Echinecea pallida kallus ve sürgün kültürlerinde sekonder metabolitlerin

4.4.2.1. Kallus kültürü

Kallus kültürleri sonucunda, dört farklı eksplant tipinde (yaprak, yaprak sapı, kotiledon, kök) kallus geliĢimine en iyi yanıt veren büyüme düzenleyici tipi ve konsantrasyonu belirlendikten sonra, bu büyüme düzenleyicilerinde bitkinin farklı eksplantlarından elde edilen kallus dokularında, farklı kültür süreleri sonunda kaftarik asit, klorojenik asit, kafeik asit ve kikorik asit miktarları tespit edilmiĢtir.

Çizelge 4.27. E. pallida türünde farklı eksplant tiplerinden farklı kültür sürelerinde elde edilen kalluslarda kafeik asit türevlerinin miktarları (mg/g)

Kültür Süresi

(Hafta) Eksplant Tipi Kaftarik asit

Klorojenik

asit Kafeik asit Kikorik asit

4 Kök - 0.26±0.01 - - Yaprak sapı - 0.10±0.00 - 0.03±0.04 Yaprak - 0.09±0.00 - 0.06±0.00 Kotiledon - 0.06±0.01 - - 6 Kök - - - - Yaprak sapı - - - - Yaprak 0.40±0.00 3.73±0.16 - 1.65±0.00 Kotiledon - 0.06±0.01 - - 8 Kök - 0.07±0.00 - - Yaprak sapı - 0.03±0.04 - - Yaprak - 0.46±0.00 - 0.17±0.00 Kotiledon - 0.21±0.01 - - 10 Kök - 0.18±0.00 - - Yaprak sapı - 0.62±0.00 - 0.17±0.01 Yaprak 0.37±0.00 1.56±0.01 - 1.98±0.01 Kotiledon - 1.34±0.00 - 0.19±0.01

Çizelge 4.27 incelendiğinde, en yüksek klorojenik asit (3.73 mg/g) ve kikorik asit (1.98 mg/g) miktarları, yaprak eksplantından sırasıyla 6 hafta ve 10 hafta kültür süresi sonundan elde edilen kalluslarda belirlenmiĢtir (ġekil 4.31). Elde edilen kallus dokularının hiçbirinde kafeik asite rastlanmamıĢtır. Kaftarik asit ise sadece 6 ve 10 haftalık kültür süreleri sonunda yaprak kaynaklı kalluslarda tespit edilmiĢtir. Genel olarak değerlendirildiğinde, kültür süresindeki değiĢiklik E. pallida türünün kallus dokularında kafeik asit türevlerinin miktarlarında ciddi bir değiĢikliğe neden olmamıĢtır.

ġekil 4.31. E. pallida yaprak eksplantından a) 6 haftalık kültür süresi b) 10 haftalık kültür süresi sonunda elde edilen kallus dokularına ait HPLC kromatogramı

Taha ve ark. (2009), E. pallida yaprak, yaprak sapı ve kök eksplantlarından farklı konsantrasyonlarda 2,4-D ve BAP kombinasyonlarını içeren MS ortamlarında 4 haftalık kültür süresi sonunda elde edilen kalluslarda kafeik asit türevlerinin miktarlarını tespit etmiĢler ve en yüksek kaftarik (1.12 mg/g), klorojenik (2.24 mg/g) ve kikorik asit (6.87 mg/g) miktarlarına kök eksplantından 3.0 mg/l 2,4-D+1.0 mg/l BAP içeren ortamda elde edilen kalluslarda ulaĢmıĢlardır. Kaftarik ve kikorik asit miktarlarının bizim bulgularımızdan daha yüksek olması sebebinin, kullanılan büyüme düzenleyicisi tipi ve konsantrasyonuna bağlı olduğu düĢünülmektedir.

Kafeik asit türevleri arasında, E. pallida'nın karakretistik bileĢiği ekinakosit olup, çoğunlukla köklerinde bulunmaktadır. Kikorik ve kaftarik asit ise,E. purpurea‘nın

temel bileĢikleri olup, E. pallida‘da az miktarda ve çoğunlukla yapraklarda bulunur (Kabganian ve ark., 2003). Bizim çalıĢmamızda da en yüksek kaftarik, klorojenik ve kikorik asit miktarlarına yaprak eksplantından elde edilen kallus dokularında ulaĢılmıĢtır.

E. pallida türünde farklı eksplant tiplerinde, kallus verimliliği bakımından en iyi

sonucu veren büyüme düzenleyicilerini içeren ortamlarda sağlıklı kallus dokuları elde edilmiĢ olmasına rağmen, bu kalluslarda farklı kültür sürelerinde kafeik asit türevlerinin miktarlarında ciddi bir artıĢ tespit edilmemiĢtir. Bu nedenle çalıĢmamızın bir sonraki aĢaması olan kallus kültürlerinde sekonder metabolit üretimini artırmaya yönelik uygulamalar, en yüksek kaftarik asit, klorojenik asit ve kikorik asit miktarlarının elde edildiği E. purpurea L. türünün kök ve yaprak sapı eksplant tiplerinde ve 10 haftalık kültür süresi boyunca devam etmiĢtir.

4.4.2.2. Sürgün kültürü

AraĢtırmanın in vitro kısmında mikroçoğaltım amacıyla çoklu sürgün uyarımı sağlanmıĢ, elde edilen sürgünlerde farklı tip ve konsantrasyonlardaki büyüme düzenleyicilerinin kaftarik asit, klorojenik asit, kafeik asit ve kikorik asit miktarlarına etkileri tespit edilmiĢtir. Böylece çoklu sürgün uyarımını teĢvik eden büyüme düzenleyicisinin belirlenmesinin yanı sıra, en yüksek kaftarik asit, klorojenik asit, kafeik asit ve kikorik asit miktarlarının elde edildiği büyüme düzenleyicisi tipi ve konsantrasyonu da belirlenmiĢtir.

Çizelge 4.28 incelendiğinde, en yüksek kaftarik asit miktarı (6.43 mg/g) 4.0 mg/l BAP + 0.1 mg/l NAA, en yüksek klorojenik asit miktarı (3.47 mg/g) 0.50 mg/l BAP + 0.1 mg/l NAA, en yüksek kikorik asit miktarı ise (21.92 mg/g) 1.0 mg/l BAP + 0.1 mg/l NAA içeren ortamlarda elde edilen sürgünlerde tespit edilmiĢtir. Kafeik asit miktarları genelde tüm büyüme düzenleyicilerinde düĢük ve birbirine yakın miktarlarda elde edilmiĢ olup, en yüksek değer (0.24 mg/g) 4.0 mg/l BAP + 0.1 mg/l NAA içeren ortamdan elde edilen sürgünlerde belirlenmiĢtir (ġekil 4.32).

Genel olarak değerlendirildiğinde, E. pallida sürgün kültürlerinde kafeik asit türevlerinin miktarları bakımından sitokinin kaynakları arasında BAP, KIN ve TDZ‘ye göre daha etkili bulunmuĢtur (ġekil 4.33, 4.34, 4.35).

ġekil 4.32. E. pallida türünde a) 4.0 mg/l BAP + 0.1 mg/l NAA b) 0.50 mg/l BAP + 0.1mg/l NAA c) 1.0 mg/l BAP içeren ortamlardan elde edilen sürgünlere ait HPLC kromatogramı

Bitki büyüme düzenleyicilerinin bitkilerde temel büyüme ve geliĢme süreçlerini kontrol etmenin yanı sıra, bitki doku kültüründe sekonder metabolitlerinin üretimini düzenlediği de bilinmektedir (Dörnenburg ve Knorr, 1995). BAP, KIN, TDZ ve 2iP gibi sitokininlerin tek baĢına veya NAA, 2,4-D ve IAA gibi oksinlerle kombinasyon halinde kullanılmasının in vitro sekonder metabolit üretimi üzerine etkileri birçok çalıĢma tarafından bildirilmiĢtir (Meyer ve Van Staden, 1995).

Taha ve ark. (2009), E. pallida türünde kallustan indirekt uyarımla elde edilen sürgünlerde kafeik asit türevlerini tespit ettikleri çalıĢmada, en yüksek kaftarik asit, klorojenik asit ve kikorik asit miktarlarını (sırasıyla 3.55, 3.56, 19.35 mg/g) 1.0 mg/l IAA + 3.0 mg/l BAP içeren MS ortamından elde edilen sürgünlerde belirlemiĢlerdir. Besin ortamındaki BAP‘ın bir oksinle birlikte kullanılması ve BAP konsantrasyonun fazla olması kafeik asit türevlerinin miktarlarında artıĢa sebep olmuĢtur. Bu anlamda bizim bulgularımızı doğrular niteliktedir. In vitro koĢullarda oksin ve sitokininlerin eĢ zamanlı olarak kullanımının çoğunlukla sekonder metabolitlerin üretimini uyardığı pekçok çalıĢmada bildirilmiĢtir (Goyal ve Ramawat, 2008). Oksinler, sitokinin glikosilasyonunu teĢvik ederek sitokininlerin etkinliğini artırmaktadır (Coenen ve Lomax, 1997; Nordström ve ark., 2004). Benzer amaçla farklı tıbbi bitkilerde yürütülen

çalıĢmalarda, sitokininlerin düĢük konsantrasyonda oksinlerle kombinasyonlarını içeren ortamlardan elde edilen rejenerant sürgünlerde sekonder metabolit içeriğinde artıĢ olduğu gözlemlenmiĢtir (Amoo ve Van Staden, 2013).

Çizelge 4.28. E. pallida türünde farklı tip ve konsantrasyonlardaki büyüme düzenleyicilerinde elde edilen sürgünlerde kafeik asit türevlerinin miktarları (mg/g)

Büyüme Düzenleyicileri (mg/l)

Kaftarik asit Klorojenik

asit Kafeik asit Kikorik asit

BAP TDZ KIN NAA

0.25 - - - 3.20±0.02 1.24±0.00 0.18±0.03 18.86±0.03 0.50 - - - 3.36±0.03 2.20±0.01 0.19±0.02 20.05±0.12 1.00 - - - 5.96±0.05 2.02±0.05 0.15±0.05 24.83±0.05 2.00 - - - 1.88±0.08 0.89±0.08 0.07±0.00 18.76±0.14 4.00 - - - 1.98±0.06 0.90±0.04 - 12.20±0.19 0.25 - - 0.1 2.52±0.07 0.32±0.00 0.09±0.04 11.99±0.06 0.50 - - 0.1 1.61±0.08 3.47±0.03 0.07±0.06 13.83±0.05 1.00 - - 0.1 4.47±0.05 1.66±0.08 0.10±0.02 21.92±0.08 2.00 - - 0.1 5.01±0.04 1.12±0.00 0.13±0.03 17.64±0.06 4.00 - - 0.1 6.43±0.06 0.10±0.00 0.24±0.04 14.97±0.12 0.25 - - 0.5 3.95±0.00 0.70±0.01 0.16±0.00 21.65±0.14 0.50 - - 0.5 - - - 20.95±0.15 1.00 - - 0.5 4.78±0.08 0.82±0.09 0.10±0.01 18.69±0.01 2.00 - - 0.5 - - - 21.84±0.08 4.00 - - 0.5 5.90±0.09 0.51±0.05 0.16±0.02 19.08±0.09 0.25 - - 2.86±0.01 2.56±0.02 0.10±0.01 13.62±0.10 - 0.50 - - 2.60±0.05 0.79±0.05 0.07±0.00 9.35±0.20 - 1.00 - - 1.54±0.06 1.89±0.06 0.08±0.00 6.18±0.01 - 2.00 - - 0.08±0.08 0.08±0.05 - 0.11±0.00 - 4.00 - - 0.84±0.09 1.18±0.08 0.06±0.01 4.73±0.04 - 0.25 - 0.1 2.85±0.10 1.05±0.06 0.08±0.00 16.61±0.02 - 0.50 - 0.1 2.55±0.22 0.74±0.08 0.08±0.00 13.75±0.05 - 1.00 - 0.1 3.15±0.03 0.58±0.00 0.11±0.02 15.12±0.12 - 2.00 - 0.1 3.12±0.02 0.61±0.00 0.09±0.01 13.56±0.28 - 4.00 - 0.1 2.66±0.05 0.35±0.00 0.07±0.00 12.50±0.13 - 0.25 - 0.5 1.38±0.01 0.43±0.00 - 7.53±0.17 - 0.50 - 0.5 0.53±0.00 0.41±0.00 - 2.24±1.20 - 1.00 - 0.5 0.40±0.00 0.31±0.01 - 1.97±0.25 - 2.00 - 0.5 1.29±0.02 1.21±0.05 0.06±0.01 5.84±0.48 - 4.00 - 0.5 0.18±0.06 0.20±0.00 - 0.50±0.05 - - 0.25 - 1.84±0.05 0.43±0.05 0.06±0.01 6.17±1.23 - - 0.50 - 1.59±0.05 0.19±0.01 0.06±0.00 6.16±1.25 - - 1.00 - 1.87±0.07 1.11±0.01 0.06±0.00 6.02±0.29 - - 2.00 - 2.08±0.09 0.21±0.00 0.06±0.01 7.41±0.78 - - 4.00 - 2.29±0.10 0.26±0.00 - 9.83±0.25 - - 0.25 0.1 1.62±0.05 0.46±0.00 0.06±0.00 9.26±0.14 - - 0.50 0.1 1.78±0.08 0.59±0.00 0.09±0.00 7.10±0.16 - - 1.00 0.1 2.28±0.09 0.37±0.00 0.06±0.00 6.42±0.14 - - 2.00 0.1 1.00±0.03 1.37±0.08 - 5.58±1.15 - - 4.00 0.1 1.21±0.08 0.71±0.05 - 3.41±1.18 - - 0.25 0.5 0.96±0.00 1.10±0.08 0.11±0.02 4.08±1.01 - - 0.50 0.5 1.06±0.01 1.63±0.06 - 4.36±0.16 - - 1.00 0.5 1.39±0.01 0.89±0.05 0.06±0.01 4.68±0.15 - - 2.00 0.5 1.81±0.02 1.19±0.08 0.08±0.02 5.90±0.17 - - 4.00 0.5 0.90±0.00 0.74±0.08 0.06±0.00 2.10±0.16

ġekil 4.33. E. pallida türünde BAP ve NAA kombinasyonlarında elde edilen sürgünlerdeki kafeik asit türevlerinin miktarları (mg/g)

ġekil 4.34. E. pallida türünde TDZ ve NAA kombinasyonlarında elde edilen sürgünlerdeki kafeik asit türevlerinin miktarları (mg/g)

ġekil 4.35. E. pallida türünde KIN ve NAA kombinasyonlarında elde edilen sürgünlerdeki kafeik asit türevlerinin miktarları (mg/g)

4.5. Kallus kültürlerinde sekonder metabolit üretimini artırmaya yönelik