4. ARAġTIRMA SONUÇLARI VE TARTIġMA
4.1. Kallus Kültürleri
4.1.2. Echinecea pallida türünde kallus kültürlerinin araĢtırılması
4.1.2.1. Yaprak eksplantından kallus uyarımı
E. pallida türüne ait yaprak eksplantları, kallus uyarımını gerçekleĢtirmek için
farklı tip ve konsantrasyonlarda oksin (NAA, 2,4-D) ve sitokinin (BAP, TDZ, KIN) kombinasyonlarını içeren besin ortamlarında kültüre alınmıĢtır. 4 haftalık kültür süresi sonunda, E. pallida yaprak eksplantına ait kallus oluĢum yüzdesi (%), kallus taze ağırlığı (mg) ve kallus verimliliği (mg/kallus) değerleri belirlenmiĢtir.
Kallus oluĢum yüzdelerine ait veriler arcsin transformasyonu ile dönüĢtürüldükten sonra varyans analizine tabi tutulmuĢ ve ortalama değerler Çizelge 4.9‘da verilmiĢtir. Varyans analiz sonuçlarına göre (EK-3.13), oksin uygulamaları ve oksin x sitokinin uygulamaları interaksiyonunun kallus oluĢturan eksplant yüzdesi (%) üzerine etkileri istatistiki olarak %1 seviyesinde önemli bulunurken, sitokinin uygulamalarının kallus oluĢturan eksplant yüzdesi üzerine etkisi istatistiki olarak önemsiz bulunmuĢtur. Oksin uygulamaları ortalamalarına baktığımızda en yüksek kallus oluĢum yüzde değeri (%79) 4.0 mg/l NAA uygulamasında, en düĢük kallus oluĢum yüzde değeri (%51) 1.0 mg/l 2,4-D uygulamasında elde edilmiĢtir. Oksin x sitokinin uygulamaları interaksiyonu bakımından ise en yüksek kallus oluĢum yüzde değeri (%90) hem NAA hem de 2,4-D‘nin farklı konsantrasyonlarda BAP, TDZ ve KIN ile birlikte kullanıldığı uygulamalarda elde edilirken, en düĢük kallus oluĢum yüzde değeri (%0) 2.0 mg/l 2,4-D + 1.0 mg/l TDZ ve 1.0 mg/l NAA + 0.2 mg/l KIN uygulamalarında elde edilmiĢtir (ġekil 4.9).
Çizelge 4.9.E. pallida yaprak eksplantının farklı büyüme düzenleyicilerinde kallus oluĢturma
yüzdeleri (%)
mg/l NAA 2,4-D
0.2 0.5 1.0 2.0 4.0 0.2 0.5 1.0 2.0 4.0 Ort.
K 0 54al 60ak 90a 90a 90a 84ab 71ag 62ak 60ak 51am 71
BAP
0.2 17ln 81ac 56al 90a 67aı 75ae 73af 47bm 90a 47bm 64
0.5 30hn 84ab 79ad 51am 60ak 84ab 58ak 49bm 90a 75ae 66
1.0 70ah 67aı 65aı 90a 81ac 90a 75ae 57al 71ag 65aı 73
2.0 24jn 60ak 68aı 90a 90a 0n 90a 34fn 41cm 90a 59
TDZ
0.2 63aj 73af 56al 72af 90a 70ah 73af 34fn 31gn 13mn 58
0.5 90a 43cm 64aj 30hn 90a 64aj 36en 22kn 41cm 59ak 54
1.0 73af 60ak 90a 73af 58ak 45bm 73af 75ae 0n 45bm 59
2.0 36en 77ad 75ae 47bm 59ak 17ln 60ak 90a 13mn 60ak 53
KIN
0.2 60ak 66aı 0n 90a 90a 36en 75ae 57al 75ae 90a 64
0.5 45bm 30hn 60ak 73af 90a 51am 84ab 56al 84ab 60ak 63
1.0 66aı 12mn 90a 57al 79ad 66aı 90a 11mn 84ab 84ab 64
2.0 90a 39dn 60ak 81ac 84ab 90a 29ın 69aı 56al 55al 65
Ort. 55de 58ce 66bd 72ab 79a 59ce 68ac 51e 57de 61be
LSD 0.05 (sitokinin): Ö.D. LSD 0.05 (oksin):11.25 LSD 0.05 (sitokininxoksin): 40.61
*Çizelgedeki değerlere arcsin transformasyonu uygulanmıĢtır.
E. pallida türüne ait yaprak eksplantlarında, farklı tip ve konsantrasyonda
büyüme düzenleyicilerinin kallus uyarımına etkileri incelendiğinde, sadece NAA, hem NAA hem de 2,4-D‘nin farklı konsantrasyonlarda BAP, TDZ ve KIN ile birlikte kullanıldığı ortamlarda maksimum kallus uyarımı elde edilmiĢtir. Ġki farklı oksin tipinin farklı sitokininler ile birlikte kullanılması sonucu elde edilen kalluslar, morfolojileri ve organogenik potansiyelleri açısından farklılıklar göstermektedir. NAA kombinasyonu sonucu elde edilen kalluslar yeĢil, taneli ve sıkı yapıda olup, özellikle düĢük dozlardaki NAA konsantrasyonlarında sürgün taslağının, organogenik potansiyele sahip olduğu gözlemlenmiĢtir. 2,4-D kombinasyonu sonucu elde edilen kalluslar ise sarımsı, sulu ve yumuĢak yapıda olup, organogenik özelliğe rastlanmamıĢtır. Benzer Ģekilde, Coker ve Camper (2000) tarafından E. purpurea‘da kallus oluĢumunun araĢtırıldığı çalıĢmada, NAA içeren ortamlarda çoğunlukla direkt sürgün ve kök uyarımı gerçekleĢirken, 2,4-D içeren ortamlarda ise çoğunlukla kallus uyarımı sağlanmıĢtır. Koroch ve ark. (2003) tarafından farklı konsantrasyonlarda BAP ve NAA içeren MS besin ortamlarında E.
pallida‘nın yaprak eksplantlarından adventif sürgün uyarımı araĢtırılan çalıĢmada,
düĢük NAA konsantrasyonlarında kallus oluĢumunun yanı sıra sürgün uyarımı meydana gelirken, yüksek NAA konsantrasyonlarında kallus uyarımı artmıĢ, sürgün rejenerasyonu uyarımı olmamıĢtır.
Kallus taze ağırlığına ait veriler varyans analizine tabi tutulmuĢ ve ortalama değerler Çizelge 4.10‘da verilmiĢtir. Varyans analiz sonuçlarına göre (EK-3.14), oksin uygulamaları, sitokinin uygulamaları ve oksin x sitokinin uygulamaları interaksiyonunun kallus ağırlığı üzerine etkisi istatistiki olarak %1 düzeyinde önemli
bulunmuĢtur. Oksin uygulamaları ortalamalarına baktığımızda en yüksek kallus taze ağırlığı değeri (417 mg) 1.0 mg/l NAA uygulamasında, en düĢük kallus taze ağırlığı değeri (105 mg) 1.0 mg/l 2,4-D uygulamasında elde edilmiĢtir. Sitokinin uygulamalarının ortalamaları incelendiğinde, en yüksek kallus taze ağırlığı değerleri (344 ve 325 mg) sırasıyla 1.0 mg/l ve 2.0 mg/l TDZ uygulamalarında, en düĢük kallus taze ağırlığı değeri (136 mg) 0.5 mg/l KIN uygulamasında elde edilmiĢtir. Oksin x sitokinin uygulamaları interaksiyonu bakımından ise en yüksek kallus taze ağırlığı değerleri (889 mg) 0.2 mg/l NAA + 1.0 mg/l TDZ uygulamasında, en düĢük kallus taze ağırlığı değeri (0 mg) 2.0 mg/l 2,4-D + 1.0 mg/l TDZ ve 1.0 mg/l NAA + 0.2 mg/l KIN uygulamalarında elde edilmiĢtir.
Çizelge 4.10. E. pallida yaprak eksplantının farklı büyüme düzenleyicilerinde kallus ağırlıkları (mg)
mg/l NAA 2,4-D
0.2 0.5 1.0 2.0 4.0 0.2 0.5 1.0 2.0 4.0 Ort.
K 0 96wB 73yB 675ac 285ı^ 224lB 181oB 477jk 60[B 200nB 84xB 235ce
BAP
0.2 28AB 198nB 631bd 452jl 204mB 226lB 146qB 48]B 180oB 106wB 222ce
0.5 256jA 139rB 408dp 130sB 206lB 183oB 284ı_ 76yB 196oB 135sB 201cf
1.0 143qB 200nB 374fs 490jj 320hy 328gx 189oB 125uB 192oB 257jA 262bc
2.0 36_B 217lB 570jg 627be 183oB 0B 143rB 179oB 137rB 237kB 233ce
TDZ
0.2 153qB 293ı] 407dp 391dq 420do 308hz 289ı] 96wB 182oB 20AB 256bd
0.5 298h\ 407dp 372ft 104wB 227lB 364fu 178oB 73yB 326gx 75yB 242cd
1.0 899a 285ı^ 609bf 448jm 631bd 102wB 302h[ 114vB 0B 53\B 344a
2.0 383er 414dp 545jh 293ı] 854ab 89xB 244jB 256jA 83xB 88xB 325a
KIN
0.2 33‘B 33‘B 0B 359gv 310hz 122uB 280ı` 130sB 169pB 159qB 160ef
0.5 66zB 50]B 232kB 123uB 294ı] 84xB 190oB 92wB 132sB 94wB 136f
1.0 38^B 33‘B 338gw 512jı 219lB 234kB 126tB 10AB 132sB 189oB 183df
2.0 34‘B 52\B 254jA 249jA 203mB 444jn 182oB 108wB 317hy 137rB 198cf
Ort. 190cd 184cd 417a 343b 331b 205c 233c 105e 173ce 126de
LSD 0.05 (sitokinin):77.87 LSD 0.05 (oksin):68.28 LSD 0.05 (sitokininxoksin): 245.78 Farklı tip ve konsantrasyonlarda büyüme düzenleyicilerinin yaprak eksplantından oluĢan kalluslarda ağırlığa etkisi incelendiğinde, NAA ve TDZ‘in birlikte kullanıldığı ortamlarda maksimum kallus ağırlığına ulaĢılmıĢtır. E. pallida‘nın yaprak eksplantından elde edilen kalluslarda optimum ağırlık, E. purpurea ile aynı büyüme düzenleyicileri tiplerinde elde edilmiĢ, konsantrasyon bakımından farlılıklar olmuĢtur. Bu durum kallus uyarımında olduğu gibi kallus ağırlığında da genotipe bağlı olarak değiĢiklik olabildiğinin göstergesidir (Michel ve ark., 2008).
E. pallida türüne ait yaprak eksplantlarında kallus verimliliği değerleri
incelendiğinde; en iyi kallus geliĢimini sağlayan büyüme düzenleyicisi 0.2 mg/l NAA + 1.0 mg/l TDZ olarak tespit edilmiĢ, türün yaprak eksplantlarında bundan sonraki kallus kültürü çalıĢmaları bu büyüme düzenleyicisi kombinasyonu ile devam etmiĢtir (ġekil 4.10).
4.1.2.2. Yaprak sapı eksplantından kallus uyarımı
E. pallida türüne ait yaprak sapı eksplantları, kallus uyarımını gerçekleĢtirmek
için farklı tip ve konsantrasyonlarda oksin (NAA, 2,4-D) ve sitokinin (BAP, TDZ, KIN) kombinasyonlarını içeren besin ortamlarında kültüre alınmıĢtır. 4 haftalık kültür süresi sonunda E. pallida yaprak sapı eksplantına ait kallus oluĢum yüzdesi (%), kallus taze ağırlığı (mg) ve kallus verimliliği (mg/kallus) değerleri belirlenmiĢtir.
Kallus oluĢum yüzdelerine ait veriler arcsin transformasyonu ile dönüĢtürüldükten sonra varyans analizine tabi tutulmuĢ ve ortalama değerler Çizelge 4.11‘de verilmiĢtir. Varyans analiz sonuçlarına göre (EK-3.16), oksin uygulamaları, sitokinin uygulamaları ve oksin x sitokinin uygulamaları interaksiyonunun kallus oluĢturan eksplant yüzdesine etkileri istatistiki olarak %1 seviyesinde önemli bulunmuĢtur. Oksin uygulamaları ortalamalarına baktığımızda en yüksek kallus oluĢum yüzde değeri (%82) 0.2 mg/l 2,4-D uygulamasında, en düĢük kallus oluĢum yüzde değeri (%60) 1.0 mg/l NAA uygulamasında elde edilmiĢtir. Sitokinin uygulamalarının ortalamaları incelendiğinde, en yüksek kallus oluĢum yüzde değerleri (%84 ve %82) sırasıyla 0.2 mg/l TDZ ve 1.0 mg/l BAP uygulamalarında elde edilirken, en düĢük kallus oluĢum yüzde değeri (%56) 2.0 mg/l TDZ uygulamasında elde edilmiĢtir. Oksin x sitokinin uygulamaları interaksiyonu bakımından ise en yüksek kallus oluĢum yüzde değeri (%90) hem NAA hem de 2,4-D‘nin farklı konsantrasyonlarda BAP, TDZ ve KIN ile birlikte kullanıldığı uygulamalarda elde edilirken, en düĢük kallus oluĢum yüzde değeri (%0) 1.0 mg/l NAA + 0.2 mg/l KIN uygulamasında elde edilmiĢtir (ġekil 4.11).
Çizelge 4.11. E. pallida yaprak sapı eksplantının farklı büyüme düzenleyicilerinde kallus oluĢturma yüzdeleri (%)
mg/l NAA 2,4-D
0.2 0.5 1.0 2.0 4.0 0.2 0.5 1.0 2.0 4.0 Ort.
K 0 90a 79ad 90a 49bl 84ab 90a 90a 90a 54al 84ab 80ab
BAP
0.2 56al 90a 36gn 90a 90a 90a 78ae 75af 60ak 90a 76ad 0.5 26jn 77ae 81ac 75af 41em 84ab 60ak 81ac 78ae 45cm 65df 1.0 75af 90a 81ac 84ab 84ab 90a 73ag 90a 81ac 90a 84a 2.0 90a 60ak 60ak 58ak 62aj 90a 24kn 71ag 66ah 79ad 66cf TDZ
0.2 90a 81ac 90a 78ae 90a 90a 90a 64aı 56al 90a 82a
0.5 79ad 78ae 75af 79ad 90a 81ac 60ak 81ac 90a 60ak 77ac 1.0 25jn 77ae 84ab 30hn 75af 69ag 90a 60ak 60ak 75af 64ef 2.0 66ah 84ab 60ak 38fm 90a 19ln 43dm 57ak 60ak 43dm 56f KIN
0.2 84ab 71ag 0n 90a 90a 90a 38fm 75af 81ac 77ae 70be 0.5 90a 39fm 51bl 47bm 81ac 90a 90a 90a 90a 79ad 75ae 1.0 90a 79ad 43dm 30hn 75af 90a 90a 30hn 75af 90a 69be 2.0 84ab 58ak 28ın 71ag 78ae 90a 11mn 90a 67ah 58ak 64ef
Ort. 73ad 74ac 60e 63de 79ab 82a 64ce 73ac 71bd 74ac
LSD 0.05 (sitokinin): 11.68 LSD 0.05 (oksin):10.23 LSD 0.05 (sitokininxoksin): 36.94
E. pallida türüne ait yaprak sapı eksplantlarında, farklı tip ve konsantrasyonda
büyüme düzenleyicilerinin kallus uyarımına etkileri incelendiğinde, hem NAA hem de 2,4-D‘nin farklı konsantrasyonlarda BAP, TDZ ve KIN ile birlikte kullanıldığı ortamlarda maksimum kallus uyarımı elde edilmiĢtir. Elde edilen kallusların hiçbirinde organogenik etki görülmemiĢtir. E. pallida türünde yaprak sapı eksplantından kallus uyarımı ile ilgili mevcut bir çalıĢmaya rastlanmamıĢtır. Bizim sonuçlarımızla benzer Ģekilde, pek çok tıbbi bitkide, NAA veya 2,4-D‘nin BAP, TDZ ve KIN ile birlikte kullanılmasının yaprak sapı eksplantından kallus uyarımını teĢvik ettiği bildirilmiĢtir (Mederos-Molina, 2004; Akbudak ve Babaoglu, 2005; Jayapaul ve ark., 2005; Nurokhman ve ark., 2019)
Tıbbi bitkilerde kallus kültürlerinin uyarımı ve sürdürülmesi, farklılaĢmıĢ dokularda, genellikle hücre çoğalması ve farklılaĢmasına bağlı olarak sekonder metabolitlerin üretiminin artabileceği (George ve ark., 2008) ayrıca sekonder metabolitlerin kitlesel üretimine imkân veren hücre süspansiyonlarının baĢlangıç noktası olduğu için oldukça önemlidir. Sekonder metabolitlerin bitki bünyesindeki miktarları, bitki kısımlarına bağlı olarak değiĢiklik gösterdiğinden dolayı farklı eksplant tiplerinden kallus uyarımı rejenerasyon tepkisinin belirlenmesinin yanı sıra bitkinin belli kısımlarında bulunan metabolitlerin üretimi açısından da büyük önem arz etmektedir.
Kallus taze ağırlığına ait veriler varyans analizine tabi tutulmuĢ ve ortalama değerler Çizelge 4.12‘de verilmiĢtir. Varyans analiz sonuçlarına göre (EK-3.17), oksin uygulamaları, sitokinin uygulamaları ve oksin x sitokinin uygulamaları interaksiyonunun kallus ağırlığı üzerine etkisi istatistiki olarak %1 düzeyinde önemli bulunmuĢtur. Oksin uygulamaları ortalamalarına baktığımızda en yüksek kallus taze ağırlığı değeri (279 mg) 1.0 mg/l NAA uygulamasında, en düĢük kallus taze ağırlığı değeri (31 mg) 2.0 mg/l 2,4-D uygulamasında elde edilmiĢtir. Sitokinin uygulamalarının ortalamaları incelendiğinde, en yüksek kallus taze ağırlığı değerleri (218 ve 196 mg) sırasıyla 0.2 mg/l ve 0.5 mg/l TDZ uygulamalarında, en düĢük kallus taze ağırlığı değeri (94 mg) 0.2 mg/l KIN uygulamasında elde edilmiĢtir. Oksin x sitokinin uygulamaları interaksiyonu bakımından ise en yüksek kallus taze ağırlığı değerleri (513 mg) 4.0 mg/l NAA + 0.5 mg/l TDZ uygulamasında, en düĢük kallus taze ağırlığı değeri (0 mg) 1 mg/l NAA + 0.2 mg/l KIN uygulamasında elde edilmiĢtir.
Çizelge 4.12. E. pallida yaprak sapı eksplantının farklı büyüme düzenleyicilerinde kallus ağırlıkları (mg)
mg/l NAA 2,4-D
0.2 0.5 1.0 2.0 4.0 0.2 0.5 1.0 2.0 4.0 Ort.
K 0 45[‘ 156k‘ 274cs 125n‘ 156k‘ 43[‘ 235ez 90r‘ 55z‘ 100p‘ 128be BAP
0.2 86s‘ 197g- 480ab 261ct 68u‘ 358aı 84t‘ 38/‘ 28]‘ 108o‘ 171ac 0.5 140l‘ 281cq 225f/ 198g- 82t‘ 118n‘ 17^‘ 34]‘ 38/‘ 43[‗ 118be 1.0 167j‘ 324bm 303bn 394af 215f] 139m‘ 35]‘ 47z‘ 28]‘ 30]‘ 168ad 2.0 187h‘ 272cs 249cw 380ag 257ct 147k‘ 12-‘ 36]‘ 36]‘ 89r‘ 167ad TDZ
0.2 334ak 245dy 434ac 295bo 345aj 174ı‘ 78t‘ 156k‘ 65v‘ 52z‘ 218a 0.5 363ah 157j‘ 255cu 327al 513a 130n‘ 58y‘ 79t‘ 29]‘ 54z‘ 196a 1.0 370ah 189h- 420ae 110o‘ 333ak 125n‘ 89r‘ 59x‘ 19^‘ 40/‘ 175ab 2.0 431ad 123n‘ 370ah 251cv 166j‘ 30]‘ 115n‘ 110o‘ 18^‘ 58y‘ 167ad KIN
0.2 126n‘ 125n‘ 0‘ 135n‘ 193g- 150k‘ 18^‘ 112o‘ 28]‘ 56z‘ 94e 0.5 288cp 102p‘ 138m‘ 78t‘ 277cr 93r‘ 204g^ 90r‘ 30]‘ 45[‘ 135be 1.0 121n‘ 113o‘ 228f[ 210f] 102p‘ 112o‘ 130n‘ 32]‘ 13-‘ 75t‘ 114ce 2.0 123n‘ 96q‘ 246cx 89r‘ 131n‘ 187h‘ 44[‘ 96q‘ 16-‘ 62w‘ 109de
Ort. 214b 183bc 279a 219b 218b 139c 86d 75de 31e 62de
Farklı tip ve konsantrasyonlarda büyüme düzenleyicilerinin yaprak sapı eksplantından oluĢan kalluslarda ağırlığa etkisi incelendiğinde, NAA ve TDZ‘in birlikte kullanıldığı ortamlarda maksimum kallus ağırlığına ulaĢılmıĢtır. Büyüme düzenleyicilerinin biyokütle üretimi üzerindeki etkileri nitrat redüktaz gibi bazı enzimlerin aktivasyonunu uyarmasından kaynaklandığı belirlenmiĢtir (Sosnowski ve ark., 2017). Pek çok araĢtırmacı, sitokinin ve oksinlerin birlikte kullanılmasının kallus uyarımını ve biyokütleyi artırdığını tespit etmiĢtir (Kalidass ve ark., 2009).
E. pallida türünün yaprak sapı eksplantlarında kallus verimliliği değerleri
incelendiğinde; en iyi kallus geliĢimini sağlayan büyüme düzenleyicisi 4.0 mg/l NAA + 0.5 mg/l TDZ olarak tespit edilmiĢ, türün yaprak sapı eksplantlarında bundan sonraki kallus kültürü çalıĢmaları bu büyüme düzenleyicisi kombinasyonu ile devam etmiĢtir (ġekil 4.12).
ġekil 4.12. E. pallida yaprak sapı eksplantı kallus verimliliği (mg/kallus)
4.1.2.3. Kotiledon eksplantından kallus uyarımı
E. pallida türüne ait kotiledon eksplantları, kallus uyarımını gerçekleĢtirmek için
farklı tip ve konsantrasyonlarda oksin (NAA, 2,4-D) ve sitokinin (BAP, TDZ, KIN) kombinasyonlarını içeren besin ortamlarında kültüre alınmıĢtır. 4 haftalık kültür süresi sonunda E. pallida kotiledon eksplantına ait kallus oluĢum yüzdesi (%), kallus taze ağırlığı (mg) ve kallus verimliliği (mg/kallus) değerleri belirlenmiĢtir.
Kallus oluĢum yüzdelerine ait veriler arcsin transformasyonu ile dönüĢtürüldükten sonra varyans analizine tabi tutulmuĢ ve ortalama değerler Çizelge 4.13‘de verilmiĢtir. Varyans analiz sonuçlarına göre (EK-3.19), oksin uygulamaları, sitokinin uygulamaları ve oksin x sitokinin uygulamaları interaksiyonunun kallus oluĢturan eksplant yüzdesine etkileri istatistiki olarak %1 seviyesinde önemli bulunmuĢtur. Oksin uygulamaları ortalamalarına baktığımızda en yüksek kallus oluĢum yüzde değeri (%84) 4.0 mg/l NAA uygulamasında, en düĢük kallus oluĢum yüzde değeri (%52) 0.2 mg/l NAA uygulamasında elde edilmiĢtir. Sitokinin uygulamalarının ortalamaları incelendiğinde, en yüksek kallus oluĢum yüzde değeri (%82) 1.0 mg/l TDZ uygulamasında elde edilirken, en düĢük kallus oluĢum yüzde değeri (%50) 0.2 mg/l KIN uygulamasında elde edilmiĢtir. Oksin x sitokinin uygulamaları interaksiyonu bakımından ise en yüksek kallus oluĢum yüzde değeri (%90) hem NAA hem de 2,4- D‘nin farklı konsantrasyonlarda BAP, TDZ ve KIN ile birlikte kullanıldığı uygulamalarda elde edilirken, en düĢük kallus oluĢum yüzde değeri (%0) 0.2 mg/l NAA + 0.2 mg/l KIN, 0.2 mg/l NAA + 0.5 mg/l KIN ve 1.0 mg/l NAA + 0.2 mg/l KIN uygulamalarında elde edilmiĢtir (ġekil 4.13).
Çizelge 4.13. E. pallida kotiledon eksplantının farklı büyüme düzenleyicilerinde kallus oluĢturma yüzdeleri (%)
mg/l NAA 2,4-D
0.2 0.5 1.0 2.0 4.0 0.2 0.5 1.0 2.0 4.0 Ort.
K 0 51bı 69ae 90a 81ab 68ae 81ab 73ad 47bj 39dj 51bı 65cd
BAP
0.2 51bı 64af 31fk 90a 73ad 90a 69ae 69ae 90a 90a 72ad
0.5 13jk 73ad 77ac 90a 90a 81ab 81ab 69ae 64af 34ek 67bd
1.0 60ag 51bı 90a 60ag 90a 22hk 39dj 73ad 64af 64af 61d
2.0 90a 39dj 90a 90a 90a 60ag 90a 90a 60ag 43cj 74ac
TDZ
0.2 90a 51bı 90a 77ac 90a 81ab 90a 90a 38ej 68ae 77ab
0.5 90a 90a 90a 90a 81ab 13jk 64af 90a 81ab 47bj 74ac
1.0 90a 63af 90a 81ab 90a 90a 90a 90a 52bh 81ab 82a
2.0 17ık 90a 90a 69ae 77ac 60ag 64af 81ab 64af 90a 70bd
KIN
0.2 0k 77ac 0k 59ag 81ab 90a 64af 39dj 73ad 17ık 50e
0.5 0k 30fk 30fk 60ag 90a 26gk 77ac 39dj 64af 47bj 46e
1.0 81ab 64af 90a 68ae 90a 90a 90a 42cj 60ag 21hk 70bd
2.0 47bj 68ae 38ej 77ac 81ab 60ag 17ık 21hk 30fk 51bı 49e
Ort. 52f 64ce 69bd 76ab 84a 65cd 70bc 65cd 60df 54ef
LSD 0.05 (sitokinin): 10.91 LSD 0.05 (oksin):9.58 LSD 0.05 (sitokininxoksin): 34.57
*Çizelgedeki değerlere arcsin transformasyonu uygulanmıĢtır.
E. pallida türüne ait kotiledon eksplantlarında, farklı tip ve konsantrasyonda
büyüme düzenleyicilerinin kallus uyarımına etkileri incelendiğinde, hem NAA hem de 2,4-D‘nin farklı konsantrasyonlarda BAP, TDZ ve KIN ile birlikte kullanıldığı ortamlarda maksimum kallus uyarımı elde edilmiĢtir. Elde edilen kallusların hiçbirinde organogenik geliĢim görülmemiĢtir. E. pallida türünde kotiledon eksplantından kallus
uyarımı ile ilgili mevcut bir çalıĢmaya rastlanmamıĢtır. Bizim sonuçlarımızla benzer Ģekilde, pek çok tıbbi bitkide, NAA veya 2,4-D‘nin BAP, TDZ ve KIN ile birlikte kullanılmasının kotiledon eksplantından kallus uyarımını teĢvik ettiği bildirilmiĢtir (Hesami ve Daneshvar, 2016; Ozdemir ve Ortaeskinazi, 2016; Razavi ve ark., 2017).
ġekil 4.13. E. pallida kotiledon eksplantından elde edilen kallus dokuları
Kallus taze ağırlığına ait veriler varyans analizine tabi tutulmuĢ ve ortalama değerler Çizelge 4.14‘de verilmiĢtir. Varyans analiz sonuçlarına göre oksin uygulamaları (EK-3.20), sitokinin uygulamaları ve oksin x sitokinin uygulamaları interaksiyonunun kallus ağırlığı üzerine etkisi istatistiki olarak %1 düzeyinde önemli bulunmuĢtur. Oksin uygulamaları ortalamalarına baktığımızda en yüksek kallus taze ağırlığı değerleri (430 ve 422 mg) sırasıyla 1.0 mg/l NAA ve 0.5 mg/l NAA uygulamalarında, en düĢük kallus taze ağırlığı değeri (87 mg) 4.0 mg/l 2,4-D uygulamasında elde edilmiĢtir. Sitokinin uygulamalarının ortalamaları incelendiğinde, en yüksek kallus taze ağırlığı değeri (451 mg) 2.0 mg/l TDZ uygulamasında, en düĢük
kallus taze ağırlığı değeri (102 mg) 0.2 mg/l KIN uygulamasında elde edilmiĢtir. Oksin x sitokinin uygulamaları interaksiyonu bakımından ise en yüksek kallus taze ağırlığı değeri (1148 mg) 1.0 mg/l NAA + 0.2 mg/l BAP uygulamasında, en düĢük kallus taze ağırlığı değeri (0 mg) 0.2 mg/l NAA + 0.2 mg/l KIN, 0.2 mg/l NAA + 0.5 mg/l KIN ve 1.0 mg/l NAA + 0.2 mg/l KIN uygulamalarında elde edilmiĢtir.
Çizelge 4.14. E. pallida kotiledon eksplantının farklı büyüme düzenleyicilerinde kallus ağırlıkları (mg/eksplan) mg/l NAA 2,4-D 0.2 0.5 1.0 2.0 4.0 0.2 0.5 1.0 2.0 4.0 Ort. K 0 62y\ 325h\ 555dl 166n\ 233j\ 151o\ 298h\ 170n\ 172n\ 46z\ 218df BAP 0.2 170n\ 258ı\ 1148a 267ı\ 381g[ 283ı\ 145p\ 221k\ 185n\ 139p\ 320bd 0.5 78v\ 711bg 412fy 253ı\ 215k\ 346h\ 146p\ 121q\ 140p\ 49z\ 247cf 1.0 524dn 509do 271ı\ 560dk 519dn 373g[ 142p\ 211k\ 137p\ 98t\ 335bc 2.0 657ch 260ı\ 251j\ 483eq 425ew 119r\ 108s\ 134p\ 106t\ 123q\ 267ce TDZ
0.2 310h\ 1043ab 613dı 262ı\ 1063ab 301h\ 175n\ 135p\ 151o\ 122q\ 418ab 0.5 469es 435ev 589dj 765bf 259ı\ 190m\ 435ev 91u\ 261ı\ 83v\ 358ac 1.0 457et 484eo 547dm 472er 385g[ 206k\ 265ı\ 424ex 177n\ 101t\ 352ac 2.0 781be 981ac 399gz 867ad 380g[ 230j\ 445eu 146p\ 145p\ 132p\ 451a KIN
0.2 0\ 38[\ 0\ 228k\ 225k\ 191m\ 131p\ 71w\ 100t\ 33\ 102g 0.5 0\ 95u\ 143p\ 229j\ 303h\ 97t\ 278ı\ 112r\ 97t\ 83v\ 144fg 1.0 64x\ 153o\ 379g 216k\ 290ı\ 193m\ 275ı\ 44z\ 109s\ 39z\ 176eg 2.0 190m\ 196l\ 280ı\ 200k\ 240j\ 131p\ 34\ 25[\ 70w\ 78v\ 144fg Ort. 289bc 422a 430a 382ab 378ab 216cd 221cd 147de 142de 87e
LSD 0.05 (sitokinin): 113.60 LSD 0.05 (oksin):99.62 LSD 0.05 (sitokininxoksin):359.25
Farklı tip ve konsantrasyonlarda büyüme düzenleyicilerinin kotiledon eksplantından oluĢan kalluslarda ağırlığa etkisi incelendiğinde, NAA ve BAP‘in birlikte kullanıldığı ortamlarda maksimum kallus ağırlığına ulaĢılmıĢtır. Eksplant tipleri arasında kallus ağırlığı bakımından en yüksek değere kotiledon eksplantından türetilen kallus dokularında ulaĢılmıĢtır. Benzer Ģekilde, Grąbkowska ve ark. (2016) tarafından kotiledon eksplantlarından kallus uyarımının ve biyokütlenin araĢtırıldığı tıbbı bitkide, BAP ve NAA içeren ortamlarda en yüksek kallus ağırlığına ulaĢılmıĢtır.
E. pallida türünün kotiledon eksplantlarında kallus verimliliği değerleri
incelendiğinde; en iyi kallus geliĢimini sağlayan büyüme düzenleyicisi 4.0 mg/l NAA + 0.2 mg/l TDZ olarak tespit edilmiĢ, türün kotiledon eksplantlarında bundan sonraki kallus kültürü çalıĢmaları bu büyüme düzenleyicisi kombinasyonu ile devam etmiĢtir (ġekil 4.14)
ġekil 4.14. E. pallida kotiledon eksplantı kallus verimliliği (mg/kallus)
4.1.2.4. Kök eksplantından kallus uyarımı
E. pallida türüne ait kök eksplantları, kallus uyarımını gerçekleĢtirmek için
farklı tip ve konsantrasyonlarda oksin (NAA, 2,4-D) ve sitokinin (BAP, TDZ, KIN) kombinasyonlarını içeren besin ortamlarında kültüre alınmıĢtır. 4 haftalık kültür süresi sonunda E. pallida kök eksplantına ait kallus oluĢum yüzdesi (%), kallus taze ağırlığı (mg) ve kallus verimliliği (mg/kallus) değerleri belirlenmiĢtir.
Kallus oluĢum yüzdelerine ait veriler arcsin transformasyonu ile dönüĢtürüldükten sonra varyans analizine tabi tutulmuĢ ve ortalama değerler Çizelge 4.13‘de verilmiĢtir. Varyans analiz sonuçlarına göre (EK-3.22), oksin uygulamaları, sitokinin uygulamaları ve oksin x sitokinin uygulamaları interaksiyonunun kallus oluĢturan eksplant yüzdesine etkileri istatistiki olarak %1 seviyesinde önemli bulunmuĢtur. Oksin uygulamaları ortalamalarına baktığımızda en yüksek kallus oluĢum yüzde değerleri (%74, %73, %70, %65, %64, %63) 2.0 ve 4.0 mg/l 2,4-D dıĢındaki tüm oksin uygulamalarında, en düĢük kallus oluĢum yüzde değeri (%45) 4.0 mg/l 2,4-D uygulamasında elde edilmiĢtir. Sitokinin uygulamalarının ortalamaları incelendiğinde, en yüksek kallus oluĢum yüzde değeri (%77) sitokinin içermeyen uygulamada elde edilirken, en düĢük kallus oluĢum yüzde değeri (%48) 1.0 mg/l BAP ve 2.0 mg/l KIN uygulamalarında elde edilmiĢtir. Oksin x sitokinin uygulamaları interaksiyonu bakımından ise en yüksek kallus oluĢum yüzde değeri (%90) hem NAA hem de 2,4- D‘nin farklı konsantrasyonlarda BAP, TDZ ve KIN ile birlikte kullanıldığı uygulamalarda elde edilirken, en düĢük kallus oluĢum yüzde değeri (%0) 0.2 mg/l NAA + 2.0 mg/l TDZ, 0.5 mg/l NAA + 2.0 mg/l BAP, 1.0 mg/l NAA + 0.2 ve 2.0 mg/l KIN,
0.2 mg/l 2,4-D + 1.0 mg/l TDZ, 0.5 mg/l 2,4-D +1.0 mg/l BAP, 2.0 mg/l KIN, 1.0 mg/l 2,4-D +0.2 mg/l TDZ, 4.0 mg/l 2,4-D + 2.0 mg/l TDZ uygulamalarında elde edilmiĢtir (ġekil 4.15).
Çizelge 4.15. E. pallida kök ekplantının farklı büyüme düzenleyicilerinde kallus oluĢturma yüzdeleri (%)
mg/l NAA 2,4-D
0.2 0.5 1.0 2.0 4.0 0.2 0.5 1.0 2.0 4.0 Ort.
K 0 84ab 90a 41cl 84ab 47bk 90a 90a 90a 90a 62ah 77a
BAP
0.2 90a 77ad 30gm 75ae 90a 90a 90a 90a 58aı 15jm 71ab 0.5 90a 69ag 13km 60aı 36em 84ab 90a 6lm 43cl 55aj 55cf 1.0 78ad 84ab 22hm 58aı 53ak 71af 0m 35em 34fm 45bl 48f 2.0 81ac 0m 53ak 43cl 50ak 84ab 45bl 81ac 49bk 36em 52df TDZ
0.2 90a 47bk 84ab 81ac 90a 60aı 78ad 0m 30gm 45bl 61be 0.5 51ak 90a 66ag 90a 84ab 0m 56aı 90a 60aı 73af 66ac 1.0 36em 90a 36em 58aı 66ag 90a 78ad 90a 39dm 6lm 59bf
2.0 0m 90a 78ad 90a 90a 90a 90a 73af 60aı 0m 66ac
KIN
0.2 60aı 90a 0m 84ab 62ah 90a 41cl 84ab 51ak 69ag 63bd 0.5 71af 42cl 30gm 78ad 78ad 66ag 90a 41cl 75ae 90a 66ac 1.0 90a 30gm 30gm 81ac 45bl 47bk 84ab 77ad 45bl 62ah 59bf
2.0 90a 49bk 0m 78ad 30gm 90a 0m 90a 21ım 29gm 48f
Ort. 70a 65a 37c 74a 63a 73a 64a 65a 50b 45bc
LSD 0.05 (sitokinin): 12.70 LSD 0.05 (oksin):11.15 LSD 0.05 (sitokininxoksin): 40.21
*Çizelgedeki değerlere Arcsin transformasyonu uygulanmıĢtır.
E. pallida türüne ait kök eksplantlarında, farklı tip ve konsantrasyonda büyüme
düzenleyicilerinin kallus uyarımına etkileri incelendiğinde, hem NAA hem de 2,4-D‘nin farklı konsantrasyonlarda BAP, TDZ ve KIN ile birlikte kullanıldığı ortamlarda