İnflamazom ve IL1 B Rolü

IL-1a ve IL-1b, IL-1R üzerinden etki gösteren steril inflamasyonun başlıca sitokinleridir (75) IL-1b, esas olarak makrofajlarca sentezlenerek nötrofil ve monosit birikiminde gerekli endotel hücre yüzey adezyon moleküllerinin ekspresyonunu ve başka proinflamatuvar aracıların üretimini artırır. (Şekil 3.11)

Şekil 3.11. IL1B Görevleri

IL-1b’nın ateroskleroz, gut ve tip 2 diyabet gibi çeşitli proinflamatuvar has- talıklarla da ilişkili olduğu bildirilmiştir. Gut hastalığında artmış IL-1b üretimi eklem inflamasyonu ve hasarına yol açar (76).Tip 2 diyabet hastalrının pankreas adacık hücrelerinde de artmış IL-1b üretimi gösterilmiştir (77). İnflamatuvar hücreler tarafından

IL-1b üretimi, inflamazom adı verilen ve temel görevi kaspaz-1’in aktivasyonu olan bir multiprotein kompleksi tarafından düzenlenir. İnflamazom kompleksi, sıklıkla NLR ailesinin üyelerinden bir PRR (Patern Tanıma Reseptörü), bir adaptör protein olan ASC [Apoptosis-Related Speck Like Protein Containing a CARD (Caspase Activation and Recruitment Domain)] ve kaspaz-1’in aktif formundan

meydana gelir (46, 91) İnflamazom kompleksinde yer alan proteinler temel olarak NLR (Mammalian Nucleotide-Binding Oligomerization Domain; NOD-like Receptor, NLR) protein ailesine aittirler .Ligandı ile bağlanan NLR oligomerize olur ve protein-bölge etkileşimleriyle ASC adaptör proteinine bağlanır. ASC ise CARD bölgesiyle pro-kaspaz-1’i biyolojik olarak aktif kaspaz-1’e dönüştürür. Aktif kaspaz- 1 ise IL-1b, IL-18 ve IL-33 sitokinlerinin öncül formlarını proteolitik olarak keser ve matür formlarına dönüştürür. IL-1b ve IL-33 steril inflamasyonla ilişkilendirilmişse de IL-18’in steril inflamasyondaki rolü tam olarak açıklanamamıştır. IL’den daha çok IL1 B AAA hastalığı ile ilişkilidir.

Şekil 3.12. NLRP3 ve IL1-b etkileşimi

İnflamazom kompleksleri, bulundurdukları PRR (Patern Tanıma Reseptörü) yapısına göre adlandırılır ve işlev görürler. Dört farklı sınıf altında 20’den fazla NLR gösterilmiş olsa da halen tanımlanmış dört farklı inflamazom kompleksi bulunmaktadır (78)

• NLRP1 (NOD-, LRR- ve Pyrin Domain-Containing 1) inflamazom • NLRP3 (NOD-, LRR- ve Pyrin Domain-Containing 3) inflamazom • NLRC4 (NOD-, LRR- ve CARD Domain-Containing 4) inflamazom • AIM2 (Absent in melanoma 2) inflamazom.

Şekil 3.13. Nlr İnflamasomları

İnflamazom komplekslerinden yalnızca AIM2 ve NLRP3 inflamazomunun mikrobiyal olmayan molekülleri tanıyabildikleri gösterilmiştir. AIM2 inflamazomun mikrobiyal kökenli olmayan çift zincirli DNA (dsDNA)’yı tanıyarak kaspaz-1 aktivasyonu ve IL-1b sekresyonunu sağladığı bildirilmiştir (79). AIM2 inflamazomunda steril inflamasyonda, özellikle de hastaların periferik dolaşım- larında yüksek düzeylerde dsDNA tespit edilmiş SLE gibi otoimmün hastalıklarda rolü olduğu düşünülmüştür (80).

IL-1b üretiminin steril inflamasyonla ilişkisi hakkında bilgilerimizin çoğu NLRP3 inflamazomuyla yapılan çalışmalardan elde edilmiştir. İlk olarak çeşitli otoinflamatuvar hastalıklardaki kronik inflamasyonla ilişkisi gösterilmiş NLRP3’ün steril inflamatuvar hastalıklarda da önemli olduğu bildirilmiştir (81). NLRP3 aracılı IL-1b üretimi iki farklı sinyale ihtiyaç duyar. İnfeksiyon varlığında bu NF-kB aracılı transkripsiyonel artışla olur bu da, lipopolisakarit (LPS) gibi TLR veya NOD2 ago- nistleriyle sağlanır. steril inflamatuvar koşullarda ise TNF ve IL-1’in veya TLR’lere bağlanabilen LDL’nin bu ilk sinyali sağlayabildiği gösterilmiştir (82). NLRP3 inflamazomun aktivasyonu, ve sonrasında kaspaz-1 aktivasyonu ve pro-IL-1b kesimi için gerekli ikinci sinyal ise NLRP3’ü özgül olarak aktive edebilen uyaranlar tarafın- dan sağlanır. NLRP ve AİM2 inflamazomlarında ASC; N terminal PYRİN ve C terminal CARD bölgesi aracılığı ile stres duyarlı komponent (NLR) ile prokaspaz arasında adaptör molekül görevi yapar. NLRP-3 inflamazomunda ASC, N terminal PYRİN-PYRİN etkileşimi ile NALP-3 e C terminal CARD-CARD etkileşimi ile prokaspaza bağlanır (şekil3.12) (83).Kompleks içinde ikinci prokaspaz 1 molekülüne Cardinal eklenir ve proteolitik aktivasyon sonucu aktif katalitik domainler olan p20 ve p10 salınır. Aktif kaspaz -1, pro IL1 parçalayarak IL-1 oluşumuna neden

olur.ASC;PYRİN Domaini aracılığı ile pyrin etkileşimi düşünüldüğünde, NLRP2/3 veya AIM2 İnflamazomunda ya modülatör ya da kendisi bizzat inflamazomun bileşeni olarak rol almaktadır. WT (Wild type) pyrinin B30.2 bölgesi, aktif kaspaz-1 alt birimleri olan p20 ve p10 ile etkileşime girerek, aktifp20/p10 heterodimer oluşumunu önler .AAA ile ilşkili mutant pyrinin B30.2 bölgesinin p20 ve p10 İle etkileşimi WT pyrinden daha azdır ve böylece p20 ve p10 heterodimeri oluşarak pyrini Bzıp ile B-box finger domain ortasındaki Asp 330 bölgesinden ikiye parçalar. Oluşan N terminal pyrin parçası, NF-KB aktivitesini 2 yolla arttırır; ya p65 NF- KB’nin nükleusa girişini artırarak ya da IkB-a nın yıkılımını artırarak artan NF-KB aktivitesi de inflamuar sitokin salımını artırır.

Şekil 3.14. Pyrin Proteininin İnflamasyondaki Rolü (83)

AAA patogenezinde temel rolü oynayan MEFV gen ürünü olan Pyrin, anlatılan mekanizmalar sayesinde önemli bir inflamauar sitokin olan interlökin (IL)-1B aktivasyonunu düzenler ve nükleer faktör kB (NFkB) aktivasyonunu ve apoptozu inhibe eder. Proinflamatuar sitokin IL.1B, AAA hastalığının patogenezinde merkezi konum alır. IL-1 AAA ya yönelik son yıllardaki çalışmalarda ve dirençli hastaların tedavi modelitelerinin araştırılmasında da önemli bir yer tutmaktadır. Daha önce de belirtildiği gibi bu sitokin inaktif bir prekursor tarafından eksprese edilir, kaspaz-1 tarafından bölünerek aktif IL-1B ya dönüşür. Kaspaz-1’in kendisi önce inflammasom kompleksi ile etkileşime girerek aktive edilmeye gereksinim duyar. Kaspaz-1 ve IL-

1b’in aktivasyonuna katılan esas inflammasome kompleksleri cryopyrin veya NALP3 inflammasomlarıdır (84, 85).

Pyrinin IL.1B aktivasyonunda 2 hipotez önerilmiştir (şekil:3.13)

1.Sekestrasyon hipotezine göre AAA mutasyonları pyrinin inhibisyon reaksiyonları ile etkileşmektedir ve IL.1B aktivasyonunun regulasyonunun düzenlenmesinde azalma ile sonuçlanmaktadır (59).

2.Hipotez Yu ve arkadaşları (72) tarafından önerilmiş olup

pyrinnin IL.1B aktivasyonu için kendi spesifik inflammasomunu oluşturduğu şeklindedir.

Şekil 3.15. Sekestrasyon ve inflamasom hipotezi

AAA mutasyonları varsayılan pyrin inflammasomlarının sensitivelerini artıracaktır. Pyrin’in IL.1B’nın regulasyonundaki rolü dışında NFkB veya apoptozis üzerinde de inhibisyondan stimulasyona kadar değişen etkisi olduğuna dair çelişkili bulgular vardır (84) İnsan monositde yapılan deneysel çalışmalarda pirin fonksiyonunun baskılanması sonucu bazılarında IL-1B sekresyonu artmış (59, 74) bazılarında ise baskılanmıştır (86, 87). Pirinin antiinflamatuar bir protein mi

proinflamauar bir protein mi olduğu mutasyonların pirin proteininde fonksiyon kaybına mı yeni fonksiyon kazanımına mı yol açtığı tam netleşmiş değildir (83).

AAA ilişkili mutasyonların çoğunun pyrinin C terminal B30.2 bölgesinde olduğu düşünüldüğünde bu bölge aracılığı ile kaspaz-1 inhibisyonu AAA patogenezinin moleküler düzeyde açıklanmasında önemli olduğu düşünülmüştür. Üç majör AAA mutasyonundan (M694V, M680I V726A) biri ile birlikte olan pirinin yine kaspaz -1 e bağlanacağı ama etkileşimlerinin WT ‘e göre daha düşük düzeyde olacağı bildirilmiştir (59). Pirinin ve kaspaz-1 in kristal yapısı düşünüldüğünde M694V ve M680I mutasyonlarının, bu ara bağlanma yüzeyinde olduğu görülmüştür. Sonuçta mutant prin ile kaspaz-1 arasındaki etkileşimin azalması pirinin IL-1B sekresyonu üzerindeki inhibitör etkisini azaltır. Bu veriler pyrinin IL-1B üzerindeki inhibitör etkisini göstermekte ve AAA nın patogenezinde kontrolsüz kaspaz-1 aktivasyonu ve IL1B sekresyonunu olduğunu göstermektedir.

2. Pyrinle ilişkili protein “Proline serine threonine phosphatase interacting protein 1 (PSTPIP1)”

PSTPIP1, pyrinin yoğun olarak eksprese olduğu monositler ve nötrofillerde eksprese olmaktadır. PSTPIP1 ayrıca akciğer, dalak, timus ve ince bağırsak gibi pyrinin eksprese olmadığı dokularda da eksprese olmaktadır.Bu protein 416 aminoasitten oluşur ve FCH (Fes/CIP4 homology domain), SH3 (Src homology 3

domain) olarak isimlendirilen iki önemli domain içermektedir (88).PSTPIP1’in

normalden fazla eksprese olduğu durumlarda, hücrelerde filopodya oluşumu indüklenmekte, bu da PSTPIP1’in hücre iskeleti yapılanmasında görevi olabileceğini düşündürmüştür. PSTPIP1’in SH3 bölgesinden, aktin bağımlı mekanizmanın iki proteini olan WASp ve c-abl’ye bağlandığının biliniyor oluşu, aktin-PSTPIP1 ilişkisinin bu proteinler üzerinden olabileceğini işaret etmektedir (70). PSTPIP1’i kodlayan gende meydana gelen mutasyonlar PAPA (pyogenic arthritis with pyoderma gangrenosum and acne) sendromuna sebep olmaktadırPAPA sendromu, otozomal dominant geçiş gösteren ve bazı klinik özellikleri açısından AAA’ya benzeyen bir otoinflamatuvar hastalıktır. PAPA sendromu olan kişilerde, AAA’da olduğu gibi, eklemlerde nötrofilden zengin efüzyonlar gelişmektedir (68). PAPA sendromuna sebep olan mutasyonların, uygun inflamatuvar cevap için gerekli olan fizyolojik sinyal iletimini bozduğu hipotezi öne sürülmektedir. Bu nedenle PAPA

sendromu da otoinflamatuvar bir hastalık olarak görülmektedir. PAPA sendromunda majör inflamasyon deri ve eklemlerde görülürken, AAA hastalığında inflamasyon karın, göğüs, eklemve deride görülmektedir. Bu ortak fenotip, PSTPIP1 ve pyrinin, önemli bir inflamatuvar yolda birlikte çalışabileceğini ve PSTPIP1’e bağlı biyokimyasal yolların AAA ile ortak olabileceğini düşündürmektedir (70). Pyrin- PSTPIP interaksiyonu; hücre iskeleti, inflamasyon ve hastalıklar arasındaki bağlantıya işaret etmektedir.

3. Pyrinle ilişkili protein Şiva:

Siva ilk olarak maya-2-hibrid sistemi ile CD27 proteinine bağlanan protein olarak tanımlanmıştır (89). Siva geni 6490 nükleotid içermekte ve iki farklı transkripsiyon ürününü kodlamaktadır. Siva 1 proteini, 175 aminoasit; alternatif “splicing” sonucu, “death domain homology region” bölgesinin büyük bir kısmının eksik olduğu Siva 2 proteini 110 aminoasit uzunluğundadır (90). Siva primer olarak lenfositlerde ve timus, prostat, testis, yumurtalıklar, ince bağırsakta (89) Ayrıca, monosit ve nötrofillerde eksprese olmaktadır. Siva 1 ve Siva 2 proteinleri ile ilgili yapılan çalışmalarda, her iki proteinin de proapopitotik özellikleri ortaya konmuştur. Siva 1 ve Siva 2’nin, pyrinin yoğun olarak eksprese olduğu hücrelerde eksprese olduğu gösterilmiş, bu da proteinlerin birbirlerine bağlanmaları ve bu hücrelerde birlikte görev almalarını destekleyici bir sonuç olmuştur. Protein-protein etkileşimlerinin gösterilmesinde yaygın olarak kullanılan bir yöntem olan immün presipitasyon deneyleri ile bu ilişki konfirme edilerek, Siva geni üzerinde birinci ekzonun ve MEFV geninde 10. ekzonun kodladığı bölgelerin bu interaksiyon açısından önemli olduğu gösterilmiştir. Pyrin ile ilişkili diğer proteinler de düşünüldüğünde, MEFV geninin 10. ekzonu ilk defa bu çalışma ile protein-protein etkileşimleri açısından önemli bir bölge olarak tanımlanmıştır. Bu sonuç; pyrin ve sivanın AAA patogenezinde önemli bir rolü olabileceğine işaret etmektedir. Sivanın proapopitotik bir protein olarak tanımlanması ve pyrinin yine apopitozda rol alan ASC ile interaksiyona giriyor olması nedeniyle, Pyrin-Siva ilişkisinin, hücrede apopitoz mekanizması üzerinde bir etkisi olduğu düşündürmektedir.