic Botany, 27 (3), 610-632.
Binns, S. E., Arnason, J. T. ve Baum, B. R., 2002b, Phytochemical variation within populations of Echinacea angustifolia (Asteraceae), Biochemical systematics
and ecology, 30 (9), 837-854.
Blakesley, D. ve Constantine, D., 1992, Uptake and metabolism of 6-benzyladenine in shoot cultures of a range of species, Plant cell, tissue and organ culture, 28 (2), 183-186.
Bruni, R., Brighenti, V., Caesar, L. K., Bertelli, D., Cech, N. B. ve Pellati, F., 2018, Analytical methods for the study of bioactive compounds from medicinally used Echinacea species, J Pharm Biomed Anal, 160, 443-477.
Butiuc-Keul, A.-L., Vlase, L. ve CrăciunaĢ, C., 2012, Clonal propagation and production of cichoric acid in three species of Echinaceae, In Vitro Cellular &
Developmental Biology-Plant, 48 (2), 249-258.
Chen, R., Yang, Y. ve Wu, H., 2016, A comparative study on rooting of in vitr o regenerated shoots in haploid, diploid and tetraploid purple coneflower (Echinacea purpurea L.), Biotechnology & Biotechnological Equipment, 30 (1), 44-48.
Chhipa, N. M., Patel, K. M., Ganchi, S. P. ve Sen, D. J., 2014, Chicoric acid and its analogues as an anti-HIV integrase agents, World J Pharm Pharm Sci, 3 (2), 2321-2335.
Chicca, A., Adinolfi, B., Martinotti, E., Fogli, S., Breschi, M. C., Pellati, F., Benvenuti, S. ve Nieri, P., 2007, Cytotoxic effects of Echinacea root hexanic extracts on human cancer cell lines, Journal of ethnopharmacology, 110 (1), 148-153. Choffe, K. L., Murch, S. J. ve Saxena, P. K., 2000a, Regeneration of Echinacea
purpurea: induction of root organogenesis from hypocotyl and cotyledon explants, Plant cell, tissue and organ culture, 62 (3), 227-234.
Choffe, K. L., Victor, J. M., Murch, S. J. ve Saxena, P. K., 2000b, In vitro regeneration of Echinacea purpurea L.: direct somatic embryogenesis and indirect shoot organogenesis in petiole culture, In Vitro Cellular & Developmental Biology-
Plant, 36 (1), 30-36.
Coenen, C. ve Lomax, T. L., 1997, Auxin—cytokinin interactions in higher plants: old problems and new tools, Trends in plant science, 2 (9), 351-356.
Coker, P. ve Camper, N., 2000, In vitro culture of Echinacea purpurea L, Journal of
Coste, A., Vlase, L., Halmagyi, A., Deliu, C. ve Coldea, G., 2011, Effects of plant growth regulators and elicitors on production of secondary metabolites in shoot cultures of Hypericum hirsutum and Hypericum maculatum, Plant Cell, Tissue
and Organ Culture (PCTOC), 106 (2), 279-288.
Cui, H.-Y., Baque, M. A., Lee, E.-J. ve Paek, K.-Y., 2013, Scale-up of adventitious root cultures of Echinacea angustifolia in a pilot-scale bioreactor for the production of biomass and caffeic acid derivatives, Plant biotechnology reports, 7 (3), 297- 308.
Cui, X.-H., Murthy, H. N., Wu, C.-H. ve Paek, K.-Y., 2010, Adventitious root suspension cultures of Hypericum perforatum: effect of nitrogen source on production of biomass and secondary metabolites, In Vitro Cellular &
Developmental Biology-Plant, 46 (5), 437-444.
Currier, N. L. ve Miller, S. C., 2002, The effect of immunization with killed tumor cells, with/without feeding of Echinacea purpurea in an erythroleukemic mouse model, The Journal of Alternative & Complementary Medicine, 8 (1), 49-58. ÇalıĢkan, Ö. ve OdabaĢ, M., 2011, Ekinezya (Echinacea sp.) Türleri, Genel Özellikleri
ve YetiĢtiriciliği Anadolu Tarım Bilimleri Dergisi, 26 (3), 265-270.
Çelik, S. A., 2016, Ekinezya türlerinde (Echinacea spp.) bazı sekonder metabolitlerin miktarlarının ve biyolojik aktivitelerinin belirlenmesi, Selçuk Üniversitesi Fen
Bilimleri Enstitüsü.
Çelik, S. A. ve Kan, Y., 2019, Ekinezya Türlerinde Uçucu Yağ Verim ve BileĢenlerinin Belirlenmesi, Erciyes Tarım ve Hayvan Bilimleri Dergisi, 2 (2), 7-14.
Dahanayake, N., Chen, X.-L., Zhao, F.-C. ve Yang, Y.-C., 2011, An efficient in vitro propagation system for purple cone-flower (Echinacea purpurea L.), Tropical
Agricultural Research and Extension, 13 (2).
Demirezer, Ö., Ersöz, T., Saraçoğlu, Ġ. ve ġener, B., 2007, Tedavide Kullanılan Bitkiler ―FFD Monografları‖, NM Medikal, Nobel Tıp Kitabevi, 73-86.
Dhar, U. ve Joshi, M., 2005, Efficient plant regeneration protocol through callus for Saussurea obvallata (DC.) Edgew.(Asteraceae): effect of explant type, age and plant growth regulators, Plant cell reports, 24 (4), 195-200.
Dodds, J. ve Roberts, L., 1987, Plant tissue culture, Cambridge University Press. New York, p.
Dörnenburg, H. ve Knorr, D., 1995, Strategies for the improvement of secondary metabolite production in plant cell cultures, Enzyme and microbial technology, 17 (8), 674-684.
Erkoyuncu, M. T. ve Yorgancılar, M., 2016, Bitki doku kültürü yöntemleri ile sekonder metabolitlerin üretimi, Selçuk Tarım Bilimleri Dergisi, 2 (1), 66-76.
Facino, R. M., Carini, M., Aldini, G., Marinello, C., Arlandini, E., Franzoi, L., Colombo, M., Pietta, P. ve Mauri, P., 1993, Direct characterization of caffeoyl esters with antihyaluronidase activity in crude extracts from Echinacea angustifolia roots by fast atom bombardment tandem mass spectrometry,
Farmaco (Societa chimica italiana: 1989), 48 (10), 1447-1461.
Facino, R. M., Carini, M., Aldini, G., Saibene, L., Pietta, P. ve Mauri, P., 1995, Echinacoside and caffeoyl conjugates protect collagen from free radical-induced degradation: a potential use of Echinacea extracts in the prevention of skin photodamage, Planta Medica, 61 (06), 510-514.
Faisal, M., Ahmad, N. ve Anis, M., 2007, An efficient micropropagation system for Tylophora indica: an endangered, medicinally important plant, Plant
Fattorini, L., Veloccia, A., Della Rovere, F., D‘Angeli, S., Falasca, G. ve Altamura, M., 2017, Indole-3-butyric acid promotes adventitious rooting in Arabidopsis thaliana thin cell layers by conversion into indole-3-acetic acid and stimulation of anthranilate synthase activity, BMC plant biology, 17 (1), 121.
Gadzovska, S., Maury, S., Delaunay, A., Spasenoski, M., Hagège, D., Courtois, D. ve Joseph, C., 2013, The influence of salicylic acid elicitation of shoots, callus, and cell suspension cultures on production of naphtodianthrones and phenylpropanoids in Hypericum perforatum L, Plant Cell, Tissue and Organ
Culture (PCTOC), 113 (1), 25-39.
George, E. F., Hall, M. A. ve De Klerk, G.-J., 2008, Plant tissue culture procedure- background, In: Plant propagation by tissue culture, Eds: Springer, p. 1-28. Goyal, S. ve Ramawat, K., 2008, Synergistic effect of morphactin on cytokinin-induced
production of isoflavonoids in cell cultures of Pueraria tuberosa (Roxb. ex. Willd.) DC, Plant growth regulation, 55 (3), 175-181.
Grąbkowska, R., Matkowski, A., Grzegorczyk-Karolak, I. ve Wysokińska, H., 2016, Callus cultures of Harpagophytum procumbens (Burch.) DC. ex Meisn.; production of secondary metabolites and antioxidant activity, South African
journal of botany, 103, 41-48.
Grassmann, J., Hippeli, S. ve Elstner, E. F., 2002, Plant‘s defence and its benefits for animals and medicine: role of phenolics and terpenoids in avoiding oxygen stress, Plant Physiology and Biochemistry, 40 (6-8), 471-478.
Grzegorczyk-Karolak, I., Kuźma, Ł. ve Wysokińska, H., 2015, The effect of cytokinins on shoot proliferation, secondary metabolite production and antioxidant potential in shoot cultures of Scutellaria alpina, Plant Cell, Tissue and Organ
Culture (PCTOC), 122 (3), 699-708.
Gundlach, H., Müller, M. J., Kutchan, T. M. ve Zenk, M. H., 1992, Jasmonic acid is a signal transducer in elicitor-induced plant cell cultures, Proceedings of the
National Academy of Sciences, 89 (6), 2389-2393.
Gülpınar, A., 2009, Türkiye'de Kültürü Yapılan Echınacea Purpurea (L.) Moench ve Echınacea Pallıda (Nutt.) Nutt. Türleri Üzerinde Farmakognozik AraĢtırmalar,
Yüksek Lisans Tezi, Ankara Üniversitesi Sağlık Bilimleri Enstitüsü.
Harbage, J. F., 2001, Micropropagation of Echinacea angustifolia, E. pallida, and E. purpurea from stem and seed explants, HortScience, 36 (2), 360-364.
Haroon, A., 2010, Propagation of Pecan (Carya illinoensis) using in vitro techniques,
University of The Punjab Lahore, Pakistan.
Hesami, M. ve Daneshvar, M. H., 2016, Regeneration from callus which is produced from cotyledon of Antirrhinum majus, Indo-Amer. J. Agr. Vet. Sci., 4, 20-24. Hobbs, C., 1994, Echinacea: a literature review, HerbalGram, 30 (Suppl), 33-47.
Hu, C. ve Kitts, D. D., 2000, Studies on the antioxidant activity of Echinacea root extract, Journal of Agricultural and Food Chemistry, 48 (5), 1466-1472.
Hudson, J. ve Vimalanathan, S., 2011, Echinacea—A source of potent antivirals for respiratory virus infections, Pharmaceuticals, 4 (7), 1019-1031.
Huetteman, C. A. ve Preece, J. E., 1993, Thidiazuron: a potent cytokinin for woody plant tissue culture, Plant cell, tissue and organ culture, 33 (2), 105-119.
Ishii, Y., Takamura, T., Goi, M. ve Tanaka, M., 1998, Callus induction and somatic embryogenesis of Phalaenopsis, Plant cell reports, 17 (6-7), 446-450.
Jayapaul, K., Kishor, P. K. ve Reddy, K. J., 2005, Production of pyrroloquinazoline alkaloid from leaf and petiole-derived callus cultures of Adhatoda zeylanica, In
Jayaraman, S., Daud, N. H., Halis, R. ve Mohamed, R., 2014, Effects of plant growth regulators, carbon sources and pH values on callus induction in Aquilaria malaccensis leaf explants and characteristics of the resultant calli, Journal of
Forestry Research, 25 (3), 535-540.
Jones, A. M. P., Saxena, P. K. ve Murch, S. J., 2009a, Elicitation of secondary metabolism inEchinacea purpureaL. by gibberellic acid and triazoles,
Engineering in Life Sciences, 9 (3), 205-210.
Jones, A. M. P., Saxena, P. K. ve Murch, S. J., 2009b, Elicitation of secondary metabolism in Echinacea purpurea L. by gibberellic acid and triazoles,
Engineering in Life Sciences, 9 (3), 205-210.
Jones, M. P., Yi, Z., Murch, S. J. ve Saxena, P. K., 2007, Thidiazuron-induced regeneration of Echinacea purpurea L.: micropropagation in solid and liquid culture systems, Plant cell reports, 26 (1), 13-19.
Kabganian, R., Carrier, D., Rose, P., Abrams, S. ve Sokhansanj, S., 2003, Localization of alkamides, echinacoside and cynarin with Echinacea angustifolia, Journal of
Herbs, Spices & Medicinal Plants, 10 (2), 73-81.
Kalidass, C., Mohan, V. R. ve Daniel, A., 2009, Effect of auxin and cytokinin on vincristine production by callus cultures of Catharanthus roseus L.(apocynaceae), Tropical and Subtropical Agroecosystems, 12 (2), 283-288. Karimi, N., Behbahani, M., Dini, G. ve Razmjou, A., 2018, Enhancing the secondary
metabolite and anticancer activity of Echinacea purpurea callus extracts by treatment with biosynthesized ZnO nanoparticles, Advances in Natural Sciences:
Nanoscience and Nanotechnology, 9 (4), 045009.
Karuppusamy, S., 2009, A review on trends in production of secondary metabolites from higher plants by in vitro tissue, organ and cell cultures, Journal of
Medicinal Plants Research, 3 (13), 1222-1239.
Kasai, H., Fukada, S., Yamaizumi, Z., Sugie, S. ve Mori, H., 2000, Action of chlorogenic acid in vegetables and fruits as an inhibitor of 8- hydroxydeoxyguanosine formation in vitro and in a rat carcinogenesis model,