Kallus kültürlerinde sekonder metabolit üretimini artırmaya yönelik uygulamalar

Kallus kültürlerinde sekonder metabolit üretimini artırmaya yönelik uygulamalar, en yüksek kaftarik asit, klorojenik asit, kafeik asit ve kikorik asit miktarlarının elde edildiği E. purpurea L. türünün kök ve yaprak sapı eksplant tiplerinde ve 10 haftalık kültür süresi boyunca boyunca devam etmiĢtir. Besin ortamında yer alan beslenme faktörlerinin (azot miktarı, karbon kaynağı ve miktarı) değiĢiminin ve besin ortamında oluĢturulan abiyotik elisitörin (kuraklık) kafeik asit türevlerinin miktarlarına etkisi belirlenmiĢtir.

4.5.1. Farklı azot miktarlarının etkisi

Azot miktarındaki değiĢimin kafeik asit türevlerinin miktarlarına etkisini belirlemek için, E. purpurea L. türünün kök ve yaprak sapı eksplantları, önceki uygulamalarda belirlenen, en iyi kallus oluĢumunun sağlandığı büyüme düzenleyicisini içeren azot içeriği bakımından modifiye edilmiĢ MS besin ortamlarında (0:35, 5:25, 15:15, 35:0 mM amonyum/nitrat oranı) kültüre alınmıĢtır. Her iki eksplant tipinde de 35:0 mM amonyum/nitrat oranı içeren besin ortamında kallus uyarımı meydana gelmezken, diğer uygulamalarda sağlıklı kalluslar elde edilmiĢtir. 10 haftalık kültür süresi sonunda elde edilen kallus dokularında kafeik asit türevlerinin miktarları analiz edilmiĢtir (Çizelge 4.29).

Çizelge 4.29. E. purpurea L. türünde farklı konsantrasyonlarda azot içeren besin ortamlarında kök ve yaprak sapı eksplantlarından elde edilen kalluslarda kafeik asit türevlerinin miktarları (mg/g)

Eksplant tipi

Amonyum/ Nitrat oranı

(mM)

Kaftarik asit Klorojenik asit Kafeik asit Kikorik asit

Kök 00:35 9.38±0.10 0.71±0.04 0.29±0.30 34.77±0.09 15:15 0.09±0.01 0.09±0.09 0.08±0.25 0.22±0.01 05:25 1.04±0.02 - 0.08±0.12 1.61±0.03 Yaprak Sapı 00.35 4.51±0.05 0.67±0.01 0.25±0.04 7.93±0.78 15:15 - 0.08±0.08 - - 05:25 3.37±0.09 0.39±0.09 0.07±0.15 6.78±0.05

Çizelge 4.29 incelendiğinde, en yüksek kaftarik, klorojenik, kafeik ve kikorik asit miktarları, 0.5 mg/l NAA + 0.5 mg/l BAP ve 0:35 mM amonyum/nitrat oranı içeren MS besin ortamında 10 haftalık kültür süresi sonunda kök eksplantından elde edilen kallus dokularında tespit edilmiĢtir.

In vitro koĢullarda sekonder metabolitlerin sentezlenmesinde, besin ortamında

nitrojen kaynakları oldukça önemlidir. Özellikle besin ortamındaki NH4+ ila NO3- oranı,

sadece bitki hücre kültürlerinin büyümesini değil (Veliky ve Rose, 1973), aynı zamanda sekonder metabolitlerin üretimini de etkilemektedir (Smetanska, 2008). ÇalıĢmamızda

E. purpurea‘nın iki farklı eksplant tipinde, en iyi kallus geliĢimlerinin sağlandığı

büyüme düzenleyicisi kombinasyonlarında ve 0:35 mM amonyum/nitrat oranında en yüksek kafeik asit türevlerinin miktarları elde edilmiĢtir. Wu ve ark. (2006), E.

angustifolia‘nın adventif kök kültüründe, farklı oksin tipleri ve konsantrasyonları ile

amonyum/nitrat içeriği (0:40, 0:35, 0:30, 5:25, 10:20, 15:15, 20:10, 25:5, 30:0) ve besin ortamı gücünün toplam fenol ve flavonoidlerin birikimi üzerine etkilerini araĢtırdıkları çalıĢmada, en fazla toplam fenol ve flavonoid içeriğini, 5:25 mM amonyum/nitrat, 2.0 mg/l IBA içeren ½ MS besin ortamında elde etmiĢlerdir. Benzer amaçla, Lee ve ark. (2011), farklı amonyum/nitrat oranları içeren MS besin ortamında, dut kallus kültürlerinde sekonder metabolit miktarlarını inceledikleri çalıĢmada, 34/66 amonyum/nitrat oranı ve 5.0 mg/l IAA içeren besin ortamında en yüksek rutin miktarını tespit etmiĢlerdir. Cui ve ark. (2010), kantaron adventif kök kütürlerinde en yüksek hipersin içeriğine 0:30 mM amonyum/nitrat, toplam fenol ve flavonoid içeriğine ise 10:20 mM amonyum/nitrat içeren ½ MS besin ortamında elde etmiĢlerdir.

Elde edilen bulgular in vitro koĢullarda sekonder metabolit üretiminde besin ortamı optimizasyonunun oldukça önemli olduğunu ve her genotipe özgü optimizasyon koĢullarının belirlenmesi gerektiğini ortaya çıkarmıĢtır.

4.5.2. Farklı karbon kaynaklarının ve konsantrasyonlarının etkisi

Karbon kaynağı tipi ve miktarındaki değiĢimin kafeik asit türevlerinin miktarlarına etkisini belirlemek için, E. purpurea L. türünün kök ve yaprak sapı eksplantları, önceki uygulamalarda belirlenen, en iyi kallus veriminin sağlandığı büyüme düzenleyicisini ve iki farklı karbon kaynağını (sakkaroz ve maltoz) dört farklı konsantrasyonda (15, 30 (kontrol), 45 ve 60 g/l) içeren MS besin ortamlarında kültüre alınmıĢtır. Her iki eksplant tipinde 10 haftalık kültür süresi sonunda elde edilen kallus dokularında kafeik asit türevlerinin miktarları analiz edilmiĢtir (Çizelge 4.30, 4.31).

Çizelge 4.30. E. purpurea L. türünde farklı konsantrasyonlarda azot içeren besin ortamlarında kök eksplantından elde edilen kalluslarda kafeik asit türevlerinin miktarları (mg/g)

Karbon

Kaynağı Konsantrasyon(g/l) Kaftarik asit

Klorojenik

asit Kafeik asit Kikorik asit

Sakkaroz 15 0.83±0.02 0.16±0.05 - 2.57±0.24 30 2.91±0.01 8.83±0.07 - 30.82±1.14 45 0.14±0.03 - - 0.40±0.01 60 - - - - Maltoz 15 1.24±0.01 0.37±0.25 0.11±0.08 2.69±0.05 30 1.28±0.05 0.20±0.08 0.10±0.10 3.76±0.02 45 0.30±0.07 0.06±0.01 0.06±0.14 0.33±0.03 60 0.30±0.01 - - 0.33±0.04

Çizelge 4.30 incelendiğinde, en yüksek kaftarik, klorojenik, kafeik ve kikorik asit miktarları, 0.5 mg/l NAA + 0.5 mg/l BAP ve 30 g/l sakkaroz içeren MS besin ortamında 10 haftalık kültür süresi sonunda elde edilen kallus dokularında tespit edilmiĢtir.

Çizelge 4.31. E. purpurea L. türünde farklı konsantrasyonlarda azot içeren besin ortamlarında yaprak sapı eksplantından elde edilen kalluslarda kafeik asit türevlerinin miktarları (mg/g)

Karbon

Kaynağı Konsantrasyon(g/l) Kaftarik asit

Klorojenik

asit Kafeik asit Kikorik asit

Sakkaroz 15 0.54±0.02 0.21±0.01 - 1.27±0.04 30 4.11±0.00 4.17±0.02 - 57.89±0.03 45 - - - - 60 - - - 0.09 Maltoz 15 0.96±0.05 0.59±0.20 0.12±0.01 3.75±0.05 30 0.57±0.08 0.18±0.01 0.06±0.01 1.16±0.04 45 0.85±0.09 0.15±0.08 0.06±0.02 2.30±0.10 60 0.90±0.10 0.55±0.06 0.09±0.03 1.73±0.05

Çizelge 4.31 incelendiğinde, en yüksek kaftarik, klorojenik, kafeik ve kikorik asit miktarları, 1.0 mg/l NAA + 0.5 mg/l TDZ ve 30 g/l sakkaroz içeren MS besin ortamında 10 haftalık kültür süresi sonunda elde edilen kallus dokularında tespit edilmiĢtir.

Sakkaroz, maltoz, fruktoz ve glukoz gibi farklı karbon kaynakları ayrı ayrı yada kombinasyon halinde hücre ve doku kültürlerinin büyümesini desteklemek için kullanılmaktadır (Kretzschmar ve ark., 2007). Karbon kaynakları, büyüme üzerindeki etkilerinin yanı sıra, önemli sayıda gen ekspresyonunu düzenleyerek birçok bileĢiğin biyosentetik yollarında etkin bir rol oynamaktadırlar (Ali ve ark., 2016). Ayrıca, in vitro kültürlerde, karbon kaynakları yaygın olarak osmotik stres faktörü oluĢturmak için de kullanılmakta olup, bu nedenle, karbon kaynaklarının osmotik stres etkisini ve besinsel rolünü ayırmak çok zor olmaktadır (Liu ve Cheng, 2008). Farklı karbon kaynakları tarafından uygulanan ozmotik stresin, bitki türlerine ve kültür sistemine bağlı olarak

değiĢkenlik göstermekle birlikte, biyokütle ve sekonder metabolitlerin üretilmesine yol açabileceği çeĢitli çalıĢmalarda bildirilmiĢtir (Suan See ve ark., 2011).

ÇalıĢmamız da besin ortamı içerisindeki yüksek konsantrasyonda sakkaroz ve maltoz uygulamalarının kafeik asit türevlerinin miktarlarında her iki eksplant tipinde de olumlu etkide bulunmadığı tespit edilmiĢtir. Karbon kaynakları arasında 30 g/l sakkaroz içeren ortamlarda her iki eksplant tipinde de en yüksek kaftarik, klorojenik, kafeik ve kikorik asit miktarları elde edilmiĢtir. Bizim sonuçlarımıza benzer olarak, Liu ve ark. (2006) tarafından, E. purpurea L.‘nın saçak kök kültürlerinde kafeik asit türevlerini üretme kapasitelerinin araĢtırıldığı çalıĢmada, en yüksek biyokütle ve kikorik asit (19.21 mg/g), kaftarik asit (3.56 mg/g) ve klorojenik asit (0.93 mg/g) miktarları 30 g/l sakkaroz içeren MS besin ortamında elde edilmiĢtir. Romero ve ark. (2009), üç farklı ekinezya türünün in vitro kültürlerinden alkamit üretiminin araĢtırdıkları çalıĢmada, %3 (30 g/l) sakkaroz içeren ½ B5 ortamının, test edilen diğer sakkaroz konsantrasyonlarına (%1, %2, %4, %5) oranla iki kat daha fazla etkili olduğunu tespit etmiĢlerdir. Besin ortamındaki karbon kaynağı tipi ve konsantrasyonunun etkinliği, bitki türüne bağlı olarak değiĢkenlik göstermekle birlikte, aynı zamanda besin ortamının diğer kimyasal bileĢiklerinden de etkilenmektedir. Wu ve ark. (2006), E. angustifolia‘nın adventif kök kültüründe, farklı oksin tipleri (IAA, IBA, NAA) ve konsantrasyonları (1.0, 2.0, 4.0, 6.0 mg/l) ile farklı sakkaroz (%1, %3, %5, %7, %9), amonyum/nitrat içeriği (0:40, 0:35, 0:30, 5:25, 10:20, 15:15, 20:10, 25:5, 30:0), besin ortamı gücü (1/4, 1/2, 3/4, 1/1, 3/2, 2/2) ve pH (4, 5, 6, 7, 8, 9) seviyelerinin, biyokütle artıĢı ve toplam fenol ve flavonoidlerin birikimi üzerine etkilerini araĢtırdıkları çalıĢmada, en fazla biyokütle artıĢı ile toplam fenol ve flavonoid içeriğini, %5 sakkaroz, 5:25 (mM) amonyum/nitrat, 2 mg/l IBA içeren, pH:6.0 olan 1/2 MS besin ortamında elde etmiĢlerdir. Cui ve ark. (2013) tarafından, E. angustifolia’nın adventif kök kültürlerinde, farklı sakkaroz konsantrasyonlarının (%0, %1, %3, %5, %7, %9) biyokütle artıĢı ve kafeik asit türevlerinin birikimi üzerindeki etkilerinin araĢtırıldığı benzer bir çalıĢmada ise, en yüksek biyokütle ile klorojenik asit (2.26 mg/g), ekinakosit (4.66 mg/g), sinarin (1.57 mg/g) ve kikorik asit (1.57 mg/g) miktarları, %5 sakkaroz içeren ¼ MS besin ortamında tespit edilmiĢtir. Bu bulgular, in vitro koĢullarda sekonder metabolit üretiminin elde edilmesi ve artıralabilmesi için, besin ortamının kimyasal bileĢimi, kullanılan büyüme düzenleyicisi tipi ve konsantrasyonları, kültür tipi, bitki türü ve eksplant tipi gibi birçok faktörün birlikte değerlendirilmesi gerektiğini ortaya

çıkarmaktadır. Bu nedenle, in vitro kültür koĢullarının optimizasyonu oldukça önemlidir.

Ayrıca, benzer amaçla yürütülen farklı tıbbi bitki türlerindeki çalıĢmalarda da bizim bulgularımızı destekler niteliktedir. Khan ve ark. (2018) tarafından, farklı tip (sakkaroz, maltoz, glikoz ve fruktoz) ve konsantrasyonda (%1, %3 ve %5) karbon kaynaklarının, Fagonia indica callus kültürlerinde biyokütle ve sekonder metabolit üretimi üzerindeki etkilerinin araĢtırıldığı çalıĢmada, en yüksek biyokütle artıĢı ile toplam fenol ve flavonoid içeriği sırasıyla %3 sakkaroz ve %3 maltoz içeren besin ortamlarından elde edilen kalluslarda tespit edilmiĢtir.

4.5.3. Farklı polietilen glikol (PEG) konsantrasyonlarının etkisi

Kuraklık stresinin kafeik asit türevlerinin miktarlarına etkisini belirlemek için, E.

purpurea L. türünün kök ve yaprak sapı eksplantları, önceki uygulamalarda belirlenen,

en iyi kallus oluĢumunun sağlandığı büyüme düzenleyicisini ve farklı polietilen glikol (PEG) konsantrasyonları (5, 10, 15 g/l) içeren MS besin ortamlarında kültüre alınmıĢtır. Her iki eksplant tipinde 10 haftalık kültür süresi sonunda elde edilen kallus dokularında kafeik asit türevlerinin miktarları analiz edilmiĢtir (Çizelge 4.32). Yaprak sapı eksplantından elde edilen kallus dokularında kafeik asit türevlerinden hiç biri tespit edilememiĢtir.

Çizelge 4.32. E. purpurea L. türünde farklı konsantrasyonlarda azot içeren besin ortamlarında kök eksplantından elde edilen kalluslarda kafeik asit türevlerinin miktarları (mg/g)

PEG (g/l) Kaftarik asit Klorojenik asit Kafeik asit Kikorik asit

5 0.34±0.01 0.05±0.01 - 0.60±0.17

10 1.88±0.12 0.58±0.05 0.07±0.01 6.07±0.08

15 0.10±0.01 - - 0.13±0.05

Çizelge 4.32 incelendiğinde, en yüksek kaftarik, klorojenik, kafeik ve kikorik asit miktarları, 0.5 mg/l NAA + 0.5 mg/l BAP ve 10 g/l PEG içeren MS besin ortamında kök eksplantından 10 haftalık kültür süresi sonunda elde edilen kallus dokularında tespit edilmiĢtir.

Su stresi, bitkilerin büyüme ve geliĢimini düzenleyebilen, bitki üretimini sınırlayabilen, bitkilerin fizyolojik ve biyokimyasal özelliklerini değiĢtirebilen en önemli çevresel streslerden biridir. Su stresinin bitkilerde abiyotik elisitör olarak sekonder metabolit üretimini arttırdığı bilinmektedir (Zobayed ve ark., 2007). PEG birçok bitkide su stresini uyarmak için kullanılan ve bitki tarafından alınamayan bir osmotik ajandır (Lemcoff ve ark., 2006). Pavlik ve ark. (2007), H. perforatum in vitro

kültürlerinde sakkaroz (10, 20, 30 g/l) içeren ortamlara PEG (1.25, 2.5, 5, 10, 15 g/l) ilave etmiĢler ve çoğunlukla düĢük konsantrasyonlarda PEG‘in (1.25 ve 5 g/l) hiperisin ve hiperforin üretimini artırdığını tespit etmiĢlerdir. Bizim çalıĢmamızda bundan farklı olarak 10 g/l PEG uygulaması daha etkili olmuĢtur. Benzer Ģekilde, Yamaner ve Erdag (2013), farklı kültür süreleri boyunca farklı konsantrasyonlarda PEG (2.5, 10, 15 g/l) içeren modifiye MS besin ortamında elde ettiği H. adenotrichum in vitro sürgün kültürlerinde, 10 g/l PEG uygulamasında 15 günlük kültür süresi sonunda hiperisin (2.1 kat) ve pseudohiperisin (2.3 kat) miktarlarının arttığını bildirmiĢlerdir. PEG uygulamasının neden olduğu osmotik stres birçok bitkide sekonder metabolit üretimini arttırmıĢtır; Ör. Scrophularia ningpoensis‘in köklerinde iridoid glikozitler (catalpol, harpagoside, aucubin ve harpagide) Wang ve ark. (2010), Taxus chinensis hücre süspansiyonlarında paclitaxel üretimi Kim ve ark. (2001) ve Cistanche deserticola hücre kültürlerinde phenylethanoid glikoztiler Liu ve Cheng (2008) PEG uygulaması ile artmıĢtır. Ancak, in vitro koĢullarda PEG uygulamasıyla sekonder metabolit üretimini artırabilmek için, her bitki türü ve eksplant tipi için optimum PEG konsantrasyonun belirlenmesi gerekmektedir.

4.6. Eksplant kaynağı olarak kullanılan fidelerin (E. pallida ve E. purpurea L.)