3. Gereç ve Yöntem
3.7 Pestisitlerin B. bombina üzerindeki potansiyel toksik etkilerinin amfibi embriyo ve larva
Bu çalışmada trifluralin (kimyasal ismi: α,α,α-trifluoro-2,6 dinitro-N,N dipropyl-p-toluidine) isimli bir herbisitin ticari formülasyonlarından biri olan Tirifilin (Tirifilin 48 EC, Koruma Klor Alkali San ve Tic AŞ) seçilmiştir. Daha önce B. bombina populasyonlarının bulunduğuna dair kayıt olan fakat bu proje kapsamındaki arazi çalışmalarımızda bu türe ait örneklere rastlayamadığımız lokalitelerden biri olan İpsala bölgesindeki yoğun kullanımı nedeniyle bu herbisit seçilmiştir. Trifluralin, endokrin sistem bozucu ve potansiyel insan karsinojeni olarak bilinen ve kullanımı gittikçe artmakta olan, yarılanma ömrü uzun bir pestisittir.
Amfibi embriyo ve larva toksisite testlerinde kullanılmak üzere blastula evresindeki (evre 8-9) sağlıklı embriyolar ile yumurtadan yeni çıkmış, sağlıklı larvalar (evre 21-22) seçilmiştir. Embriyo ve larva evrelerinin tespiti Gosner (1960)’a göre yapılmıştır. Toksisite testlerinde kullanılan tüm embriyo ve larvalar, laboratuar şartlarında ergin bireylerin gonadotrophin enjeksiyonuyla stimüle edilerek doğal dölleme yoluyla elde edilen yumurtalardan sağlanmıştır.
Yarı-statik sistem esas alınarak, 120 saatlik yenilenen embriyo ve larva toksisite testleri gerçekleştirilmiştir. Bu testler 22°C sıcaklıkta, içme suyu kullanılarak kapaklı cam petriler içinde gerçekleştirilmiştir. Embriyolar 0.1, 0.5, 1, 3, 5 µL/L, larvalar 0.5, 1, 2, 4, 8, 16, 32 µL/L trifluralin konsantrasyonlarına maruz bırakılmışlardır. Kontrol grubu ve her bir konsantrasyon grubunda 10 hayvan olacak şekilde tüm testler 3 tekrarlı olarak gerçekleştirilmiştir. Her 24 saatte bir gözlem yapılmış, ölen hayvanlar uzaklaştırılmış ve solüsyonlar tekrar yenilenmiştir. Toksisite testleri sonunda canlı kalan hayvanlar %3’lük formaldehit solüsyonunda tespit edilmiş ve bunların total uzunluk, baş+gövde uzunluğu ve
genişliği stereo mikroskopda mikrometrik oküler yardımıyla ölçülmüştür. Bu ölçümlerden elde edilen veriler, varyans analizi (ANOVA) ile test edildikten sonra, gruplar arası farklılıkların belirlenmesi için Multiple Range Testi uygulanmıştır. ANOVA ve Multiple Range Testi, Statgraphics Plus 5.0 istatistik programı kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Toksisite testleri sonunda, ölüm ve morfolojik bozukluklar değerlendirilerek, 120 saatlik letal ve etkili konsantrasyon değerleri (LC10, LC50, EC50, LC90) Probit Analiziyle (SPSS analiz programı kullanılarak) belirlenmiş ve Teratojenik Indeks (TI) değeri hesaplanmıştır. Gözlenen morfolojik anomaliler stereo mikroskop altında fotoğraflanmıştır.
3.8 Elektroforetik Analiz
Elektroforetik çalışmada, üreme mevsiminde (17.04.2004), deniz seviyesine yakın (4-10 m) yükseklikteki Durusu (İstanbul) ve Büyükdöllük (Edirne)’den 16(14♂♂, 2♀♀), Döşeme Bataklığı (Adapazarı)’ndan 11(5♂♂, 6♀♀) örnek canlı olarak laboratuvara getirilmiştir. Üç gün içinde, eterle bayıltıldıktan sonra kan örnekleri heparinli hematokrit kapiller tüplerle kalbin ventrikulusundan alınmış ve 600 g. de 5 dakika santrifüj edilerek elektroforetik separasyon yapılıncaya kadar -20o C’de saklanmıştır.
Kan-serum proteinlerinin elektroforetik separasyonu Davis (1964)’in poliakrilamid jel elektroforez yöntemini biraz değiştirerek uygulayan Özeti ve Atatür(1979)’e göre yapılmıştır.
Buna göre, elektroforetik separasyonlar “Canalco Model 1200” elektroforez apareyi ile oda sıcaklığında gerçekleştirilmiştir. Separe olmuş proteinleri içeren jeller %0.5 lik Amido Black (Naphtol Blue Black 10-B) ile boyanmışlar ve daha sonra fazla boyanın atılması % 7’lik asetik asit banyolarında passiv olarak gerçekleştirilmiştir. Jellerin kalitativ değerlendirmesi elektroferogramlardan direkt olarak yapılmış, separasyonların densitometrik eğrileri Gelman ACD-15 39430 densitometresi ile 500 nm’de elde edilerek resimleri çekilmiştir.
Elektroforetik çalışmalarda cinsel olgunluğa erişmiş örnekler kullanılmıştır. Kan-serum proteinlerinin elektroforetik analizinde cinsiyetler arasında dikkate değer farklılıklar gözlenmediğinden, erkek ve dişiler birlikte değerlendirilmiştir.
3.9 Allozim Varyasyonu Analizi
Çalışma Trakya ve Kuzey batı Anadolu’da gerçekleştirilmiştir. Kırmızılı kurbağalar, B.
bombina (Linnaeus, 1761) iki yıl içinde bahar aylarında gerçekleştirilen arazi çalışmalarında (2004–2005) üç ayrı üreme bölgesinden toplanmıştır. Büyükdöllük (Edirne), Durusu (İstanbul) ve Döşemebataklığı’ndan (Sakarya) toplam 53 (33♂♂, 20♀♀) ergin birey analiz edilmiştir. Kırmızılı kurbağalar laboratuara canlı olarak getirilmiş ve tüm doku örnekleri üç gün içerisinde alınmıştır.
3.9.1 Doku ekstraksiyonu ve elektroforez
Karaciğer, kalp, gonadlar ve iskelet kası doku parçaları enzim elektroforezi için kullanılmıştır. Doku parçaları, soğuk ekstraksiyon tamponu(100 mM KCl, 0.1 mM CaCl2, 1mM MgCl2, 10 mM potasyum HEPES, 50 mM sükroz, pH 7.7) içerisinde homojenize edilmiş, 14
000 RPM’de santrifüj edilmiş ve süpernatantlar elektroforez işlemine kadar -22 oC’de depolanarak korunmuştur. % 7 akrilamid ve % 0.5 agaroz içeren nativ jeller kullanılmıştır.
Elektroforetik ayırma işlemi sabit 30 mA akımda, 4 oC’de 18 x 16 x 0.15 cm ölçülerine sahip jellerde SE Ruby 600 (Ammersham Bioscience) elektroforez aparatı kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Enzimler küçük değişikliklerle Manchenko (1994)’de belirtilen standart yöntemlerle görüntülenmiş ve on iki enzim sistemi ile ilgili 20 allozim lokusu değerlendirilmiştir. Bu çalışma kapsamında kullanılan enzimler ve tampon sistemleri Tablo 36’da gösterilmektedir.
Allozim verilerinin genetik değerlendirilmesinde Buth (1990)’da önerilen yöntem kullanılmıştır. Bireylerin genotiplerinin belirlenmesinde farklı dokulardan elde edilen tüm bantlar birleştirilerek değerlendirilmiştir. Enzimlerin isimlendirilmesi ve E. C. Numaraları için temel olarak Murphy et al. (1996) kullanılmıştır.
3.9.2 Genotip verilerinin İstatistiksel Analizi
Allozim lokuslarındaki genetik varyasyon gözlenen (HO) ve beklenen(HE) heterozigotluk, polimorfik lokus yüzdesi (% 95 polimofizm ölçütü-P), allelik zenginlik-(A) ve gen çeşitliliği (GD) yönüyle değerlendirilmiştir. Allelik zenginlik ve gen çeşitliliği FSTAT 2.9.3 programı (Goudet 2001), allel frekansları ile gözlenen (HO) ve beklenen(HE) heterozigotluk değerleri GENEPOP 3. 4. (Raymond and Rouset 1995) programı kullanılarak hesaplanmıştır.
Bu program Hardy-Weinberg dengesinin, bağlantı dengesizliğinin ve tüm lokuslarda allel frekansı dağılımında heterojenliğin test edilmesinde de kullanılmıştır (Markov chain metod–
1000 iterasyon). Allozim lokuslarında genetik divergens düzeyi, FST ve FIS (Weir and Cocherham 1984) değerleri hesaplanarak belirlenmiştir.(FSTAT 2.9.3-Goudet 2001). FST
değerleri tüm lokuslarda ve populasyonlar arasıda karşılıklı olarak hesaplanmıştır.
Eşzamanlı çoklu karşılaştırmalar yapılırken, α=0.05 istatistiksel önem seviyesinin belirlenmesinde Bonferroni düzeltme prosedürü (Rice 1989) kullanılmıştır.
Polimorfik lokuslarda heterozigotluk analizi, Anadolu ve Trakya kırmızılı kurbağa populasyonlarında yakın zamanlı bir darboğaz etkisinin belirlenmesi amacıyla (Cornuet and Luikart 1996; Luikart et al. 1999), Bottleneck programı kullanılarak (version 1.2.02, Piry et al.
1999) gerçekleştirilmiştir. Bu program populasyonların mutation-drift dengesinde olduğu varsayımıyla polimorfik lokuslarda beklenen ve gözlenen heterozigotluk (Nei 1978) değerlerinin dağılımlarını karşılaştırır. Bu amaçla iki metod kullanılmıştır. İlk olarak Wilcoxon sign-rank testi ile, üç farklı mutasyon modelinde (infinite allele model-IAM, Kimura and Crow 1964; stepwise mutation SMM, Kimura and Ohta 1978; ve two-phase mutation model-TPM, Rienzo et al. 1994) heterozigot fazlalığı test edilmiştir.(Cornuet and Luikart 1996; Piry et al. 1999). İkinci olarak, Luikart and Cornuet (1998) tarafından tanımlanan kalitatif grafiksel metot ile allel frekans dağılımı analiz edilmiştir.
Populasyonlar arası genetik farklılaşma düzeylerinin belirlenmesi amacıyla Nei (1972) genetik uzaklık değerleri hesaplanmıştır. Genetik uzaklık matrisi UPGMA yöntemiyle (Sneath
and Sokal 1973) GDA 1.1. programı (Lewis and Zaykin 2002) kullanarak fenogramlara çevrilmiştir..
3.10 İskelet kronolojisi
İskelet kronolojisi,
Döşeme Bataklığı’ndan (Karasu-Adapazarı) toplanan toplam 29 birey ile yapılmıştır. Bu bireyler 0.2 gr. hassas tartım cihazı ile ağırlıkları tartılmıştır.Toplanan tüm bireylerin biometrik değerleri elde etmek için 0.02 mm. hassaslıkta verniye cetveli kullanılarak ölçümleri alınmıştır. Ölçümlerde Eiselt-Schmidtler (1973) ve Terentjev-Chernov (1965)’ un esasları göz önüne alınmıştır.
3.10.1 Kemikten Histolojik Preparat Hazırlanması
Yakalan örneklerin yaş tayinini belirlemek için sol arka ayağın 3. parmağının 3.
parmak ucu kemiği disekte edilmiştir. Etiketli tüplere parmak uçlarının öncelikle derileri ve kasları temizlenmiş ve daha sonra tekrar aynı % 10 luk formol-alkol tespit sıvısına içerisinde konulmuştur.
3.10.2 Kemiğin Dekalsifikasyon İşlemi
Kemikler üzerindeki tespit sıvısını uzaklaştırmak amacıyla, bir gece akar su altında bekletildi. Dekalsifiye süresi kemiklerin boyutlarına göre değişmektir. Dekalsifikasyon işlemi için, bizim örneklerden aldığımız parmak uçları 2-3 saat arasında % 3’ lük nitrik asit çözeltisinde bekletildi. Çalışmamızda, uzun kemiğin diafiz bölgesi kullanıldığından, resorbsiyonun az olduğu kısım tercih edildi. Dekalsifiye edilmiş kemiklerden nitrik asidi uzaklaştırmak için bir gece akar su altında bekletildi. Bu aşamadan itibaren rutin histolojik işlemlerden sonra hazırlanan parafin bloklarından 10 - 12 μm kalınlığında kesitler, uzun kemiğin diafiz bölgesinin orta kısmından alınarak, Erlich – hematoksilen ile boyandı.
Resorbsiyon kaybından doğabilecek hatayı en aza indirmek için, kesitlerin kemik iliği boşluğunun çevresi ve kesittin en dış çevresi mikrometre ile ölçülerek endostealdeki resorbsiyon yoğunluğu aşağıda verilen formülle hesaplandı (Leclair, 1990).
Endosteal Resorbsiyon Yoğunluğu = Kemik İliği Çevresi / Kesitin Çevresi X 100
3.10.3 İstatistiksel Değerlendirme
Tüm istatistiksel analizler SPSS 10.0 ve M.S Office Excel programlarında yapıldı. Yaş - Boy, Yaş - Ağırlık, Boy - Ağırlık ilişkileri için regresyon analizi kullandık. Populasyonu oluşturan erkek ve dişilerin ortalama vücut uzunluğu, ağırlığı ve yaşları arasında farklılık olup olmadığını t-testi ile saptadık. Erkek ve dişilerin büyüme oranları; büyümenin matematiksel ifadesi olan von Bertalanffy tarafından geliştirilen büyüme eşitlikleri kullanıldı.
Yaş - Boy ilişkisi için SVLt = SVLmax (1- e –k ( t - t0) ) Yaş - Ağırlık için Wt = Wmax (1- e –k ( t - t0) )b
SVLt ve Wt : “ t ” yaşındaki örneklerin ortalama vücut uzunluğu ve ağırlığı SVLmax ve Wmax : asimptotik boy ve ağırlığı
k : Brody büyüme katsayısı