4. ARAġTIRMA SONUÇLARI VE TARTIġMA
4.3. Sürgünlerin Köklendirilmesi ve DıĢ Ortama Aktarma
4.3.1. Echinecea purpurea L. türünde köklendirme çalıĢmaları
E. purpurea L. türünde direkt sürgün uyarımı ile elde edilen sürgünler, kök
geliĢimini teĢvik etmek ve rejenerasyon sürecini tamamlamak amacıyla farklı konsantrasyonlarda (0.5, 1.0 veya 1.5 mg/l) ve tiplerde oksin (NAA, IBA, IAA) içeren ve içermeyen besin ortamlarında kültüre alınmıĢtır. 4 haftalık kültür süresinin sonunda, kök oluĢturan sürgün yüzdesi (%), sürgün baĢına kök sayısı (adet) ve sürgün baĢına kök uzunluğu (cm) değerleri gözlemlenmiĢtir.
Kök oluĢturan sürgün yüzdesi, sürgün baĢına kök sayısı ve kök uzunluğu verileri ayrı ayrı varyans analizine tabi tutulmuĢ ve ortalama değerler Çizelge 4.21‘de verilmiĢtir. Varyans analiz sonuçlarına göre (EK-3.29), farklı tip ve konsantrasyonlarda oksinlerin, kök oluĢturan sürgün yüzdesi (%) ve sürgün baĢına kök sayısı (adet) üzerine etkileri istatistiki olarak %1 seviyesinde önemli bulunurken, kök uzunluğu (cm) üzerine etkileri istatistiki olarak önemsiz bulunmuĢtur.
Çizelge 4.21. E. purpurea L. türünde farklı oksin tip ve konsantrasyonlarının köklenmeye etkileri Büyüme Düzenleyicileri (mg/l) Sürgün Yüzdesi Kök OluĢturan
(%)* Sürgün BaĢına Kök Sayısı (adet)* Kök Uzunluğu (cm)* K 29a 5.00b 3.85a IBA 0.5 6cd 1.67bc 0.06c
1.0 21ab 12.00a 3.89a
1.5 21ab 2.33bc 1.13bc NAA 0.5 0c 0.00c 0.00c 1.0 12bc 2.67bc 1.62b 1.5 0c 0.00c 0.00c IAA 0.5 0c 0.00c 0.00c 1.0 0c 0.00c 0.00c 1.5 6cd 1.67bc 0.23c
*Aynı sütunda farklı harflerle ifade edilen ortalamalar arasında Duncan çoklu karĢılaĢtırma testine göre %5 düzeyinde farklılık vardır.
*Çizelgedeki yüzde değerlere arcsin transformasyonu uygulanmıĢtır.
Çizelge 4.21 incelendiğinde, en yüksek kök oluĢturan sürgün yüzde değeri %29 ile büyüme düzenleyicisi içermeyen MS besin ortamında elde edilmiĢtir. Oksin tipleri arasında Echinacea purpurea‘da IBA, NAA ve IAA‘e göre daha etkili bulunmuĢtur. IBA‘nın tüm konsantrasyonlarında (sırasıyla %6, %21, %21) köklenme meydana gelirken, NAA‘in sadece 1.0 mg/l konsantrasyonunda %12, IAA‘in ise sadece 1.5 mg/l konsantrasyonunda %6 oranında köklenme tespit edilmiĢtir. En fazla kök sayısına (12 adet) 1.0 mg/l IBA ve en yüksek kök uzunluğuna ise (3.89 ve 3.85 cm) sırasıyla 1.0
mg/l IBA ve büyüme düzenleyici içermeyen MS besin ortamında ulaĢılmıĢtır. Benzer Ģekilde, Koroch ve ark. (2002), Echinacea purpurea‘da farklı konsantrasyonlarda IBA içeren ve hiçbir büyüme düzenleyicisi içermeyen MS besin ortamında kök uyarımını araĢtırdıkları çalıĢmada, maksimum köklenme oranını büyüme düzenleyicisi içermeyen ortamda, en yüksek kök sayısına ise 4.90 ve 2.46 µM IBA içeren ortamda ve en yüksek kök uzunluğuna ise büyüme düzenleyicisi içermeyen ve 0.49 µM IBA içeren ortamda elde etmiĢlerdir. Lakshmanan ve ark. (2002) tarafından Echinacea purpurea sürgünleri IBA içeren ve içermeyen MS besin ortamında köklenmeye alınmıĢ, her iki ortamda da köklenme meydana gelmiĢ, ancak IBA içermeyen ortamda daha yüksek oranda köklenme tespit edilmiĢtir.
IBA dıĢındaki diğer oksin tiplerinde kök uyarımının yanı sıra kallus geliĢimi de gözlemlenmiĢtir. Chen ve ark. (2016), Echinacea purpurea‘nın haploid, diploid ve tetraploid genotiplerini çok düĢük konsantrasyonlarda (0.05, 0.15 mg/l) NAA içeren ve hiçbir büyüme düzenleyicisi içermeyen MS besin ortamında köklendirmiĢlerdir. Bizim kullandığımız NAA ve IBA konsantrasyonları Echinacea purpurea‘da köklenme uyarımı için yüksek bulunmuĢ ve kallus uyarımını teĢvik etmiĢtir.Benzer Ģekilde, Choffe ve ark. (2000a), yüksek oksin konsantrasyonlarının bitkilerde köklenme yerine kallus uyarımını artırabileceğini bildirmiĢtir.
Mechanda ve ark. (2003), in vitro koĢullarda elde edilen Echinacea purpurea sürgünlerinin, farklı konsantrasyonlarda IBA içeren ve içermeyen WPM ortamında köklenme uyarımını araĢtırdıkları çalıĢmada, 1.5 mg/l IBA içeren ortamda maksimum köklenmeye (%100) ulaĢmıĢlardır. Lucchesini ve ark. (2019) tarafından yapılan baĢka bir çalıĢmada ise, Echinacea angustifolia sürgünlerinin köklenme oranını, sakkaroz içermeyen, 1.0 mg/l IBA içeren sıvı MS besin ortamında %65‘e çıkarmıĢlardır. Bu çalıĢmalar Echinacea türlerinde köklenme uyarımlarında büyüme düzenleyicisi tipi ve konsantrasyonu kadar besin ortamının içeriğinin oldukça etkili olduğunu göstermiĢtir.
E. purpurea L. türünde köklenmiĢ fideler, fidenin kök sisteminin geliĢmesi ve
dıĢ koĢullara alıĢması için, 1:1 oranında steril torf ve perlit içeren küçük bardaklara aktarılarak, birkaç gün yüksek nemde tutulmuĢ, sonrasında nem kademeli olarak düĢürülmüĢ ve 4 hafta sonrasında normal düzeye getirilmiĢtir. (ġekil 4.21). Genel anlamda köklenme oranının düĢük olması ve aklimatizasyonda yeterli baĢarının sağlanamamasından dolayı çok az sayıda fide sağlıklı geliĢimlerini devam ettirmiĢtir.
ġekil 4.21. E. purpurea L. türünde aklimatizasyon a) dıĢ ortama yeni aktarılmıĢ fideler b) dıĢ ortama aktarılmıĢ 4 haftalık fide
ġekil 4.22. E. purpurea L. türünde farklı KIN ve/veya NAA kombinasyonlarında en yüksek köklenmelere oranlarına ait görüntüler a) 0.25 mg/l KIN b) 0.50 mg/l KIN c) 1.0 mg/l KIN d) 2.0 mg/l KIN e) 0.5 mg/l
KIN + 0.1 mg/l NAA f) 1.0 mg/l KIN + 0.1 mg/l NAA g) 2.0 mg/l KIN + 0.1 mg/l NAA h) 4.0 mg/l KIN + 0.1 mg/l NAA
E. purpurea L. türü nodal segmentlerinden çoklu sürgün uyarımında, farklı
konsantrasyonlarda (0.25, 0.50, 1.0, 2.0, 4.0 mg/l) KIN ve (0.1, 0.5 mg/l) NAA içeren besin ortamlarında, 4 haftalık kültür süresi sonunda çoklu sürgün uyarımının yanı sıra sürgünlerde köklenme oluĢtuğu gözlemlenmiĢtir (ġekil 4.22).
Kök oluĢturan sürgün yüzdesi, sürgün baĢına kök sayısı ve kök uzunluğu verileri ayrı ayrı varyans analizine tabi tutulmuĢ ve ortalama değerler Çizelge 4.22‘de verilmiĢtir. Varyans analiz sonuçlarına göre (EK-3.31) , farklı tip ve konsantrasyonlarda büyüme düzenleyicilerinin kök oluĢturan sürgün yüzdesi (%) üzerine etkileri istatistiki olarak %1 seviyesinde önemli bulunurken, sürgün baĢına kök sayısı (adet) ve kök uzunluğu (cm) üzerine etkileri istatistiki olarak önemsiz bulunmuĢtur.
Çizelge 4.22. E. purpurea L. türünde farklı KIN ve NAA kombinasyonlarında elde edilen sürgünlerde köklenme oranları
Büyüme düzenleyicileri (mg/l) 1Kök oluĢturan sürgün yüzdesi (%) 2Sürgün baĢına kök sayısı (adet) 3Kök uzunluğu (cm) KIN NAA 0.25 - 90a 4.60 1.82 0.50 - 78ab 3.33 3.35 1.00 - 90a 3.82 3.17 2.00 - 78ab 4.19 2.02 4.00 - 51c 2.63 1.71 0.25 0.1 45cd 3.47 2.54 0.50 0.1 69b 4.30 3.62 1.00 0.1 84a 4.13 3.80 2.00 0.1 90a 4.75 5.04 4.00 0.1 84a 4.50 4.17 0.25 0.5 12e 2.83 3.05 0.50 0.5 48c 3.23 2.33 1.00 0.5 33d 4.80 3.70 2.00 0.5 41cd 8.19 2.01 4.00 0.5 33d 5.00 2.31 1
Aynı sütunda farklı harflerle ifade edilen ortalamalar arasında Duncan çoklu karĢılaĢtırma testine göre %5 düzeyinde farklılık vardır.
2, 3 Ġstatistiki olarak önemli bulunmamıĢtır.
*Çizelgedeki yüzde değerlere arcsin transformasyonu uygulanmıĢtır.
0.25 mg/l KIN, 0.50 mg/l KIN ve 2.00 mg/l KIN + 0.1 mg/l NAA konsantrasyonlarında en yüksek köklenme oranı tespit edilmiĢtir. Echinacea türlerinde KIN ve KIN‘in NAA ile kombinasyonlarının köklenmeyi uyardığına dair herhangi bir çalıĢmaya rastlanmamıĢtır. Ancak baĢka bitki türlerinde yapılan çalıĢmalarda, KIN‘in köklenmeyi uyarıcı etkisi olduğu bildirilmiĢtir (Mantell ve Hugo, 1989; Siddique ve ark., 2006; Fattorini ve ark., 2017). Sürgün baĢına kök sayısı ve uzunluğu değerleri arasındaki farklılık istatistiki anlamda önemli bulunmamıĢtır. Ayrıca, elde edilen köklerde sekonder metabolit miktarları analiz edilmiĢ, sonuçlar 4.4.1‘deki baĢlık altında değerlendirilmiĢtir.
4.3.2. Echinecea pallida türünde köklendirme çalıĢmaları
E. pallida türünde indirekt ve direkt sürgün uyarımı ile elde edilen sürgünler,
kök geliĢimini teĢvik etmek ve rejenerasyon sürecini tamamlamak amacıyla farklı konsantrasyonlarda (0.5, 1.0 veya 1.5 mg/l) ve tiplerde oksin (NAA, IBA, IAA) içeren ve içermeyen besin ortamlarında kültüre alınmıĢtır. 4 haftalık kültür süresinin sonunda, kök oluĢturan sürgün yüzdesi (%), sürgün baĢına kök sayısı (adet) ve sürgün baĢına kök uzunluğu (cm) değerleri gözlemlenmiĢtir.
Çizelge 4.23 E. pallida türünde farklı oksin tip ve konsantrasyonlarının köklenmeye etkileri Büyüme Düzenleyicileri (mg/l) Sürgün Yüzdesi Kök OluĢturan
(%)* Sürgün BaĢına Kök Sayısı (adet)* Kök Uzunluğu (cm)* K 6 0.67 0.03 IBA 0.5 6 1.00 1.29 1.0 0 0.00 0.00 1.5 0 0.00 0.00 NAA 0.5 0 0.00 0.00 1.0 0 0.00 0.00 1.5 0 0.00 0.00 IAA 0.5 0 0.00 0.00 1.0 0 0.00 0.00 1.5 0 0.00 0.00
* Ġstatistiki olarak önemli bulunmamıĢtır.
Kök oluĢturan sürgün yüzdesi, sürgün baĢına kök sayısı ve kök uzunluğu verileri ayrı ayrı varyans analizine tabi tutulmuĢ ve ortalama değerler Çizelge 4.23‘de verilmiĢtir. Varyans analiz sonuçlarına göre (EK-3.30), farklı tip ve konsantrasyonlarda oksinlerin, kök oluĢturan sürgün yüzdesi (%), sürgün baĢına kök sayısı (adet) ve kök uzunluğu (cm) üzerine etkileri istatistiki olarak önemsiz bulunmuĢtur.
E. pallida türünde aralarında istatistiki önemde iliĢki bulunamayan köklenme
yüzdesine ait değerler, rakamsal büyüklüklerine göre incelendiğinde en yüksek köklenme oranı (%6) büyüme düzenleyicisi içermeyen ve 0.5 mg/l IBA içeren besin ortamında elde edilmiĢtir. Diğer oksin tipleri ve konsantrasyonlarında köklenme tespit edilmemiĢtir. Genel anlamda değerlendirildiğinde E. pallida türünde in vitro koĢullarda köklenme oldukça düĢük oranlarda meydana gelmektedir. Harbage (2001) üç farklı ekinezya türünde IBA içeren ortamda köklenme uyarımını araĢtırdıkları çalıĢmada, en düĢük oranı (%3) E. pallida türünde elde etmiĢlerdir. Benzer Ģekilde, Koroch ve ark. (2003) köklenmeyi araĢtırdıkları çalıĢmada, farklı konsantrasyonlarda IBA içeren ve içermeyen ortamlarda köklenme oranı bakımından istatistiki anlamda bir fark elde edememiĢler ve çok düĢük oranlarda köklenmeyi sağlamıĢlardır. Buna karĢın,
Lakshmanan ve ark. (2002) IBA içeren ve içermeyen MS besin ortamında köklenmeye aldıkları Echinacea pallida sürgünlerinde, her iki ortamda da (sırasıyla %29, %50) yüksek oranda köklenme elde etmiĢlerdir. Bu sonucun, tür içinde genetik varyasyonlara bağlı olarak ortaya çıkmıĢ olabileceği düĢünülmektedir.
E. pallida türünde köklenmiĢ fide oranı çok düĢük olduğundan aklimatizasyon
iĢlemi sağlıklı bir Ģekilde gerçekleĢtirelememiĢtir.