A formulação adequada dos meios de cultivo é pré-requisito para sucesso de fermentações. Os meios são desenvolvidos principalmente para maximizar o rendimento dos produtos e minimizar os custos. A escolha do meio interfere nos procedimentos de purificação e pré-tratamento, afetando o processo global.
O meio de cultivo deve prover quantidades suficientes de carbono, nitrogênio, minerais e outros nutrientes requeridos para render massa de célula e produtos.
Requerimentos nutricionais mínimos são estimados pela estequiometria de crescimento e formação de produtos. Em geral:
Fonte de C + Fonte de N + minerais + nutrientes específicos (hormônios, vitaminas) + O2 →
massa de célula + produto + CO2 + H2O.
A maioria dos nutrientes é fornecida a níveis acima das necessidades mínimas, no entanto, alguns nutrientes que são requeridos em quantidades ínfimas, portanto, não sendo necessária sua adição ao meio de cultura, pois estão presentes como “contaminantes” da água ou em outros componentes do meio, são os elementos traços. Além desses, outros componentes orgânicos são requeridos também em pequenas quantidades por alguns microrganismos, considerados substâncias essenciais, já que não são sintetizados dos nutrientes disponíveis, são os chamados fatores de crescimento e a necessidade para tais nutrientes é resultante de uma via metabólica estar bloqueada ou ausente na célula.
Dada a variedade de microrganismo, é difícil encontrar um meio universal que atenda às necessidades de todos os microrganismos, muitas vezes o que é requerido por um, inibe totalmente o crescimento de outros. Assim, para compor um meio adequado, é necessário conhecer algo a respeito do microrganismo. O desenvolvimento de meios sintéticos, com o intuito de verificar as verdadeiras exigências nutricionais dos microrganismos, vem sendo amplamente estudado, pois os meios complexos fornecem
numerosos e desconhecidos nutrientes, suportando um bom crescimento, porém não elucidando as exatas necessidades nutricionais.
Alguns estudos relacionados à composição de meios de cultivos foram desenvolvidos na tentativa de proporcionar maior esclarecimento a respeito das necessidades do microrganismo, tanto no sentido do crescimento celular como obtenção de produtos desejados são apresentados a seguir.
O efeito de alguns aminoácidos na produção de proteases por B. megaterium foi estudado por Chaloupka et al., 1966. Conforme os autores, proteases são formadas no meio de cultivo durante o crescimento em meio contendo sais e glicose, embora também tenham sido sintetizadas em meio livre de nitrogênio, onde não se verificava crescimento das células. A adição de aminoácidos individuais ou a mistura deles inibiu susbtancialmente a síntese de enzima, sendo que os aminoácidos que mais contribuíram para tal efeito foram treonina, isoleucina e valina, porém quando uma mistura de aminoácidos que individualmente não reprimia a síntese foi adicionada, ocorreu uma repressão muito maior que quando se utilizava treonina, indicando um efeito aditivo.
Neidhardt et al., 1974, desenvolveram um meio sintético mínimo para cultivo de enterobactérias. Esse meio, no qual os macronutrientes (fosfato, sulfato e nitrogênio) estavam presentes em quantidades suficientemente baixas para permitir seguimento isotópico, manteve o crescimento de E. coli e Salmonella typhimurium a taxas comparáveis com os meios sintéticos tradicionais que utilizavam altas concentrações de fosfato. Ambas as culturas cresceram em meio MPOS-glicose e foram inoculadas nesse mesmo meio, porém suplementado com diferentes nutrientes. O crescimento das bactérias foi monitorado e o ponto de desaceleração definiu a concentração mínima necessária do nutriente em estudo.
O crescimento de duas linhagens de Lactoccoccus lactis, uma de origem vegetal e outra de laticínio foi estudado por Cocaign-Bouquet e colaboradores, 1995. A formulação de um meio sintético foi realizada através da técnica da omissão simples de cada componente para determinar os verdadeiros requerimentos nutricionais (meio mínimo). Com relação às vitaminas, ácido nicotínico e pantotênico parecem ser igualmente requeridas por ambas as espécies, mostrando-se essenciais para o crescimento. No que diz respeito aos aminoácidos, a remoção de seis deles (ácido glutâmico, valina, metionina, leucina, isoleucina e histidina) impedia o crescimento de todas as espécies. As duas linhagens indicaram requerimento absoluto para magnésio, pois quando este nutriente foi omitido o crescimento parou rapidamente. Os autores verificaram que os aminoácidos fornecidos satisfazem o
requerimento de nitrogênio para a síntese de biomassa, pois quando sal de amônio, outra fonte de nitrogênio, foi removido do meio não provocou alteração no crescimento.
Neviani et al., 1995, investigaram a relação entre requerimento de aminoácidos e atividade peptidase em três linhagens de Streptococcus salivarius utilizando meio sintético sem componentes nitrogenados e meio composto de leite sem a fração de nitrogênio não protéico (leite RD). Cultivos sem adição de aminoácidos, cultivos suplementados com uma mistura de 18 deles e cultivos caracterizados pela omissão de aminoácidos individuais foram comparados entre si. As linhagens mostraram ser dependentes de aminoácidos em seus crescimentos e apresentaram diferentes requerimentos para esse nutriente. As diferenças mais óbvias foram em bactérias crescendo em meio livre de nitrogênio e menos evidentes em leite RD, onde provavelmente os microrganismos tenham usado as proteínas do leite como fonte de nitrogênio.
Trabalho realizado por Fisher, 1999, com Bacillus subtillis que tem uma relação estreita com Bacillus megaterium, reporta que três sistemas regulatórios de proteínas controlam a expressão de genes envolvidos no metabolismo de nitrogênio em resposta à disponibilidade de nutrientes. (a) CodY: reprime a expressão dos genes necessários ao metabolismo de compostos nitrogenados quando as células estão crescendo em meios contendo aminoácidos. (b) GlnR: reprime apenas células crescendo com excesso de nitrogênio e (c) TnrA: ativa ou reprime a transcrição apenas durante crescimento limitado por nitrogênio. GlnR e TnrA provavelmente direcionam as células no sentido de crescimento vegetativo adaptado, mais do que no sentido da esporulação, durante crescimento limitado de nitrogênio. A síntese de enzimas degradativas de aminoácidos geralmente não é regulada em esporos de Bacillus. Em esporos germinativos de B. megaterium mais de 50% de aminoácidos livres gerados por ação de proteases são degradados, produzindo 10-20 vezes a energia obtida pelo catabolismo do 3-fosfoglicerato, a maior fonte de energia em esporos dormentes.
Pinotti et al., 2000, alcançaram maior produtividade de PGA por B. megaterium em câmara rotativa, 138 UI/L, utilizando caseína hidrolisada enzimaticamente e soro de queijo. Nesse estudo, os autores também verificaram que a produção da enzima é dependente da presença de aminoácidos.
Rajendhran e colaboradores, 2002, estudaram otimização de um meio de cultivo contendo K2HPO4, MgSO4.7H2O, CaCl2.2H2O, triptona, extrato de levedura, sacarose
e indutor ácido fenil acético, AFA, para produção de PGA por Bacillus sp. A otimização foi desenvolvida em duas etapas. A primeira, para determinar o efeito de cada constituinte na produção da enzima e crescimento celular, a segunda para ajustar os níveis desses
constituintes de modo a obter maior rendimento na produção de PGA. K2HPO4, CaCl2.2H2O e
triptona apresentaram efeito significativamente positivo na concentração de PGA e biomassa, porém, MgSO4.7H2O exibiu um efeito negativo na produção da enzima. O meio otimizado
conduziu a um aumento de duas vezes na produção de PGA em comparação ao meio não otimizado.
Souza, 2003, verificou que a remoção individual de um aminoácido de uma mistura de 18, em meio de cultivo para produção de penicilina G acilase por Bacillus megaterium não provocou efeito algum no crescimento do microrganismo e nem na produção da enzima. Os aminoácidos serina, ácido aspártico, acido glutâmico, treonina, lisina, arginina e alanina eram preferencialmente consumidos pelo microrganismo.
A suplementação do meio de cultivo para Bacillus sp contendo K2HPO4 (1,0
g/L), MgSO4.7H2O (0,5 g/L), CaCl2.H2O (0,05 g/L) e AFA (1,5 g/L) com sacarose (20,0 g/L)
e triptona (3,0 g/L) atingiu máxima concentração de enzima, 10,1 UI.mL-1, produção duas vezes maior do que em meio basal. (Rajendhran, et al., 2003).
Yang e colaboradores, 2006, otimizaram a composição do meio de cultivo proposto por Pinotti, et al., 2000, omitindo grupos de aminoácidos. A maior produção de PGA foi alcançada com a omissão do grupo aromático, tirosina, fenilalanina e triptofano.
Pinotti et al., 2006, mostraram que glicerol e glicose reprimem a produção de PGA por B. megaterium. Foi concluído que AFA realmente atua como indutor na produção da enzima e o soro de queijo aumenta significantemente o crescimento do microrganismo e produção da PGA. Os resultados deste trabalho provaram que a substituição do hidrolisado de caseína por 10,0 g/L da solução de aminoácidos livres aumenta a atividade enzimática no meio em aproximadamente 150%. Verificou-se também um efeito inibitório quando a concentração da solução dos 18 aminoácidos é aumentada.
A utilização de amido na produção de PGA por Bacillus subtilis foi investigada por Zhang e colaboradores, 2006. A concentração de enzima aumentou significativamente quando o meio foi suplementado com amido parcialmente hidrolisado, alcançando 546 U/L, enquanto que o amido comum conduziu a 283 U/L.
Cultivos de Escherichia coli recombinante utilizando diferentes concentrações de soro de queijo (5,0-10,0 g/L) como única fonte de carbono foram realizados a diferentes concentrações de oxigênio dissolvido (3-15%). A maior concentração de enzimas, 901 UI/L foi atingida com a combinação de 5,0 g/L de soro de queijo e controle de oxigênio dissolvido em 3% da saturação (De León et al., 2006).
Alguns dos trabalhos acima descritos foram tomados como base para a produção de PGA por Bacillus megaterium realizada nesse estudo.