REKOMBİNANT VEKTÖR AŞILAR

Rekombinant vektör aşılar; canlı aşılar ve altbirim aşı-ların sahip olduğu avantajları yapısında birleştiren aşılar-dır. Bu aşılar, patojene ait antijenik genleri taşıyan ancak kendisi patojenik olmayan enfeksiyöz virüslerinden oluşur.

Retrovirüs, herpes simplex virüs, adenovirüs veya poxvi-rüslerinden türevlendirilen viral vektörler sıklıkla 25 enfek-siyon hastalıklarına karşı aşı geliştirilmesi amacıyla klinik ve klinik öncesi aşamalarda değerlendirilmektedir. Ancak bu tür aşıların kullanımını kısıtlayan temel faktör hastada daha önceden bu virüslere karşı olan nötralizan antikorla-rın varlığıdır (Düzenli, 2021).

mRNA AŞILARI

DNA’daki (deoksiribonükleik asit) bilginin proteine dö-nüşme sürecinde (santral dogma) haberci (messenger) ri-bonükleik asit (mRNA) molekülleri DNA’dan ribozomlara bilgi taşıyan aracılardır. mRNA molekülünü ile protein sen-tezi için gerekli bilgi ribozomlara hücre çekirdeğindeki DNA üzerinden iletilmek yerine; viral enfeksiyonlarda olduğu gibi hücre dışından gönderilebilir hale gelmiştir. Bu sayede hücreler belirli bir süre için istenilen proteinleri üretmeye yönlendirilebilmekte ve çeşitli enfeksiyon hastalıkları için immün yanıt üretilmesinde birer fabrika gibi kullanılmakta-dır (Şahiner & Aygar, 2020).

mRNA aşıları, COVID-19 pandemisi ile birlikte biyotek-noloji ve ilaç endüstrisinin merkezine çekildi. mRNA aşı de-nemelerinden ikisi, bir spike protein immünojeni kodlayan ve bir lipid nanoparçacık içinde verilen 2 doz 30 µg veya 100 µg mRNA sekansından sonra SARS-CoV-2 enfeksiyonunda

%94'ten fazla azalma sağlayan bir etkinlik bildiren ara faz 3 deneme sonuçlarını duyurdu. Aşı geliştirme hızı da beklen-tileri aştı ve bu sonuçlar SARS-CoV-2 dizisinin kamuya

açıklanmasından sadece 10 ay sonra gerçekleşti. Bu başarı, yalnızca biyoteknoloji ve ilaç endüstrisinin acil ve karşılan-mamış bir küresel ihtiyaca yanıt verme yeteneğinin değil, aynı zamanda bir farmasötik model olarak mRNA'nın, pro-filaktik bir aşı olarak doğasında bulunan yeteneklerinin de bir kanıtıdır (Buschmann et al., 2021).

Büyük boyut ve negatif mRNA yükü, sitozole verimli bir şekilde ulaşmasının önündeki engellerdir. Çıplak mRNA, farklı hücre tipleri tarafından kendiliğinden alınabilir, an-cak bu genellikle asidik endolizozomal kompartmanlarda bozulma ile sonuçlanır. Lipid nanoparçacıkları (LNP'ler), mRNA'yı her yerde bulunan RNA'lardan korumanın, onu ba-ğışıklık hücrelerinden korumanın ve endozomdan kaçışı sağlarken hücrelere iletmenin etkili bir yolu olarak tanım-lanmıştır. LNP'ler genellikle dört ana bileşenden oluşur:

iyonlaşabilir, sterol, fosfolipid ve lipid bağlantılı polietilen glikol (PEG). Fosfolipid ve sterol, LNP'yi stabilize etmek için birlikte çalışır. Lipid bağlantılı PEG, flakon ve depolama sta-bilitesi sağlar. İyonize olabilen lipid, hücresel alım ve endo-zomal kaçış için kritiktir, mRNA'nın sitozole salınmasına izin verir. Lipid bileşenlerinin oranı ve kimlikleri değiştiri-lerek, formülasyonun etkinliği ve tolere edilebilirliği değiş-tirilebilir (Deal et al., 2021).

Şekil 2. mRNA Lipid nanopartikül yapısı (Buschmann et al., 2021)

mRNA terapötikleri, küçük moleküller, DNA, oligonük-leotitler, viral sistemler ve antikorlar dahil proteinler olmak üzere diğer farmasötik modalitelere kıyasla birçok avantaja ve çeşitli zorluklara sahiptir. DNA ile karşılaştırıldığında, mRNA'nın çekirdek yerine yalnızca sitoplazmik ribozomal translasyon mekanizmasına erişmesi gerekir ve genomik entegrasyon riski taşımaz. Hem proteinler hem de viral sis-temlerle karşılaştırıldığında, mRNA üretimi hücresizdir, daha hızlıdır ve protein ürünü doğal glikosilasyon ve kon-formasyonel özellikler taşır. Bir lipit nanoparçacık (LNP) dağıtım sistemi ile birleştirildiğinde, viral sistemlere ve do-laşımdaki şilomikronlara büyüklükleri, lipit zarfları ve (vi-ral sistemler için) iç yapısı bakımından benzerlik gösterir.

mRNA platformuna özgü zorluklar, içsel immünojenisitesi, enzimatik bozulmaya duyarlılığı ve çıplak mRNA'nın hücre alımının neredeyse ihmal edilebilir seviyeleridir. mRNA'nın doğuştan gelen immünojenisitesi; tek ve çift sarmallı RNA'nın toll-like reseptörleri (TLR'ler), helikaz

reseptörleri, retinoik asit ile indüklenebilir gen I (RIG-I) benzeri reseptörler (RLR'ler) tarafından hücresel olarak saptanmasından kaynaklanır (Buschmann et al., 2021).

Tablo 3. DNA ve RNA aşılarının birbirlerine göre avan-taj ve dezavanavan-tajları (Kılıç & Dolapçı, 2021)

Özellik DNA aşıları RNA aşıları

Düşük maliyet, kolay ve hızlı

üretim + +

Hücresel ve humoral immünite

oluşumu + +

Enfeksiyon oluşturma riski - -

Molekül kararlılığı, in vivo

ve-rim + ±

Genetik kod kapasitesi +++ +

İmmünojenik protein

üretimi-nin süresi ve seviyesi +++ +

Aşı platformu çeşitliliği + +

Hücre dışı ortama dayanıklılık Güçlü değil, kolay

bo-zulur Dayanıklı

Aşının hücre içine ulaşan

mik-tarı Düşük Yeterli

Etki için çekirdeğe girme

zo-runluluğu Çekirdek içine

ulaş-malı Hücreye girmesi

yeterli DNA: Deoksiribonükleik asir, RNA: Ribonükleik asit

Enfeksiyöz patojenler için iki tipte RNA aşısı kullanıl-mıştır; replike olabilen (amplifiye olabilen, self amplifying mRNA, SAM) RNA ve replike olmayan RNA. Replike olmayan RNA aşılarının üretimi basit ve ucuzdur ancak ekspresyon süresi ve seviyesi kısıtlıdır. Replike olabilen RNA aşıları ise enfeksiyöz virüs üreitmi riski olmadan replikasyon döngü-süne ulaşma prensibi ile üretilir böylece az miktarda aşı dozu ile antijeni kodlayan RNA’nın amplifikasyonuna bağlı olarak çok miktarda antijen üretilir (Kılıç & Dolapçı, 2021).

Şekil 3. Replike olamayan(NRM) RNA ve replike olabi-len (SAM) RNA (Jackson, Kester, Casimiro, Gurunathan, & DeRosa, 2020)

Hem replike olamayan hem de replike olabilen (saRNA) mRNA'lar, bir başlık, 5' UTR, 3' UTR ve değişken uzunlukta poli(A) kuyruk dahil olmak üzere temel öğeleri paylaşır.

Kendi kendini çoğaltan RNA (saRNA) ayrıca dört yapısal ol-mayan proteini (nsP1–4) ve alfavirüsün genomundan türe-tilen bir subgenomik promotörü kodlar. nsP1-4, replike ol-mayan mRNA'dan daha düşük dozları mümkün kılan saR-NA'nın amplifikasyonundan sorumlu bir replikazı kodlar (Blakney et al., 2021).

Şekil 4. mRNA vektörlerinin karşılaştırılması (Blakney et al., 2021)

Günümüzde kullanılan SAM aşılarının çoğu RNA repli-kasyon mekanizmasını kodlayan viral genleri içeren ancak virüsün yapısal proteinlerini kodlayan genlerin üretilmek istenilen ilgili aşı antijeni ile değiştirildiği bir alfavirus ge-nomu (rekombinan Semliki Forest virus, rSFV) üzerinde ta-sarlanmaktadır (Savaşçı & Gül, 2021). Tarihsel olarak, alfa-virüsler, flavivirüsler ve pikornavirüsler gibi pozitif an-lamda tek sarmallı RNA virüsleri replikonlar için kullanıl-mıştır. En iyi çalışılan kendi kendini çoğaltan mRNA mole-külleri Sindbis virüsü gibi alfavirüs genomlarından türetilir (Blakney et al., 2021). İlgili aşı antijenine ait ORF bölgesi ile beraber viral replikazı kodlayan ikinci bir ORF(open rea-ding frame) bölgesi ve bir promotor gen bölgesi içerirler. Bu ikinci ORF bölgesi mRNA’nın hücre içi replikasyonunu yön-lendirir ve böylece tasarlanan aşı sisteminin antijen eksp-resyon kapasitesi önemli ölçüde artırılmış olur. (Şahiner &

Aygar, 2020) SAM platformunda, antijen kodlayan mRNA'nın hücre içi replikasyonu nedeniyle çok küçük bir aşı dozundan (0.1- 10 μg) büyük miktarda antijen üretimini mümkündür (Savaşçı & Gül, 2021). Bu özelliğinden dolayı replike olmayan mRNA'ya (25-250 μg) kıyasla potansiyel olarak önemli maliyet faydaları ve daha yüksek verimlilik sunarlar (Tanoğlu, 2021).

Şekil 5. SAM aşının yapısı (Şahiner & Aygar, 2020)

Yeni bir patojenin sebep olduğu bir salgın ortaya çıktı-ğında virüsün tanımlanması ve genomik dizisinin belirlen-mesi ile beraber aşı üretimi için uygun olan antijenik yapı-ları tanımlanır ve mRNA sisteminin tasarımına geçilir. RNA aşısı içeriğinin üretimi bir platform teknolojisidir, yani he-men her RNA sekansı; mRNA sentezi, saflaştırması ve for-mülasyonu aynı işlemler ile üretilebilir. Yeni bir aşının üre-timine geçerken bu süreçte değiştirilmesi gereken tek bile-şen, RNA'nın T7 RNA polimeraz enzimi kullanılarak sentez-lendiği DNA şablonudur (Tanoğlu, 2021).

Genetik temelli bir mRNA aşısı olan Pfizer/Biontech aşısı, bir RNA virüsü olan SARS-CoV-2 virüsünün genomu-nun S-proteinini (Spike proteini) kodlayan genetik kodun li-pid nanopartiküller içerisinde insan vücuduna enjekte edil-mesi yöntemi ile immün yanıt oluşturmaktadır. Mo-derna’nın mRNA-1273 aşısı Pfizer/Biontech aşısı gibi SARS-CoV-2 virüsünün genomunun S-proteinini (Spike proteini) kodlayan genetik kodun lipid nanopartiküller içerisinde formülasyonu ile üretilmektedir. Her iki aşı immün cevap

geliştirme stratejisi açısından aynı yöntemi kullanmaktadır.

Aralarındaki fark, genetik kod dizilimindeki teknik farklılık ile kullanılan ayrı lipid nanopartikül yapılarıdır (Yavuz, 2020).

mRNA AŞISININ ÜRETİM SAFHASI

Klinik kullanıma kadar olan süreçte bir aşı geliştirme-nin maliyeti 200-500 milyon dolardır ve 5-18 yıl arası bir zaman alır. Ancak COVID-19 gibi tüm dünyayı etkisine alan ciddi bir pandemide aşı geliştirilmesine çok daha büyük fi-nansal kaynaklar ayrılmıştır ve aşı çalışmalaı bu konuya yönlendirilmiştir. Aşı konusundaki gelişmiş teknikler, pan-demi öncesinde Ebola, SARS-Cov-1, Zikka gibi virüsler için aşı ve kanser tedavisi için yoğun şekilde çalışılmakta idi.

Pandemi sırasında bu tekniklerle beraber, aşı geliştirme çalışmalarında araştırma fazlarının birlikte yürütülmesi (Faz 1/2, Faz 2/3 gibi) geliştirme süresi açısından bir avan-taj sağlamıştır ve böylece COVID-19 aday aşıları 12-18 ay gibi kısa bir sürede acil kullanım onayına sunulabilmiştir (Yavuz, 2020).

Tablo 4. Aşı geliştirme çalışmalarında sürdürülmesi zo-runlu olan fazlar (Yavuz, 2020)

Üretim süreci, mRNA dizisini içeren bir DNA şablonu-nun in vitro transkripsiyoşablonu-nunu içerir. Bu mRNA, 5' çevril-memiş bölge (UTR), bir başlangıç kodonu ve bir açık okuma çerçevesi (ORF), bir durdurma kodonu ve ardından 3' UTR ve bir poli(A) dizisi gibi standart elemanlara sahiptir. ORF

sıklıkla ifade için optimize edilir (hem kodon optimizasyonu hem de çeviri ve stabilite için RNA optimizasyonu kullanıl-mıştır). Etkili translasyona izin vermek için mRNA kapatılır ve poliadenile edilir. Başlık, transkripsiyon sırasında veya transkripsiyonel olarak sonradan eklenebilir; poli(A) dizisi, transkripsiyon sırasında eklenebilir veya poli(A) polimeraz ile transkripsiyonel olarak sonradan eklenebilir. 5' ve 3' UTR'lerin dizileri, çeviri verimliliği üzerinde önemli bir et-kiye sahip olabilir (Knezevic, Liu, Peden, Zhou, & Kang, 2021).

mRNA'nın GMP (Good Manufacturing Practice) şartla-rında üretimi şu şekilde olur; DNA şablonu üretimi ve ardın-dan enzimatik in-vitro transkripsiyon (IVT) ile başlar ve araştırma ölçeğinde sentez için kullanılan protokolü izler, son olarak ürünün güvenliğini ve etkinliğini sağlamak için ek kontroller uygulanır. (Tanoğlu, 2021) Üretim süreci, T7 gibi DNA'ya bağımlı bir RNA polimeraz promotörü ve mRNA yapısı için karşılık gelen diziyi içeren bir plazmit DNA'nın (pDNA) üretilmesiyle başlar. pDNA, mRNA'yı kopyalamak üzere DNA'ya bağımlı RNA polimeraz için bir şablon olarak hizmet etmek üzere doğrusallaştırılır ve daha sonra bir DNaz işlem adımı ile indirgenir (Jackson et al., 2020).

Tablo 5. Aşı üretim safhaları (Tanoğlu, 2021)

Üretim sürecini başlatmak için, Escherichia coli bakte-risinde üretilen “şablon plazmit DNA” 3' ucunda bir poli-A kuyruğu olan transkriptlerin sentezine izin vermek için bir restriksiyon enzimi kullanılarak doğrusallaştırılır.

Daha sonra bakteriyofajlardan (T7, SP6 veya T3 gibi) elde edilen bir DNA bağımlı bir RNA polimeraz enzimi ile nükleotit trifosfatlardan mRNA sentezlenir. Şablon DNA daha sonra DNaz ile inkübasyon yoluyla yıkılır-parçalanır.

Sonraki basamakta, verimli in-vivo translasyon etkin-liği sağlamak için mRNA molekülleri enzimatik veya kimya-sal olarak kapatılır. Son olarak optimize edilmiş koşullar al-tında gram ölçekli reaksiyonlarda mRNA sentezi gerçekleş-tirilir.

mRNA sentezlendikten sonra, enzimler, serbest nükle-otidler, kalıntı DNA ve kesilmiş RNA fragmanları dahil ol-mak üzere reaksiyon bileşenlerini uzaklaştırol-mak için birkaç saflaştırma adımı uygulanır. Laboratuvar ölçekli preparas-yon için rutin olarak LiCl ile çöktürme kullanılırken, klinik ölçekte saflaştırma için büyük ölçekte kullanılması daha ko-lay olan parti veya kolon formatlarında türetilmiş mikro boncuklar kullanır. Bazı mRNA platformları için, interfe-rona bağlı translasyon inhibisyonunun güçlü bir indükleyi-cisi olan dsRNA molekülleri ve diğer kontaminantların uzaklaştırılması nihai ürünün gücü için kritiktir. Bu işlem la-boratuvar ölçeğinde ters fazlı FPLC (Fast Protein Liquid Chromatography) kullanılarak gerçekleştirilebilir. Ayrıca ölçeklenebilir sıvı fazlı (aqueous) saflaştırma yaklaşımları da denenmektedir.

mRNA molekülleri saflaştırıldıktan sonra, son bir sak-lama tamponu ile içerisine alınır ve sonrasında klinik kulla-nım için şişelere doldurulmak üzere steril filtrelerden geçi-rilir. RNA hem enzimatik hem de kimyasal yollarla bozun-maya duyarlıdır, bu nedenle kontaminan RNazlar veya “an-tioksidanlar ve şelatörler” gibi tampon bileşenlerini içerme-diğinden emin olmak için formülasyon tamponları ayrıca

test edilir. Böylece mRNA kararsızlığına yol açan reaktif ok-sijen türlerinin ve iki değerlikli metal iyonlarının etkileri en aza indirilir (Tanoğlu, 2021).

Tablo 6. Aşı üretim süreçlerinin karşılaştırılması (Blak-ney et al., 2021)

SaRNA aşılarının 2015 öncesi klinik öncesi çalışmaları ağırlıklı olarak viral replikon partikülleri ve kanser

uygulamalarına odaklanmış olsa da yakın zamanda viral bu-laşıcı hastalıklardaki uygulamalara kaymıştır. Bir monoklo-nal antikoru kodlayarak pasif bağışıklama için saRNA'nın araştırılması daha fazla gelişmeyi garanti eden oldukça umut verici bir uygulamadır. Kuduz ve SARS-CoV-2 için ya-pılan klinik deneyler, saRNA aşıları alanı için heyecan verici bir fırsattır ve bağışıklık tepkisinin özellikleri, gerekli doz, bağışıklık süresi ve gerekli rejim konusunda şüphesiz bilgi-lendirici olacaktır. SARS-CoV-2 küresel salgını ekonomilere ve sağlığa zararlı olsa da klinikte saRNA aşılarını test etmek için, aksi takdirde onlarca yıl sürebilecek değerli bir fırsat sağladı. Genel olarak, saRNA aşıları son beş yılda anıtsal adımlar attı ve önümüzdeki beş yıl bu umut verici aşı plat-formunun klinik faydası ve başarısı hakkında bilgi verecek (Blakney et al., 2021).

mRNA aşılarının klinik olarak etkili ve güvenli olduğu-nun kanıtlanacağını varsayarsak, merkezi avantajlardan biri üretim hızına bağlıdır. Haftalar içinde, immünojeni kod-layan bir dizinin bulunmasından sonra klinik gruplar oluş-turulabilir. İşlem hücre içermez ve ölçeklenebilir. En büyük avantajı, mRNA üretimine ayrılmış bir tesisin, süreçlere ve formülasyona minimum adaptasyon ile birden fazla hedefe karşı aşıları hızla üretebilmesidir. Ek olarak, çoklu antijen yaklaşımları gerektiren yeni hedefler, mRNA'nın birden çok yapı oluşturabileceği hızdan faydalanacaktır (Jackson et al., 2020).

Şüphesiz, yeni aşılara ihtiyaç duyduğumuz ajanlar, pa-togenezlerinde halihazırda aşılarımız olanlardan daha kar-maşıktır ve bu nedenle, şu anda sahip olduğumuzdan daha derin bir bağışıklık sistemi bilgisine ihtiyacımız vardır. Bu, HIV/AIDS ve sıtma gibi doğal bağışıklığın olmadığı hastalık-lar için özellikle önemlidir. Bununla birlikte, geçmiş, umut edilen geleceğe bir giriş olmuştur ve yakın zamanda gelişti-rilen tüm aşılar, koruyucu bağışıklık tepkisinin önceki bir analizine dayanmaktadır. Gelecekte bile, aşıların başarısı-nın, enfeksiyonun alınmasını önleyecek fonksiyonel

antikorun indüksiyonuna ve antikor varlığına rağmen en-feksiyon meydana gelirse patojen replikasyonunu kontrol eden spesifik hücresel fonksiyonlara bağlı olması muhte-meldir (Plotkin & Plotkin, 2011).

En bilgili bilim adamı bile gelecek yılın gribinin türünü kesin olarak tahmin edemez ve uzman bir epidemiyolog, be-lirli hastalıkların neden bebe-lirli oranlarda yükselip yok oldu-ğunu her zaman açıklayamaz. Moleküler biyoloji, genomik ve proteomik, benzer antijenler hakkında kesinlikle çok şey ortaya çıkaracak ve hayvan deneylerinden ziyade hücresel manipülasyon yoluyla aşıların geliştirilmesini teşvik ede-cektir (Stern & Markel, 2005).

Kaynaklar

Blakney, A. K., Ip, S., & Geall, A. J. (2021). An update on self-amplif-ying mRNA vaccine development. Vaccines, 9(2), 97.

Buschmann, M. D., Carrasco, M. J., Alıshetty, S., Paige, M., Alameh, M. G., & Weissman, D. (2021). Nanomaterial delivery systems for mRNA vaccines. Vaccines, 9(1), 65.

Deal, C. E., Carfi, A., & Plante, O. J. (2021). Advancements in mRNA Encoded Antibodies for Passive Immunotherapy. Vaccines, 9(2), 108.

Düzenli, Ö. F. (2021). Mycobacterium bovis Antijenlerinin Esche-richia coli’de Rekombinant DNA Teknolojisi ile Üretimi ve Alt Birim Aşı Geliştirilmesi.

Jackson, N. A., Kester, K. E., Casimiro, D., Gurunathan, S., & Derosa, F. (2020). The promise of mRNA vaccines: a biotech and in-dustrial perspective. npj Vaccines, 5(1), 1-6.

Keser, M., & Hatipoğlu, N. (2008). Bağışıklık Antijenleri ve Aşı İçe-riği. Journal of Pediatric Infection/Cocuk Enfeksiyon Dergisi, 2.

Kılıç, S. G., & Dolapçı, İ. (2021). History of Vaccines and New Vac-cine Strategies. Ankara Universites Tip Fakultesi Mecmuasi=

Journal of Ankara University Faculty of Medicine, 74(1), 1.

Knezevic, I., Liu, M. A., Peden, K., Zhou, T., & Kang, H.-N. (2021).

Development of mRNA Vaccines: Scientific and Regulatory Is-sues. Vaccines, 9(2), 81.

Koptur, M. (2020). RNA Dizileme Veri Analizi.

Payette, P. J., & Davıs, H. L. (2001). History of vaccines and positi-oning of current trends. Current Drug Targets-Infectious Di-sorders, 1(3), 241-247.

Plotkın, S. A., & Plotkın, S. L. (2011). The development of vaccines:

how the past led to the future. Nature Reviews Microbiology, 9(12), 889-893.

Rappuolı, R. (2014). Vaccines: science, health, longevity, and we-alth. Proceedings of the National Academy of Sciences, 111(34), 12282-12282.

Savaşçı, Ü., & Gül, H. C. (2021). Enfeksiyon Hastalıklarında mRNA Temelli Aşı Çalışmaları ve Güncel Gelişmeler Journal of Mole-cular Virology and Immunology.

Sinan, O., & Uşak, M. (2015). Is DNA Replicated in Protein Synthe-sis?

Stern, A. M., & Markel, H. (2005). The history of vaccines and im-munization: familiar patterns, new challenges. Health affairs, 24(3), 611-621.

Şahiner, F., & Aygar, İ. S. (2020). Aşı Teknolojisinde Yeni Bir Dö-nem: mRNA Temelli Aşı Tasarımı. Journal of Molecular Viro-logy and ImmunoViro-logy.

Tanoğlu, E. G. (2021). mRNA Aşılarının Üretim ve Dağıtımı: SARS-CoV-2 Deneyimi. Journal of Molecular Virology and Immuno-logy.

Yakıncı, C. (2020). Güncel Çocuk Sağlığı ve Hastalıkları

Yavuz, E. (2020). COVID-19 aşıları. Türkiye Aile Hekimliği Dergisi, 24(4), 223-234.

Atıf© Özdemir, Mehmet.- Afacan, Merve., “Aşıların Uygulanması”.

Koruyucu Hekimlikte Aşı. ed. Hasan Solmaz. s. 71-122. Karabük: Karabük

4. Bölüm