Piptadenia moniliformis Benth.
4.7.1 Fracionamento proteico com ácido tricloroacético (TCA)
O extrato bruto obtido de sementes de P.moniliformis foi submetido à precipitação com solução aquosa de TCA 10%. Alíquotas de 4 mL de extrato bruto foram precipitadas com solução aquosa de TCA 10%, em banho de gelo, para obter frações proteicas com concentração final de 0,5; 1; 1,5; 2; 2,5 e 3% de TCA. Decorridos 30 min da adição lenta de TCA em constante agitação, as frações proteicas foram centrifugadas a 12.000 x g por 30 minutos a 4 0C e os sobrenadantes obtidos dialisados contra água destilada e submetidos a ensaio de determinação de atividade quitinásica. Após essa primeira análise, a fração proteica obtida após adição de TCA na concentração final de 2% apresentou maior atividade específica para quitinase. Tendo em vista esse resultado, o restante do extrato bruto foi submetido ao mesmo tratamento e a fração proteica, denominada F 2, foi utilizada nas etapas subseqüentes pra a obtenção de PmFP.
4.7.2 Cromatografia de Troca Iônica em Matriz de DEAE-celulose
Uma alíquota do extrato bruto de P.moniliformis (30 mgP) foi aplicada em matriz de DEAE-celulose (14,0 cm x 2,7 cm), previamente equilibrada com tampão acetato de sódio 0,05 M, pH 5,2. A coluna foi percolada com o mesmo tampão de equilíbrio, até a completa remoção das frações proteicas não retidas. A eluição das proteínas retidas na matriz foi realizada com a adição sequencial de 0,2 M e 0,4 M de NaCl. a cromatografia foi realizada em um fluxo de 30 mL/h, sendo coletadas frações de 6,0 mL por tubo. Todo o procedimento foi monitorado através de leituras das absorbâncias em 280 nm, bem como através de ensaio de
atividade quitinásica e eletroforese. A fração que encerrou maior atividade específica para quitinase após ser reunida, foi dialisada exaustivamente contra água destilada e posteriormente, liofilizada.
4.7.3 Cromatografias de Afinidade em Matriz de Quitina
A matriz cromatográfica quitina foi utilizada do mesmo modo, em duas ocasiões, diferindo apenas da amostra utilizada. A amostra [D1 - Primeira fração não retida em matriz de DEAE-Celulose (11,4 mgP) ou A1 -primeira fração proteica não retida na matriz de “Affi- gel blue gel” (10 mgP)] foi ressuspendida em tampão acetato de sódio 0,05 M, pH 5,2 e aplicada à coluna de cromatografia de afinidade em matriz de quitina equilibrada com o mesmo tampão. A amostra permaneceu por meia hora em contato com a matriz, antes do início da retirada das proteínas não retidas. Posteriormente, a matriz foi percolada com esse mesmo tampão até a remoção das proteínas não adsorvidas na matriz. A retiradas das proteínas que interagiram com a matriz se deu por meio da aplicação de ácido acético 0,05 M e, após zerada a leitura a 280 nm, uma eluição adicional com tampão glicina 0,01 M, pH 9,0 foi realizada. As proteínas não retidas foram retiradas a um fluxo de 30 mL/h e as retidas a 45 ml/h. As frações foram coletadas em 3 ml (cromatografia utilizando amostra D1) e 1,5 ml (cromatografia utilizando amostra A1) por tubo. Todo o procedimento foi monitorado por leituras das absorbâncias a 280 nm. A cromatografia utilizando a amostra A1, foi acompanhada da realização de determinação de atividade quitinásica e de eletroforese.
4.7.4 Cromatografias de troca iônica em Matriz de CM-sepharose
A matriz de CM-Sepharose foi utilizada para a realização de três Cromatografias com uso de três amostras diferentes: amostra 1 (D1 - 31,35 mgP), amostra 2 (A1) e amostra 3 (F 2 – fração oriunda da precipitação encerrando 2% de TCA). A coluna foi equilibrada com tampão acetato de sódio 50 mM, pH 5,2 e uma amostra foi aplicada. A fração proteica não retida foi eluída com o tampão de percolação da coluna. As proteínas retidas foram eluídas
NaCl (amostra 1), 1 M de NaCl (amostra 2) e 0,25M de NaCl (amostra 3). A cromatografia seguiu em um fluxo de 30 mL/h. As frações foram coletadas em 6, 5 e 3 mL por tubo para as amostras 1,3 e 3 mL, respectivamente. Todo o procedimento foi monitorado por leituras das absorbâncias a 280 nm e acompanhada da realização de determinação de atividade quitinásica. As frações oriundas dessa cromatografia com a amostra 3 (F 2) foram exaustivamente dialisadas contra água e lofilizadas, bem como utilizadas para verificação do perfil por eletroforese.
4.7.5 Cromatografia de afinidade em Matriz de “Affi-gel blue gel”
A matriz de Affi-gel blue gel (12,5 cm x 1,7 cm) foi equilibrada com o tampão acetato de sódio 0,05 M, pH 5,2 e D1 - 1ª Fração proteica não retida na matriz de DEAE (3,33 mgP) foi ressuspendida no mesmo tampão de equilíbrio e aplicada a matriz. Após o contato de meia hora com a matriz, as frações proteicas não retidas foram eluídas com o tampão de percolação da coluna e a fração proteica retida foi eluída com a adição de 0,4 M de NaCl ao tampão de equilíbrio. Fluxo para a retiradas das proteínas não retidas foi de 20 mL/h e o fluxo para a saída das proteínas retidas foi de 30 ml/h. Foram coletadas frações de 3,0 mL por tubo. Todo o procedimento foi monitorado através de leituras das absorbâncias em 280 nm, bem como através de ensaio de atividade quitinásica e eletroforese. A fração que encerrou maior atividade específica para quitinase após ser reunida, foi dialisada exaustivamente contra água destilada e posteriormente, liofilizada.
4.7.6 Cromatografia de Troca iônica em Matriz de Resource Q Sistema de de FPLC (“Fast Protein Liquid Cromatography”)
A Cromatografia de troca iônica em matriz de Resource Q (6,4 mm x 30 mm) acoplada ao sistema de FPLC foi realizada com a aplicação de C1 (2 mgP) – Fração proteica não retida na matriz de CM-sepharose realizada com amostra 3 (F 2), após o equilíbrio dessa matriz com o tampão acetato de sódio 50 mM, pH 5,2. As proteínas não retidas foram eluídas com o tampão de percolação da coluna e as proteínas retidas foram eluídas com a adição de
0,1 M de NaCl ao tampão de equilíbrio. A cromatografia correu em um fluxo de 0,5 mL/min e as frações coletadas forma de 0,5 mL por tubo. Todo o procedimento foi monitorado através de leituras das absorbâncias em 280 nm, bem como através de ensaio de atividade quitinásica e eletroforese.
4.7.7 Eletroforese em Gel de Poliacrilamida
As frações obtidas de algumas cromatografias conforme descritas foram analisadas por eletroforese em gel de poliacrilamida, na presença de dodecil sulfato de sódio (SDS), seguindo a metodologia de Laemmli (1970), adaptadas para uso em placas. Foram utilizados géis de concentração com 3,5% e de separação de 12,5% de acrilamida. As amostras proteicas (3 µg) foram dissolvidas em tampão de amostra (Tris-HCl 0,0625 M, pH6,8 com SDS 2%, glicerol, azul de bromofenol e β-mercaptoetanol). As amostras foram aquecidas a 100 °C, durante 10 min, e centrifugadas a 10.000 x g, durante 5 min, a 4 °C. Em seguida, 25 µL de cada amostra foi aplicado em poços feitos em um gel vertical de 2 mm de espessura. As corridas foram conduzidas a uma corrente constante de 20 mA por placa, durante 1,5 h. as bandas proteicas foram visualizadas revelando-se o gel com nitrato de prata (BLUM; BEIER; GROSSA, 1987). Como padrão de massa molecular foram usadas miosina (212 kDa), -galactosidase (116 kDa), fosforilase B (97,4 kDa), albumina sérica bovina (66,2 kDa), albumina do ovo (45,0 kDa), anidrase carbônica (31,0 kDa), inibidor de tripsina da soja (21,4/ 19,7 kDa) e lisozima (14,2 kDa) (AMRESCO Inc., Ohio, EEUU) e α-lactoalbumina do leite bovino - 14,2 kDa, inibidor de tripsina da soja – 20,1 kDa, tripsinogênio do pâncreas bovino – 24,0 kDa, anidrase carbônica bovina 29,0 kDa, gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase de músculo de coelho 36,0 kDa, albumina do ovo – 45,0 kDa, albumina bovina – 66,0 kDa da Sigma-Aldrich Co. (St. Louis, EEUU).
4.8 Análise Estatística
análises, os dados foram mostrados como média de três determinações e os valores de desvio- padrão foram omitidos uma vez que mostraram valores inferiores a 5% da média.
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO