As linhagens de Bacillus megaterium foram conservadas como:
Células dormentes (endoesporos) mantidas a –70ºC em solução crioprotetora glicerol 20% v/v - “criotubos”;
Esporos armazenados em meio sólido a 4ºC e repicados mensalmente - “slants”;
Células vegetativas congeladas em ultrafreezer a –70ºC em glicerol 8% v/v – “eppendorfs”.
Os detalhes da preparação de cada estratégia de conservação foram descritas anteriormente no capítulo 3 – Materiais e Métodos. A avaliação da eficácia dos métodos de preservação do microrganismo baseou-se na manutenção da capacidade de expressão da enzima, ou seja, manutenção nos níveis de atividade enzimática.
Cada uma das formas de armazenamento foi também caracterizada com respeito à concentração de microrganismos nas formas vegetativas e esporos através da utilização do Método TCID50 descrito por Reed e Muench, 1938.
A concentração de esporos para criotubos armazenados a -70ºC em glicerol 20% v/v se mostrou significativamente superior à de células vegetativas, apresentando para cada mL de suspensão, 3,07x109 endósporos e 5,00x106 células vegetativas. Cada um dos ensaios partindo de criotubos realizados mensalmente foi inoculado com células crescidas por 12 horas a 30oC e 300 rpm, cuja concentração celular era da ordem de 1,53 ± 0,18 g/L.
Endoesporos de B. megaterium foram também armazenados em meio sólido, mantidos a 4ºC (“slant”). Para cada mL da suspensão de células conservadas em “slants”, a concentração de células dormentes e vegetativas estava em torno de 1,53x109 e 7,30x107, respectivamente. A concentração de células após incubação por 12 horas em meio de crescimento era em torno de 1,22 ± 0,27 g/L.
Outra forma de conservação do microrganismo estudada foi o armazenamento de células vegetativas, provenientes de cultivos em frascos agitados, em solução crioprotetora glicerol 8% v/v, congeladas a –70ºC (“eppendorfs”). O procedimento para contagem de bactérias mostrou a presença maciça de células vegetativas, 1,01x109 por mL de inóculo, cujo crescimento em meio padrão por 12 horas conduziu a uma concentração celular de 1,82 ± 0,23 g/L.
As Figuras 4.1 e 4.2 mostram, respectivamente, os valores das concentrações de células e enzima ao longo do tempo de armazenamento do microrganismo nas diferentes formas de preservação. Os acompanhamentos individuais para cada uma das estratégias de conservação de Bacillus megaterium estão apresentados no Anexo 2.
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 4,5 5,0 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 Cx (g/ L )
Tempo de Armazenamento (meses)
Criotubo Eppendorf Slant
Figura 4.1: Acompanhamento da concentração celular (Cx) de Bacillus megaterium ao longo do tempo de armazenamento, obtida após 24 horas de cultivo partindo de microrganismos nas diferentes formas de conservação.
0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 A E (UI/ L)
Tempo de Armazenamento (meses)
Criotubo Eppendorf Slant
Figura 4.2: Acompanhamento da atividade enzimática (AE) obtida após 24 horas de cultivo de Bacillus megaterium ao longo do tempo de armazenamento do microrganismo nas diferentes formas
de conservação.
A observação dos resultados mostra que o tempo de armazenamento da linhagem de B. megaterium armazenada como esporos em glicerol 20% v/v a -70ºC não interferiu na produção da enzima obtida em cultivos mensais, sendo a máxima variação para a atividade enzimática de apenas 5%, comparada ao valor inicial, 521 UI/L. Pode-se considerar que as concentrações de enzimas alcançadas nesses cultivos são praticamente constantes, já que ensaios em cinco replicatas mostraram uma variação de ± 20 UI/L frente a cada inóculo utilizado. Com respeito ao crescimento do microrganismo, todos os cultivos apresentaram concentrações celulares superiores a 3,25 g/L mostrando que células dormentes armazenadas em criotubos a –70ºC é uma forma adequada para preservação e conservação do microrganismo, confirmando resultados anteriores de Pinotti et al, 2007 (no prelo).
O crescimento celular nos cultivos com células dormentes conservadas em meio sólido a 4ºC, “slants”, alcançou o mesmo patamar que o apresentado nos cultivos com criotubos, com exceção do ensaio realizado com endoesporos armazenados há três meses, onde se verificou uma queda na concentração celular, 2,28 g/L. No entanto, essa desaceleração do crescimento do microrganismo não foi significante para a produção da enzima, já que se alcançou uma atividade enzimática de 602 UI/L, valor superior ao que se obteve quando a massa de células foi de 3,46 g/L, originando uma concentração de enzimas
de 578 UI/L, o que indica que essa menor concentração celular pode se dever a erro experimental. Quanto ao tempo de armazenamento, pode-se concluir que embora a concentração celular atingida após 24 horas de cultivo tenha se mostrado estável ao longo dos meses, ocorre sistemática e significativa atenuação na produção da enzima com o tempo, observando-se uma perda de mais de 63% da concentração inicial de enzima após sete meses de conservação da linhagem. Conservação do microrganismo como células dormentes em meio sólido (“slants”) não é, portanto, uma estratégia adequada para preservação da expressão de PGA pelo microrganismo.
A conservação do microrganismo como células vegetativas preservadas em glicerol 8% v/v a -70ºC conduziu a um aumento na produção da enzima quando comparado aos cultivos iniciais inoculados com endoesporos de B. megaterium conservados “slants e criotubos. Isso possivelmente se deve ao fato das células vegetativas já estarem adaptadas ao meio de cultura, num estado metabólico já favorável à expressão da enzima. Contudo, essa alta atividade só se manteve por cinco meses, sendo esse, portanto o tempo máximo para utilização de um mesmo lote de “eppendorfs”. A partir de seis meses de armazenamento observou-se significativa atenuação na produção da enzima, chegando após nove meses a 181 UI/L, quando a concentração de enzima obtida em cinco replicatas de cultivos iniciais era de 799 ± 45 UI/L, tal como apresentado na Tabela 2.1 do Anexo 2.
A estrutura dos esporos é completamente diferente das células vegetativas, apresentando uma morfologia e composição química que lhes conferem resistência às condições pouco propícias ao crescimento vegetativo e uma baixa atividade metabólica. Em condições favoráveis, um esporo desenvolve uma célula vegetativa, num processo chamado de germinação, que ocorre em três estágios.
O primeiro estágio, que é a ativação, usualmente requer algum agente traumático, tais como baixo pH ou calor. O segundo estágio, que é a germinação propriamente dita, requer água e um agente de germinação, como alanina ou certos íons inorgânicos. E, finalmente, o crescimento em meio com nutrientes adequados. A célula agora é uma célula vegetativa e sofre divisão binária (Black, 1966). Apenas nesse estágio é que o microrganismo está apto a acionar o seu mecanismo de síntese e expressão de enzimas, sendo, portanto, necessária, uma fase de adaptação às novas condições nutricionais. Contudo, a conservação das células na forma vegetativa (eppendorfs) torna dispensável a fase de germinação, pois estão armazenadas na presença dos mesmos nutrientes utilizados na fase de crescimento celular e produção da enzima, indicando uma possível razão para as variações nos níveis de atividade enzimática, obsevadas para os diferentes métodos de conservação. Além disso,
podem já conter alguma molécula sinalizadora necessária para a expressão da enzima que é secretada pela célula durante o estado de transição que antecede à esporulação. Conforme discutido em López e de La Torre, 2005, em experimentos realizados com Bacillus thuringiensis, houve indícios de que um fator solúvel secretado pela célula durante o estado de transição (no qual a célula expressa todas as funções disponíveis) bloqueia a esporulação.
Dentre as formas de preservação estudadas, somente células dormentes conservadas em criotubos a -70ºC na presença de solução crioprotetora glicerol 20% v/v mostrou considerável reprodutibilidade do inóculo e manutenção dos níveis de atividade enzimática após cinco meses.
A conservação como células vegetativas congeladas (eppendorff), conduziu a maiores valores de atividade enzimática no cultivo e se mantém estável por cinco meses. Assim, uma vez que as condições operacionais de produção da enzima já forem otimizadas, recomenda-se que se utilize conservação do microrganismo como células vegetativas congeladas, com renovação do estoque a cada cultivo e/ou com utilização de estoque até no máximo em três meses. Conservação como “slants” mostrou grande variabilidade não sendo confiável para estudo da influência de uma variável.
4.1.3. Cinética de Crescimento de B. megaterium para Microrganismos Conservados em