Biyoakustik

Anur reklam çağrıları türe özgü olup çiftleşme öncesi izolasyon mekanizması ödevi görür (Blair 1958; Littlejohn 1965). Bu nedenle değişik grupların reklam çağrılarındaki farklılıklar taksonomik açıdan bir indikatör yada ayırıcı olarak kullanılabilir (Sullivan et al.

1966). Bazı iç veya dış faktörler, örneğin temperatur, reklam çağrılarında az veya çok değişkenliğe sebep olabilir (Schneider 1967). Ancak farklı grupların karşılaştırılmasında kullanılan uygun istatistiksel yöntemler, bu değişkenliklerin etkilerini azaltarak bu grupların kıyaslanmasını olası kılar. Çesitli türlerin taksonomik konumlarının aydınlatılmasında uzun süredir reklam çağrıları kullanılmaktadır (Schneider et al. 1984; Kaya and Simmons 1999;

Schneider and Sinsch 1999).

İncelenen her iki alttürün reklam çağrı parametreleri sıcaklığa bağımlı olarak değişiklik göstermiştir. Genellikle artan sıcaklık, incelenen farklı anur türlerinde, çağrı sürelerinin azalmasına neden olmaktadır. Bu çalışma sonunda elde ettiğimiz bulgularımız, bu kapsamda, diğer türlerle benzerlik göstermektedir (Kaya ve Simmons 1999; Kaya 2002).

Ayrıca bu çalışmada, reklam çağrıları karşılaştırılan alttürler arasında hem temporal (çağrı süresi, çağrı arası, çağrı periyodu), hemde specktral (dominant frekans) parametreler balkımından önemli seviyede farklılıklar olduğu ortaya konmuştur (Tablo 26, 27 ve 28; Şekil 26, 27, 28 ve 29).

Yurdumuzda Marmara bölgesinde yaşadığı ileri sürülen iki farklı alttüre ait örneklerin reklam çağrılarının temporal ve spectral parametreleri (çağrı süresi, çağrı arası, çağrı periodu

ve dominant frekans) analiz edilmiş ve istatistiksel olarak karşılaştırılmıştır. Biyoakustik analizler sonucunda elde edilen bulgular söz konusu bölgede farklı iki alttürün, B. bombina bombina ve B. bombina arifiyensis, varlığını destekler durumdadır.

5.6 Üreme Biyolojisi ve Erken Embriyonik Gelişim

B. bombina için Yılmaz (1984) tarafından, 22 gün olarak bildirilen yumurtadan çıkma süresi, ortalama 6 gün olarak saptanmış olan bu proje bulgusu ile karşılaştırıldığında oldukça abartılı bir değerdir. Buna karşın, ortalama yumurtadan çıkma süresini 6.2 gün olarak belirten Kine et al. (2004)’ın çalışması bizim bulgumuzu destekler niteliktedir. Bir seferde bırakılan yumurta sayısı ve ovum çapı açısından, bu proje bulguları Özeti ve Yılmaz (1994) ile uyumludur. Fakat B. bombina için bir seferde bırakılan yumurta sayısı Kinne et al. (2004) tarafından 30.6, Rafinska (1991) tarafından da 32.5 olarak bildirilmiş olup, bu değerler mevcut projede 104 olarak saptanan ortalama değerden oldukça düşüktür. Kinne et al.

(2004) bu sayının dişinin boyutu ve yaşına bağlı olarak varyasyonlar gösterebileceğini belirtmiştir. Bu çalışmalarda (Rafinska, 1991; Kinne et al. 2004) 1.49 olarak belirtilen ovum çapı, 1.50 olan mevcut proje bulgusu ile uyumludur.

B. bombina’nın 22°C’de erken embriyonik gelişim evreleri morfolojik ve zaman verileri açısından belirlenmiştir ve Gosner (1960)’a göre, bu türe özel erken embriyonik gelişim tablosu hazırlanmıştır. Bu türün erken embriyonik gelişimine ilişkin veriler anur embriyonik gelişiminde pek fazla çalışılmamış olan interspesifik varyasyonları ortaya koyabilmesi açısından önem taşımaktadır.

5.7 Pestisitlerin B. bombina üzerindeki potansiyel toksik etkilerinin amfibi embriyo ve larva toksisite testleriyle belirlenmesi

Bu çalışmada trifluralin’in, B. bombina embriyo ve larvaları üzerindeki toksik etkileri araştırılmıştır. Sucul organizmalar için oldukça toksik olan trifluralin, nesli tehlike altında olan türler için büyük tehlike potansiyeline sahip bir herbisittir (Reigart ve Roberts, 1999). Daha önce yapılan çalışmalar aynı zamanda bu herbisitin düşük dozlarda sucul organizmaların omurga gelişiminde anomalilere neden olduğunu göstermiştir (EPA, 1996).

B. bombina embriyo ve larvaları için bu çalışmada hesaplanan LC₅₀ değerleri sırasıyla 9.40, 10.07 µL/L olup, bu değerler türün embriyo ve larvalarının trifluralin’e olan duyarlılıklarının hemen hemen aynı olduğunu göstermektedir. Bununla birlikte, Anguiano et al. (1994); Bufo arenarum embriyoların, organik fosforlu bir insektisit olan parathion’a karşı aynı türün larvalarına oranla daha toleranslı olduğunu (LC50 değerleri sırasıyla 20,2 ve 4,5 mg/L) saptamışlardır.

Bu araştırmada, yapılan toksisite denemeleri ile trifluralin’in B. bombina embriyo ve larvalarının gelişimi üzerinde, postembriyonik gelişimde gecikmeler ve büyüme oranlarında

azalmalar şeklinde bir takım olumsuz etkiler yarattığı ortaya konmuştur. Benzer şekilde, Dial ve Bauer (1984)’de herbisit olarak yaygın bir kullanımı olan paraquat ile 21. evre Rana pipiens larvalarını kullanarak yaptıkları 5 günlük akut toksisite testleri sonucunda; kontrol grubunun 25. evreye geçtiğini fakat maruz kaldıkları konsantrasyona bağlı olarak uygulamadaki larvaların 25. evreye geçemeyip 24. veya 23. evrede kaldıklarını gözlemişlerdir. Çeşitli pestisitlerin amfibi larvalarının büyüme ve gelişimi üzerinde büyüme oranlarının azalması ve metamorfozda gecikmeler şeklinde benzer etkiler oluşturduğu diğer birçok araştırıcı (Marchal-Segault and Ramade, 1981; Marian et al., 1983; Mizgireuv et al., 1984; Berril M.et al., 1993; Bernardini, G. et al., 1996) tarafından da saptanmıştır. Zirai alanlarda veya bu alan yakınlarında lokalize olmuş bir amfibi populasyonundaki larvalar için büyümenin gecikmesi ciddi problemler yaratabilir. Metamorfozdaki bir gecikme, yıl içinde geçici gölcüklerin kuruması ile ortaya çıkan kuraklık ve predatörlere av olma durumlarından dolayı larvaların hayatını büyük riske sokabilir. Buna ilaveten; metamorfozdaki gecikmeler, larvaların pestisit kalıntılarına maruz kalmalarını arttıracaktır.

Bu çalışmada, trifluralin’e maruz bırakılan B. bombina larvalarında ödem, kuyruk ve omurga deformasyonları, pigmentasyonda azalma, bağırsakların düzensiz kıvrımlanması şeklinde morfolojik anomaliler tespit edilmiştir. Bernardini et al. (1996) tarafından da ödem ve anormal barsak kıvrımlanmaları şeklinde benzer malformasyonlar saptanmıştır. Dial ve Bauer (1984) paraquat’ın R. pipiens larvalarında kuyruk anomalilerine (kuyruğun gelişmeyip küçük kalması, kıvrık olması gibi) neden olduğunu bildirmişlerdir. Pestisitlerin amfibiler üzerinde meydana getirdiği morfolojik etkiler olarak kuyruk deformasyonları ve ödem (Rzehak et al., 1977); baş, gövde ve kuyrukta anomaliler (Pawar et al., 1983); büyümede gecikme, pigmentasyonda azalma, kuyrukta kısalma (Bancroft ve Prahlad, 1973) bildirilmiştir.

Pestisitlerin larvalarda oluşturduğu bu anomaliler, larvaların güçten düşmesine neden olarak onları doğal predatörlerine karşı daha savunmasız ve çevresel stresle başa çıkamayacak bir duruma getirir (Bishop, 1992). Tomar ve Pandey (1988) organik fosforlu bir insektisit olan nuan’ın Rana tigrina larvalarının epidermal melanoforları üzerindeki subletal etkilerini incelemiş ve insektisit konsantrasyonlarındaki artışa paralel olarak pigmentasyonda azalma meydana geldiğini bildirmiştir. Bu çalışma sonuçları, trifluralin’in B. bombina larvalarının pigmentasyonunda azalmalara neden olduğu şeklindeki mevcut çalışma bulgularını desteklemektedir. Bu araştırıcılar (Tomar ve Pandey, 1988), melanoforlardaki melaninin insektisit etkisiyle hücre merkezinde toplandığı için pigmentasyonda azalmanın gözlendiğini bildirmişlerdir. Bu olayın MSH (Melanine Stimulating Hormone) hormonu kontrolündeki melanin hareketlerinin neurotoksik maddeler olan insektisitlerin sinir sisteminde meydana getirdiği değişikliklerden kaynaklanabileceğini bildirmişlerdir. Pigmentasyonun azalması şeklindeki benzer sonuçlar Dumpert ve Zietz (1984) tarafından da bildirilmiştir.

Pestisit kirliliği, amfibilerin besin ve habitatlarının miktarında ve niteliğinde azalmaya neden olur. Bu kimyasalların büyük bir kısmı hedef olmayan omurgasızlara da toksiktir. Aynı

şekilde herbisitler de alg ve sucul makrofitlere toksik etkiler yapabilirler. Dolayısıyla alg ve sucul omurgasız populasyonlarında azalmalara neden olurlar. Larvalar için besin olan alglerin, erginlere besin teşkil eden omurgasızların ve predatörlere karşı sığınak teşkil eden makrofitlerin azalması veya yok olması tahmin edileceği gibi amfibi populasyonlarına tahrip edici etkiler yapacaktır (Bishop, 1992). Amfibi populasyonlarındaki bazı azalmaların nedenleri halen açıklanamamıştır (Wake, 1991). Artık günümüzde bu azalmalara neden olan bir faktör olarak pestisit kirliliği de dikkate alınmaktadır. Mevcut sonuçlar pestisitlerin tek başına veya diğer antropojenik streslerle birlikte amfibi populasyonlarının azalmasına neden olabileceğini göstermektedir.

5.8 Elektroforetik Analiz

Birçok araştırıcı (Dessauer and Fox 1956; Chen 1967; Ferguson 1980; Arıkan 1990) amfibi ve reptillerin kan-serum proteinlerinin elektroforetik separasyonundan elde edilen protein fraksiyonlarının sayısı, hızı ve yoğunluğunun taksonomik önemine dikkat çekmişlerdir. Ferguson (1980)’a göre genetik variasyonların kalitatif farklılıklara; cinsiyet, yaş, mevsim ve çevresel faktörlerin kantitatif farklılıklara neden olduğu, dolayısıyla kalitatif farklılıkların taksonomik öneme sahip olduğu vurgulanmaktadır.

Sonuç olarak, Anadolu’dan Döşeme Bataklığı populasyonu örneklerinde kan-serum proteinleri toplam 9 protein fraksiyonu yada fraksiyon grubuna sahip iken Trakya’dan Durusu ve Büyükdöllük populasyonları örneklerinde kan-serum proteinleri toplam 10 fraksiyon yada fraksiyon grubuna sahiptir. Dolayısyla, Anadolu ve Trakya populasyonları arasında kan-serum proteinlerinin elektroforetik şekilleri açısından kalitatif bir farklılık ortaya çıkmıştır. Bu bulgu, daha önce Özeti ve Yılmaz (1987) ve Özeti ve Arıkan (1989)’ı destekler durumdadır.

5.9 Allozim Varyasyonu Analizi

Bu çalışmada incelenen populasyonlar küçük ve izole populasyonlarda beklenenin aksine yüksek derecede genetik varyasyona sahiptir. Populasyonlar arasında genetik varyasyon miktarı oldukça benzer olmasına karşılık Gd–1 ve G6pd–1 lokuslarındaki varyasyon Anadolu ve Trakya populasyonlarını farklılaştırmaktadır. Anadolu örneklerinde Gd–1 lokusunda b ve G6pd–1 lokusunda a alleli dominantken, Trakya populasyonlarında Gd–1 lokusunda a ve G6pd–1 lokusunda b alleli dominant olarak bulunur (Şekil 42). Bunun yanı sıra Anadolu Döşemebataklığı populasyonunda Aat–2 (b alleli) ve Trakya Büyükdöllük populasyonunda Pgm–2 (a alleli) lokuslarında tek allelin frekansı oldukça düşüktür ve bağlantılı olarak heterozigotluk düşük bir seviyededir. Aat–2 and Sod–2 lokuslarında allel frekansları aynı zamanda coğrafik olarak kline benzeri bir değişim göstermektedir (Şekil 42) ve en yüksek F_ST değerlerine sahiptirler (Tablo 37). Bazı lokuslar, Avrupa B. bombina populasyonlarından önemli farklılıklarda göstermiştir. Ldh–1, Aat–1 ve G6pd lokusları Avrupa populasyonlarında tek allel bakımından monomorfik olarak belirtilmektedir(Hofman and

Szymura 2000) ancak bu çalışmada incelenen Trakya ve Anadolu populasyonları bu lokuslar bakımından polimorfik olarak belirlenmiştir. Bunun yanı sıra bireysel populasyon bazında Hardy–Weinberg dengesinden bir sapmanın bulunmayışı ancak tüm populasyonlar birlikte değerlendirildiğinde önemli bir sapmanın gözleniyor olması populasyonların genetik olarak farklılaşmaya başladıklarının bir göstergesidir.

Trakya ve Anadolu populasyonları arasındaki genetik uzaklık değerleri (0.0225–

0.0446), bu populasyonların genetik anlamda çok yakın ilişkili olduklarını göstermektedir. Nei genetik uzaklık değerleri tek başına, populasyonların divergens zamanları hakkında tam bir tahmin sağlamıyor olsa da, populasyonlar arasında belirlenen küçük genetik uzaklıklar populasyonların nispeten yakın tarihli oluşumunu göstermektedir. Bombina türü için bugüne kadar yapılmış bir moleküler saat kalibrasyonu yapılmadığı için, bu türde allozim lokuslarında divergens hızı hem genel bir ölçüt olarak Nei 1975’de belirtilen 5 x 10⁶ yıl ve hem de bu türe en yakın akraba tür Alytes için belirlenmiş moleküler saat kalibrasyonu 1,4 x10⁶ (Garcia-Paris and Jockusch 1999) yıl kabul edildiğinde, Trakya ve Anadolu populasyonları arasındaki ortalama uzaklık değerleri Orta ya da Üst Pleistosende bir ayrımın gerçekleştiğini göstermiştir. Hesaplanan bu divergens zamanı iki soyun coğrafik bir bariyer olarak İstanbul Boğazı’nın oluşumundan önce ayrıldığını düşündürmektedir. Böylece Trakya ve Anadolu populasyonlarının gerçekten de farklı atasal kökene sahip oldukları ve kurucularının türün sahip olduğu çeşitliliğin farklı fraksiyonlarını taşıdığını söylemek mümkündür.

Kırmızılı kurbağa B. bombina, orta ve doğu Avrupa’da yaygın olarak dağılış gösterir ve aynı zamanda Anadolu’da Sakarya ovasında küçük bir alanda sınırlı olarak bulunur. Türün bugünkü dağılışı bölgenin geçmiş jeolojik tarihinin bir sonucu olarak ortaya çıkmış olmalıdır.

Anadolu populasyonlarının izole ve periferal lokasyonu Anadolu’da bulunan kırmızılı kurbağaların Doğu Avrupa’dan orjinlendiğini ve Sakarya civarında kolonize olduğunu düşündürmektedir. Son 3 milyon yıl içinde, Karadeniz birçok kez tamamen izole bir iç denizden tuzlu-acı bir denize dönüşmüştür (Bahr 2005; Major et al. 2006; Ryan et al. 1997).

Karadenizin tüm Pleistosen’in % 90’ını tatlı su olarak geçirdiği hesaplanmıştır (Major et al.

2006; Ross 1978). Bu tatlı su periyodları boyunca, Avrupa ve Anadolu arasında bir bağlantı tekrar tekrar kurulmuş ve olasılıkla, hem kıyı zonda bulunan nehir sistemleri ve hem de İstanbul boğazı B. bombina’nın Anadolu’ya geçişini sağlamıştır (Şekil 52). Son buzul çağının bitmesinden hemen sonra Karadeniz’in İstanbul ve Çanakkale boğazları yoluyla küresel okyanuslara bağlanmasıyla (~9.4 ka BP cal) Anadolu’da bulunan B. bombina, Avrupa populasyonlarından tamamen ayrılmıştır. Diğer taraftan B. bombina’nın Avrupa populasyonu, son buzul çağında olasılıkla Karadeniz bölgesinde izole olduğu ve buzul çağının sona ermesi sonrasında da Orta Avrupa’da yeniden kolonize olduğu belirtilmiştir (Arntzen 1978; Hewitt 2004; Spolsky et al. 2006; Szymura 1993; Szymura et al. 2000). Bu veriler ışığında günümüzde bulunan, Avrupa, Trakya ve Anadolu B. bombina gruplarının farklı kolonizasyon tarihlerine sahip oldukları açıktır. Bu durumda hem allozim frekanslarında ve hem de

kromozomlarında bazı coğrafik sinyallerin bulunması beklenen bir durumdur. Türün Trakya ve Anadolu populasyonlarının göç, kolonizasyon, izolasyon ve farklılaşma süreçleri Şekil 52’de gösterilmektedir.

Populasyonlar aynı zamanda yüksek seviyede bir heterozigotluk fazlalığı sergilemişlerdir (one tail test; p<0.001). Bu şekilde önemli bir heterozigotluk fazlalığı etkili populasyon büyüklüğünde yakın zamanlı bir darboğaz etkisinin (population bottleneck) ve aynı zamanda heterozigotların seçilim avantajının (heterozygote superiority) bir belirteci olarak alınmaktadır. (Cornuet and Luikart 1996). Populasyon darboğaz etkisisı ve kurucu etkisi, jenerasyonlar sonrasında gözlenenden çok olayın gerçekleşmesi sonrasında izlenen bazı farklı özelliklere sahiptir. Bir populasyon darboğaz etkisisı sonrasında allelik çeşitliliğin heterozigotluktan daha hızlı bir şekilde azalması nedeniyle bir heterozigotluk fazlalığı gözlenecektir. (Cornuet and Luikart 1996; Nei et al. 1975).Ek olarak, populasyon darboğaz etkisi sonrasında gözlenecek diğer bir durum, allel frekansı aralığının karakteristik bir şekilde değişmesidir. Allel frekanslarındaki bu kayma geçici olduğu ve ilerleyen jenerasyonlarda beklenen frekans aralığına geri döneceği belirtilmektedir. (Luikart and Cornuet 1998). Bu şekilde hem heterozigotluk hem de allel frekans dağılımı daha önce meydana gelmiş olan bir darboğaz etkisinin ve kurucu etkilerinin belirlenmesinde kullanılmaktadır. (Cornuet and Luikart 1996).

Bu çalışmada, çalışılan tüm populasyonlarda, kuvvetli bir populasyon darboğaz etkisi geçirildiği gösterilmiştir. Yakın zamanda populasyon darboğaz etkisi geçiren populasyonlarda bazı nadir allellerin kaybedilmesi diğer önemli sonuçtur. Anadolu Döşemebataklığı populasyonunda Aat–2 ve Trakya Büyükdöllük populasyonunda Pgm–2 lokusları hemen hemen tek allelde fikse olduğu görülmektedir (Şekil 42).

Şekil 52: Trakya ve Anadolu B. bombina populasyonlarının göç, kolonizasyon, coğrafik izolasyon ve genetik farklılaşma süreciiçin önerilen model a ve b B. bombina’nın Avrupa populasyonunun Trakya ve Anadolu’ya geçiş rotalarını gösterir (~223–64 ka BP cal), kesikli çizgiler kurucu populasyonun sınırlarını, beyaz kırıklı çizgi coğrafik izolasyonu (~10 ka BP cal) ve oklar, darboğaz etkisini belirler

Populasyonların genetik yapı özellikleri, Anadolu ve Trakya populasyonlarının olasılıkla kurucu etkileri nedeniyle kuvvetli ancak atlatılmış en az bir populasyon darboğazı geçirdiklerini göstermektedir. Eğer bu periferal ve izole B. bombina populasyonlarında türleşme gerçekleşiyorsa, kurucu etkileriyle olduğu ve genetik revolüsyon modeli ile en iyi uyum gösterdiği söylenebilir.

Anadolu ve Trakya B. bombina populasyonları türün dağılım sahasının dışında periferal ve izole olarak bulunur ve aynı zamanda genetik olarak farklılıklar gösterdiği bu çalışma ile ilk defa gösterilmiştir. Herhangi bir populasyonun yok olması türün sahip olduğu genetik varyasyonun azalması yönündeki etkileri düşünüldüğünde, bu populasyonların, genetik varyasyon kaybını önleyecek şekilde özel bir koruma önceliğine sahip olduğu açıktır.

Bu açıdan, Avrupa’da hâlihazırda korunma altındaki türler (EU-FFH-species) listesinde bulunan bu türün Anadolu ve Trakya populasyonları için ulusal çapta uygun yenileme projelerinin geliştirilmesi oldukça büyük önem taşımaktadır.