Allozim varyasyonu Analizi

Bu çalışmada 12 enzim sistemini kontrol eden 20 allozim lokusundaki genetik çeşitlilik analiz edilmiştir. Tablo 36’da bu lokuslarla ilgili allel sayıları, beklenen ve gözlenen heterozigtluk değerleri gösterilmektedir.

Tablo 36: B. bombina populasyonlarında 15 polimorfik allozim lokusunda beklenen ve gözlenen heterozigotluk (HE, Ho,) ve gen çeşitliliği (GD), P* değerleri Hardy-Weinberg dengesiyle ilişkili olasılık değerlerini göstermektedir. N:örnek sayısı

Populasyon, N

Anadolu Döşemebataklığı,

18 Trakya Durusu, 15 Trakya Büyükdöllük, 20

Loci HE Ho GD P* HE Ho GD P* HE Ho GD P*

0.669 Adh–1 0,424 0,611 0,431 0.124 0,357 0,466 0,367 0.528 0,498 0,450 0,513

0.057 Adh–2 0,444 0,666 0,451 0.102 0,444 0,533 0,457 1.000 0,438 0,650 0,445

0.548 Ldh–1 0,424 0,611 0,431 0.124 0,231 0,266 0,238 1.000 0,320 0,400 0,326

0.548 Ldh–2 0,375 0,500 0,382 0.524 0,124 0,133 0,129 1.000 0,320 0,400 0,326

0.339 G–6-Pd 0,493 0,777 0,500 0.049 0,464 0,733 0,471 0.085 0,468 0,350 0,484

0.118 Sod–1 0,444 0,666 0,451 0.102 0,500 0,733 0,510 0.141 0,420 0,600 0,426

0.002 Sod–2 0,375 0,166 0,392 0.032 0,500 0,466 0,519 1.000 0,498 0,150 0,521 Ada–1 0,401 0,444 0,412 1.000 0,497 0,933 0,500 0.002 0,468 0,450 0,482 1.000

0.367 Ada–2 0,375 0,388 0,386 1.000 0,480 0,400 0,500 0.600 0,498 0,650 0,508

0.649 Aat–1 0,486 0,277 0,507 0.137 0,491 0,466 0,510 1.000 0,495 0,600 0,505 Aat–2 0,105 0,111 0,108 1.000 0,480 0,666 0,49 0.288 0,500 0,400 0,516 0.392 Pgm–1 0,5 0,555 0,513 1.000 0,491 0,600 0,505 0.614 0,455 0,500 0,466 1.000 Pgm–2 0,196 0,222 0,203 1.000 0,464 0,733 0,471 0.085 0,095 0,100 0,097 1.000 0.256 Gd–1 0,401 0,555 0,503 0.250 0,444 0,666 0,238 0.112 0,398 0,550 0,492

0.042 Gd–2 0,493 0,444 0,500 0.656 0,391 0,533 0,500 0.507 0,455 0,700 0,461 ortalama 0.297 0.350 0,411 0.121 0.318 0.329 0,427 0.151 0.316 0.324 0,437 0.075

SD 0.199 0.268 0,114 0.210 0.301 0,124 0.209 0.254 0,112

*

4.9.1 Genetik Çeşitlilik, Hardy-Weinberg Dengesi ve Bağlantı Dengesizliği

Çalışmada incelenen tüm populasyonlar çoğu allozim lokusunda yüksek seviyede genetik varyasyon göstermektedir. Çalışılan 20 allozim lokusunun 15’i polimorfik ve 5’i.

(Mdhp, Pgd, Glyd, Atpase–1 ve Atpase–2) monomorfiktir. Polimorfik lokus yüzdesi (% P) tüm örneklerde 0.75 olarak belirlenmiştir. Beklenen heterozigotluk değerleri (H_E) 0.297–0.318 arasında değişmektedir. Genetik varyasyonun miktarı populasyonlar arasında büyük bir farklılık göstermemektedir. Tüm polimorfik lokuslarda ve tüm populasyonlarda iki allel gözlenmiştir. (Tablo 37). Allel frekansları Tablo 37’de gösterilmektedir. Şekil 42’de gösterildiği gibi Ldh–2, Gd–1, Aat–2, G6pd–1, Sod–2, Ada–1, Ada–2 ve Pgm–2 lokuslarında allel frekanslarında coğrafik farklılıklar gözlenmiştir.

Tablo 37: Anadolu ve Trakya B. bombina populasyonlarında 20 allozim lokusunda allel frekansları

Allel Allel frekansları

lokus Döşemebataklığ

Şekil 42: Anadolu ve Trakya B. bombina populasyonlarında allel frekanslarında coğrafik farklılıklar gösteren lokuslara ait pasta grafikleri. a. Ldh-2, Gd-1, Aat-2 and G6pd-1, b. Sod-2, Ada-1,2 and Pgm-2 Büyük daireler erkek ve dişi karışık, küçük olanlar sadece erkek bireyler (örnek sayısı 15’in üzerinde). 1-Döşemebataklığı, 2-Durusu, 3-Büyükdöllük.

Populasyon (p>0.001)ya da lokus (p>0.001)bazında Hardy–Weinberg dengesinden bir sapma gözlenmemiştir (Tablo 36) fakat tüm populasyonlar birlikte değerlendirildiğinde HWE’den önemli bir sapma ve heterozigot bireylerde önemli bir fazlalık belirlenmiştir (U-test, p<0.001). Bağlantı dengesizliği analizi (Fisher’s exact test- önem seviyesi 1%) herhangi bir populasyonda hiçbir lokus çiftinde bağlantı olduğuna dair bir olasılık değeri vermemiştir. FIS

değerleri tüm populasyonlarda çoğu lokus için negatif değerler vermiş olsa da, p değerleri Bonferroni düzeltme prosedürü sonrasında değerlendirildiğinde önemli bulunmamıştır (Tablo 38).

G-testi, populasyonlarda genotipik dağılım benzerdir hipotezini tamamen reddetmiştir (p<0.001).

Tablo 38: Allozim lokuslarına ait FST ve populasyonlara ait FIS değerleri

populasyon

Anadolu

Döşemebataklığı, Trakya Durusu, Trakya Büyükdöllük,

lokus FST FIS

4.9.2 Yakın zamanlı populasyon darboğaz etkisine ait kanıtlar

Allel frekansları, yakın zamanlı bir darboğaz etkisinin belirlenmesi için, populasyonların mutasyon genetik-drift dengesinde olduğu varsayımıyla her bir polimorfik lokus ve populasyonda beklenen heterozigotluk dağılışını gözlenen allel sayılarından hesaplayarak gözlenen heterozigotluk değerleriyle karşılaştıran Bottleneck (Cornuet and Luikart 1996; Piry et al. 1999) programı ile analiz edilmiştir. Tüm populasyonlar IAM, TPM ve SMM altında çoğu lokusta yüksek derecede önemli (p<0.001) bir heterozigotluk fazlalığı sergilemiştir. Böylece tüm populasyonlarda analiz edilen 15 polimorfik lokusun üç farklı mutasyon modelinde dengede olduğu varsayımları reddedilmiştir. Anadolu ve Trakya B.

bombina populasyonlarında polimorfik lokuslarda her üç mutasyon modelinde genetik çeşitlilik fazlalığı (genetic diversity excess )(He > Heq) Tablo 39’da gösterilmektedir. Benzer şekilde, allel frekans dağılımı, mutasyon-drift dengesinde beklenen normal L-şekilli dağılımı göstermemiştir ve analiz edilen her üç populasyon için yakın zamanlı bir populasyon darboğaz etkisi için önemli bir istatistiksel kanıt elde edilmiştir.

Tablo 39: Trakya ve Anadolu B. bombina populasyonlarında polimorfik lokuslarda genetik çeşitlilik fazlalığı (He > Heq) Heq–beklenen denge heterozigotluğu ve He–gen çeşitliliği Nei (1978).

IAM: infinite allele model, SMM: stepwise mutation model ve TPM: two-phase mutation model, P: olasılık (He > Heq), n: haploid genom sayısı

Adh-1 Anadolu Döşemebataklığı Sample, N=36 0.437 IAM p=0.00008 0.233 0.198 SMM p=0.0001 0.262 0.249 TPM p=0.00011 0.280 0.283 Trakya Durusu Sample, N=30 0.434 IAM p=0.00002 0.245 0.218 SMM p=0.00002 0.266 0.256 TPM p=0.00002 0.284 0.287 Trakya Büyükdöllük Sample, N=40 0.501 IAM p=0.00003 0.229 0.075 SMM p=0.00003 0.251 0.094 TPM p=0.00003 0.273 0.108

Adh-2 0.457 0.234 0.178 0.258 0.200 0.276 0.232 0.405 0.244 0.264 0.270 0.315 0.287 0.344 0.481 0.230 0.132 0.251 0.142 0.273 0.170

Ldh-1 0.286 0.232 0.389 0.263 0.469 0.274 0.500 0.370 0.247 0.314 0.270 0.359 0.289 0.412 0.385 0.226 0.255 0.253 0.312 0.269 0.337

Ldh-2 0.157 0.235 0.481 0.258 0.416 0.273 0.369 0.405 0.246 0.266 0.271 0.317 0.288 0.348 0.328 0.229 0.329 0.258 0.400 0.272 0.432

G-6Pd 0.489 0.236 0.122 0.262 0.140 0.278 0.152 0.517 0.244 0.014 0.269 0.017 0.292 0.018 0.501 0.225 0.073 0.248 0.085 0.270 0.109

Sod-1 0.500 0.234 0.084 0.264 0.114 0.273 0.117 0.497 0.245 0.114 0.272 0.134 0.289 0.154 0.431 0.224 0.191 0.251 0.235 0.265 0.256

Sod-2 0.514 0.232 0.011 0.260 0.013 0.279 0.017 0.497 0.243 0.104 0.272 0.132 0.286 0.149 0.481 0.230 0.124 0.251 0.137 0.274 0.167

Ada-1 0.489 0.231 0.112 0.261 0.135 0.277 0.157 0.508 0.242 0.074 0.272 0.098 0.288 0.105 0.467 0.226 0.144 0.252 0.173 0.272 0.209

Ada-2 0.513 0.230 0.038 0.264 0.051 0.272 0.049 0.515 0.244 0.049 0.271 0.055 0.288 0.064 0.481 0.228 0.124 0.254 0.153 0.271 0.165

Aat-1 0.508 0.229 0.061 0.261 0.077 0.279 0.089 0.508 0.249 0.086 0.269 0.099 0.289 0.106 0.501 0.228 0.078 0.257 0.094 0.272 0.103

Aat-2 0.500 0.235 0.082 0.255 0.102 0.276 0.122 0.405 0.246 0.267 0.268 0.306 0.291 0.351 0.409 0.231 0.232 0.251 0.270 0.272 0.311

Pgm-1 0.508 0.236 0.062 0.255 0.073 0.276 0.083 0.508 0.243 0.074 0.269 0.094 0.285 0.102 0.492 0.230 0.100 0.254 0.115 0.274 0.141

Pgm-2 0.286 0.237 0.404 0.262 0.466 0.277 0.502 0.331 0.247 0.364 0.272 0.432 0.291 0.474 0.224 0.227 0.467 0.256 0.538 0.272 0.468

Gd-1 0.322 0.233 0.346 0.258 0.403 0.277 0.454 0.405 0.246 0.263 0.270 0.304 0.284 0.344 0.492 0.232 0.106 0.254 0.127 0.273 0.132

Gd-2 0.489 0.234 0.116 0.260 0.131 0.276 0.147 0.434 0.244 0.218 0.272 0.270 0.289 0.300 0.481 0.227 0.120 0.255 0.155 0.270 0.163

lokus He Heq P Heq P Heq P He Heq P Heq P Heq P He Heq P Heq P Heq P

4.9.3 Populasyonlar arası genetik divergens

GDA populasyon hiyerarşi ağacı incelenen tüm populasyonların aynı hiyerarşik seviyede olduğunu belirlemiştir B. bombina populasyonlarında ortalama F_ST 0.045±0.017 (0.00–0.219) olarak düşük bir değerde belirlenmiştir. Tüm lokusların ortalamasında F_ST değerleri düşük seviyede bir farklılaşmayı gösteriyor olsa da Aat–2 (0.219), Pgm–2 (0.168)

ve Ada–2 (0.093) lokuslarında önemli derecede farklılaşmayı gösteren değerler elde edilmiştir. Populasyonların farklılaşma seviyeleri karşılıklı olarak hesaplandığında (Tablo 40) bazı önemli coğrafik sinyaller elde edilmiştir. Trakya Durusu ve Büyükdöllük populasyonları karşılıklı olarak çok düşük FST değeri (0.0217) gösterirken en yüksek genetik farklılaşma değeri Anadolu Döşemebataklığı ve Trakya Durusu populasyonları arasında elde edilmiştir.

(Tablo 40). Tüm karşılıklı F_ST değerleri Bonferroni düzeltme prosedürü sonrasında 0.05 nominal seviyede önemli bulunmuştur (p<0.05).

Tablo 40: B. bombina populasyonlarında, genetik farklılaşma (populasyonlar arası karşılıklı FST değerleri) ve genetik uzaklıklar (Nei, 1972)

Populasyon çifti FST Nei D

Döşemebataklığı/Durusu 0.0674* 0.0446

Döşemebataklığı/Büyükdöllü

k 0.0475* 0.0338

Büyükdöllük/Durusu 0.0217* 0.0225

* p< 0.05

Nei genetik uzaklık değerleri 0.0225–0.0446 arasındadır, en büyük değer Trakya Durusu ve Anadolu Döşemebataklığı örnekleri arasında belirlenmiştir. Trakya populasyonları arasında en düşük genetik uzaklık değeri (D=0.022) belirlenmiştir ve bu iki populasyon Nei genetik uzaklık verilerine dayanarak oluşturulan UPGMA fenogramda birlikte gruplanmıştır (Şekil 43). Anadolu B. bombina populasyonu açıkça Trakya populasyonlarından ayrılmıştır.

Şekil 43: B. bombina populasyonlarında, Nei (1972) genetik uzaklık verilerinden oluşturulan UPGMA fenogram, 1-Döşemebataklığı, 2-Durusu, 3-Büyükdöllük.