B. İdari Yargıda Görülmekte Olan Dava
2. İdari Yargılama Usulü Kanunu (İYUK) Madde 10 Başvurusu
SILVESTRES IMUNOENZIMÁTICOS CONJUGADOS
Bugio-preto (Alouatta caraya) e Macaco
Prego (Cebus apella) Anti IgG de primatas não humanos produzido em coelho
Cateto (Pecari tajacu) e Queixada
(Tayassu pecari) Anti IgG de suíno doméstico (Sigma Aldrich®)
Cotia (Dasyprocta aguti) Anti IgG de cotia produzido em coelho
Gambá (Didelphis albiventus) Anti IgG de gambá produzido em
coelho Gato-mourisco (Herpailurus
yaguarondi)
Anti IgG de gato domestico produzido em coelho
Rato doméstico (Rattus spp.) Anti IgG de rato (Sigma Aldrich®)
Teiú (Tupinambis merianae) Anti IgY de teiú produzido em coelho
Tatu-galinha (Dasypus novemcinctus) Anti IgG de tatu-galinha produzido em
coelho
3.6.1 -Purificação de anticorpos de animais silvestres
Realizou-se teste sorológico (ELISA direto) para verificação da reatividade nas diferentes espécies avaliadas, utilizando a proteína A conjugada à peroxidase (Sigma Aldrich®) em que apresenta reatividade com diferentes subclasses de imunoglobulinas. Este teste foi realizado utilizando-se soros das diferentes espécies de animais silvestres
31 nas diluições 1:50, 1:100 e 1:200. Os resultados de reatividade estão representados no Quadro 3.
Quadro 3- ELISA direto para verificação de afinidade com emprego de Proteína A peroxidase em amostras de animais silvestres provenientes do Centro de Conservação da Fauna Silvestre de Ilha Solteira/SP.
*Reatividade: reativo (DO ≥ 1,0), Moderadamente reativo (DO ≥ 0,5), Fracamente reativo (DO ≥ 0,1) e Não reativo (DO < 0,1).
Baseados nos resultados representados no Quadro 3, foram purificados soros das diferentes espécies (Quadro 2) utilizando-se o sistema de purificação em coluna de cromatografia por afinidade a proteína A (HiTrap Protein A HP- GE Healthcare®), exceto para a espécie teiú (T. merianae) em que utilizou-se coluna de cromatografia por afinidade a proteína Y (HiTrap™ IgY Purification HP – GE Helthcare®). As condições de purificações das amostras de soros foram de acordo como as recomendações do fabricante. Para verificação do grau de pureza das frações eluídas foi realizado SDS- PAGE (67) e as frações de interesse foram misturadas e dosadas pelo método BCA (68).
3.6.2- Soro hiperimune de coelhos anti IgG de animais silvestres
Após a purificação de anticorpos das diferentes espécies silvestres, conforme
ANIMAIS SILVESTRES Proteína A*
Rato doméstico (Rattus spp.) Não reativo Gambá (Didelphis albiventris) Moderadamente reativo
Cotia (Dasyprocta aguti) Reativo
Teiú (Tupinambis merianae) Não reativo Tatu-galinha (Dasypus novemcinctus) Reativo Bugio Preto (Alouatta caraya) Reativo
Macaco Prego (Cebus apella) Reativo
Gato Mourisco (Herpailurus yaguarondi) Reativo
Cateto (Pecari tajacu) Reativo
32 descrito anteriormente, utilizou-se um coelho para cada IgG ou IgY purificada em um total de cinco animais imunizados contra as espécies silvestres avaliadas.
Cada coelho utilizado recebeu pelas vias subcutânea ou intramuscular (alternado) doses semanais de IgG purificadas, na concentração de 1 mg/mL em que a proporção IgG purificada + adjuvante foi de 1:1 perfazendo um volume final de 2mL para cada imunização durante 5 semanas consecutivas, utilizando-se Adjuvante de
Freund Completo (AFC) na primeira dose e Adjuvante de Freund Incompleto (AFI)
nas imunizações posteriores.
Em um período de dez dias após a última imunização, foi realizado teste sorológico (ELISA direto) em que empregou-se IgGs e IgY purificadas contra os soros de coelhos para verificar a resposta imune frente as imunoglobulinas das diferentes espécies silvestres.
Após confirmação da reatividade dos animais imunizados, os mesmos foram anestesiados com Zoletil 50(Virbac® - 20 mg/Kg), via intramuscular e realizou-se coleta de sangue total (sangria) por meio de punção cardíaca. Os soros destes animais foram purificados através de cromatografia por afinidade a proteína A (HiTrap Protein A HP- GE Healthcare®), seguindo-se as recomendações do fabricante e a avaliação da pureza das frações coletadas, através do SDS-PAGE (67). As frações de interesse foram misturadas e realizou-se dosagem de proteína pelo método BCA (68).
3.6.3- Reação imunoenzimática para preparo de conjugado
O conjugado constitui-se de IgG de coelhos contra os anticorpos de diferentes espécies silvestres (descrito acima) conjugada com a peroxidase, de acordo com o método descrito por Wilson & Nakane (69)adaptado.
33 purificados. Para tanto, utilizou-se 3 mL de cada purificado para serem concentrados por meio de diálise contra polietilenoglicol (PEG) 6000 em membrana de celulose (Sigma Aldrich®). Posteriormente, foi realizada uma segunda diálise com Tampão Carbonato Bicarbonato (TCB) 0,05 M pH 9,6 por 12 horas a 4º C. As amostras foram submetidas a leitura em espectrofotômetro (Ultrospec® 2000 – Pharmacia Biotech) a 280 nm antes e depois do tratamento para avaliar a concentração final das IgGs. Utilizou-se para a conjugação com a peroxidase, aproximadamente 2 mL de IgG sob estas condições descritas acima em uma concentração final de 10 mg/mL.
Na segunda etapa, a peroxidase (tipo VI- Sigma Aldrich®) foi dissolvida sob agitação em um período de 3 minutos nas seguintes condições: 10 mg de peroxidase em 2,5 mL de água ultrapura. Para promover a oxidação da enzima foi adicionada a esta solução 0,5 mL de metaperiodato de sódio 0,01 M sob agitação por 30 minutos a temperatura ambiente; posteriormente, esta solução foi submetida à coluna de cromatografia Sephadex G25 (Pharmacia Biotech) com TCB 0,05M pH 9,6 para alcalinizar a solução e filtrar a peroxidase oxidada.
As amostras de IgGs sob as condições descritas acima, foram adicionadas a um frasco e, sob agitação, a peroxidase oxidada foi adicionada vagarosamente. Esta solução permaneceu sob agitação a temperatura ambiente durante 2 horas. A seguir, foi adicionado 0,125 mL de boroidreto de sódio 0,105 M, permanecendo-se sob agitação por 2 horas a 4º C . Posteriormente, as amostras foram dialisadas contra PBS 0,01 M de fosfatos 0,14 M de NaCl pH 7,4 . Nesta etapa foi realizado o teste de ELISA direto com emprego desses imunorreagentes contra IgGs purificadas das espécies silvestres para verificação da reatividade.
Para exclusão de moléculas de peroxidase livres, esses foram submetidos à cromatografia de gel filtração em coluna de Sephadex G-100 (1,8 x 67 cm) equilibrada
34 com PBS 0,01 M de fosfatos 0,14 M de NaCl pH 7,4 com auxílio de bomba peristáltica sob fluxo contínuo de 1 mL/minuto. As frações foram eluídas com emprego do mesmo tampão. A proteína total foi detectada pela leitura em espectrofotometria a partir das avaliações das absorbâncias de 280 nm e 480 nm. Amostras que continham Densidade Óptica (DO) superior a 0,4 foram recolhidas e misturadas. Posteriormente foram concentradas por meio de diálise contra PEG e adicionou-se glicerol tamponado com fosfatos pH 7,4 em uma proporção 1 : 1, armazenando-se a -20º C.
3.6.4- Determinação de diluição ótima dos conjugados produzidos
Para determinação da concentração ótima dos conjugados em ensaios imunoenzimáticos foi realizado teste de ELISA direto. Para tanto, utilizou-se as concentrações de 10 a 0,156 µg/mL de IgG e IgY purificadas dos animais silvestres, bem como dos conjugados produzidos, de 1:250 a 1:8000. A diluição do conjugado capaz de apresentar reatividade máxima, sem contudo, desencadear o desenvolvimento de “ruídos” nas reações, foi considerada como diluição ótima para testes posteriores.
3.7- Pesquisa de anticorpos contra anti-Leishmania infantum e anti-Trypanosoma cruzi
3.7.1- Soros controles
Para verificação da reatividade da proteína rK39 foi realizado ELISA indireto em 100 amostras de soros de cães para LVC nos seguintes grupos: animais negativos (n=40), positivos assintomáticos (n=31) e positivos sintomáticos (n=29) determinados anteriormente pelas técnicas de ELISA indireto com emprego de antígeno bruto e pela RIFI , provenientes do município de Ilha Solteira/SP (Apêndices – Tabela 1, 2 e 3).
35 pacientes humanos reagentes (n=22) e não reagentes (n=22) através do método de quimioluminescente-ELISA (CL-ELISA- item Apêndices Tabela 4 e 5) de acordo com o preconizado por Marchi et al. (36). Estes soros humanos foram provenientes do Hemocentro da Faculdade de Medicina de Botucatu (FMB/UNESP).
Para as amostras controles os conjugados empregados utilizados foram: anti IgG de cão e anti IgG de humano, comercialmente disponível (Sigma Aldrich®). A determinação ótima de diluição destes foi similar ao descrito no item 3.6.4; porém, para o anti-IgG humano foram testadas diluições maiores, variando de 1:1000 a 1:128000. Para determinação da diluição dos soros foram testadas as seguintes diluições: 1:50, 1:100 e 1:200.
3.7.2- Determinação da concentração ótima das proteínas recombinantes rK39, CRA e FRA
A determinação da diluição ótima dos antígenos recombinantes foi através do ensaio imunoenzimático indireto testando-se as seguintes concentrações: 5ng, 10ng, 25ng, 50ng e 100ng/poço em amostras de soros controles. A concentração determinada como ótima foi posteriormente empregada para as diferentes espécies de animais silvestres.
3.7.3- Soros de animais silvestres e reatividade com proteína A
Concomitantemente com os testes descritos no item 3.7.2 e baseado nos resultados obtidos para animais silvestres, descritos no item 3.6.1 de reatividade permitiu-se realizar testes sorológicos empregando-se a proteína A conjugada com os grupos de animais que representaram reatividade. Os dados obtidos foram comparados com os resultados realizados na presente pesquisa para proteína recombinante rK39 com o uso de conjugados espécie-específicos produzidos.
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3.7.4- ELISA indireto
Os ensaios foram realizados separadamente para cada uma das enfermidades pesquisadas, baseados em testes realizados anteriormente, conforme descrito a seguir:
Os antígenos foram diluídos em Tampão Carbonato-Bicarbonato (TCB ; pH 9,6 - 100 µL/poço) e incubados “overnigth” em placa Maxisorp (Nunc®). Posteriormente, lavados cinco vezes com 0,05% de Tween 20 em solução tampão de PBS (PBS-T ; pH 7,4). Os poços foram bloqueados (300 µL/poço) com leite em pó desnatado (LPD) a 10% diluído em TCB. Na etapa seguinte, foi adicionado soros testes em concentrações determinadas anteriormente, diluídos em PBS-T contendo 10% de LPD. Posteriormente, foi adicionado o conjugados (proteína A e/ou espécie-específico) e após o período de incubação foi adicionado o substrato: Tampão Citrato-Acetato pH 9,6; H2O2 a 30% e o cromógeno TMB (3,3´,5,5´-Tetramethylbenzedine, Sigma Aldrich®)
diluído na concentração de 10 mg/mL em DMSO (Dimetil Sufóxido, Sigma Aldrich®). Para cada etapa do ensaio o período de incubação foi de uma hora a 37ºC e em todas essas passagens os poços eram lavados cinco vezes com 0,05% de Tween 20 solução tampão de PBS (PBS-T ; pH 7,4) em lavadora automática de ELISA Elx50, Bio-Tek (Intruments, Inc, Winooski, Vermont). A densidade óptica (DO) foi medida em 450 nm, utilizando-se o leitor, modelo automático Multiscan Ex Labsystems (Flow laboratories International AS). Os testes foram realizados em duplicatas, acrescentando-se controles negativos e positivos para estas enfermidades pesquisadas. Para controle das reações com uso de antígenos recombinantes foram realizados testes sob as mesmas condições em ausência de antígeno e valores de DO obtidos foram descontados no valor final da reação imunoenzimática.
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3.7.5- Interpretação dos resultados das amostras controles
Os valores de DO obtidos nos imunoensaios foram classificados em níveis de ELISA (NE), os quais variavam de 0 (zero) a 9 (nove). O limite máximo do nível zero, determinado pela média das DO dos animais negativos para estas enfermidades pesquisadas, foi acrescido de dois desvios padrão. A partir desse limite, os intervalos entre os outros níveis de ELISA foram definidos por acréscimo de 35%, e o ponto de corte correspondeu a duas vezes e meia o valor das DO dos soros de referência negativos, conforme preconizado por Voller et al.(70).
Os níveis de anticorpos de cada soro testado foram calculados mediante a determinação do valor A/P (amostra teste em relação ao controle positivo), considerando-se os soros de referência negativos e positivos de acordo com a seguinte equação preconizada por Machado et. al.(71), conforme ilustrado abaixo.
Para as proteínas CRA e FRA de T. cruzi foi considerado soro (teste) reagente para as amostras em que observou-se reatividade para pelo menos uma das proteínas avaliadas. Este critério foi estabelecido também para amostras de animais silvestres.
3.7.6- Interpretação dos resultados das amostras de animais silvestres
38 1) avaliadas nesta pesquisa, para os testes sorológicos os animais silvestres foram avaliados a partir dos títulos de anticorpos obtidos por espécie silvestre em que foram estabelecidos dois pontos de cortes (Figura 4). De acordo com os valores de DO obtidos foram classificados em animais não reagentes, inconclusivos e reagentes para as proteínas recombinantes e conjugados espécies-específicos. Os dados também foram comparados com os testes obtidos ao empregar-se a proteína A conjugada para a proteína rK39 somente.
Figura 4- Esquema ELISA indireto com conjugados espécie-específicos em que serão avaliados separadamente para os grupos de espécies de animais silvestres (10 espécies diferentes) a partir dos valores de DO obtidos. Estabeleceu-se dois pontos de corte para classificar as amostras como não reagentes, inconclusivas e reagentes contra as proteínas recombinantes rK39, CRA e FRA.
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4- RESULTADOS
4.1- Análise molecular
4.1.1- PCR
Dos 103 animais silvestres (Quadro 1), quatro (3,88%), em que foram isolados protozoários flagelados em meio LIT, representados pelas seguintes espécies de vida livre (Quadro 1): cotia (D. aguti, 6,25%); gambá (D. albiventris, 5,88%) e tatu-galinha (D. novemcinctus, 9,09%), houve amplificação de fragmentos de produtos de aproximadamente 585 pares de base (pb) a partir do meio de cultivo (Figura 5).
Em contrapartida, observou-se poucos parasitas em cultivo de amostra de sangue de bugio-preto (A. caraya, 12,5%) de cativeiro e não obteve-se êxito na amplificação de fragmentos pela PCR. Nesta espécie foi amplificado um produto de aproximadamente 650 pb a partir do sangue total.
Figura 5- Eletroforese em gel de agarose (2%) de produtos purificados a partir de PCR-ITS1. Em 1 marcador de peso molecular (100 pb); 2, 3 e 4 animais: gambá (D. albiventris) cotia (D.
aguti) e tatu-galinha (D. novemcinctus), respectivamente. Os demais, controles: 6 (L. infantum
de Cerdocyon thous do CCFS-Ilha Solteira), 6 (L. infantum), 7 (L. major) e 8 (cepa Y de T. cruzi).
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4.1.2- Sequenciamento
As sequências obtidas através da clonagem em vetor foram comparadas com o banco de dados BLAST, havendo 97% de similaridade com Trypanosoma cruzi para gambá e cotia (acesso número: AF362825.1); em tatu-galinha (acesso número: GQ258720.1), foi encontrada similaridade de 98%. Entretanto, para o produto amplificado e sequenciado de sangue do bugio-preto houve 90% de similaridade com
Trypanosoma minasense (acesso número: AB362411.1). Esses dados foram publicados
em artigo científico, disponível no Anexo 8.
4.2- Análise sorológica (Imunorreagentes - Proteínas recombinantes)
4.2.1- Proteínas CRA e FRA (Trypanosoma cruzi)
Para as proteínas CRA e FRA foram utilizadas como estratégia de otimização pela GenScript apenas o acréscimo da poli-histidina (6x histidina). O peso das proteínas CRA e FRA expressas é de aproximadamente 41,5 KDa e 85,6 KDa (Figura 6).
Para estas foram determinadas as seguintes condições de expressão: 0,5mM (CRA) e 1 mM (FRA) de IPTG a 30ºC por 16 horas. Para a proteína CRA por um período de 2 horas sugeriu ser suficiente para expressão da mesma, mas pelos resultados obtidos após a purificação, em análises posteriores, optou-se por manter sob incubação de 16 horas a 30º para ambas as proteínas em que os resultados demonstraram-se satisfatórios em termos de eficiência de produção na expressão protéica. Através da análise pela SDS-PAGE foi verificado que CRA e FRA estavam presentes na fração solúvel do lisado bacteriano.
41 Figura 6- Gel de SDS-PAGE corado com Comassie blue. Em A: 1 marcador de peso (KDa); 2, 3, 4, 5 e 6 frações coletadas na eluição da proteína CRA na etapa de purificação com banda desejável de aproximadamente 41,5 KDa (em vermelho). Em B: 1 marcador de peso (KDa), 2 e 3 fração solúvel bactérias; 4 frações purificadas da proteína FRA com destaque (em vermelho) de banda de tamanho esperado de aproximadamente 85,6 kDa.
Posteriormente, as proteínas purificadas e dialisadas foram testadas pela técnica de Western Blot, mas não se obteve êxito. Pela técnica de Dot Blot foi realizado um pool de amostras controles positivas e em associação (CRA + FRA) na membrana de nitrocelulose, e verificou-se reatividade. As mesmas foram testadas isoladamente e uma única amostra controle selecionada aleatoriamente e sabidamente positiva e verificou pouca reatividade (Figura 7). Em amostras controles negativas sob estas condições, não houve alteração do padrão de cor da membrana de nitrocelulose.
42 Figura 7- Foto ilustrando Dot Blot realizado nas proteínas CRA e FRA após a diálise de três frações purificadas. Em 1 e 2 notar a reatividade fraca nas frações (em amarelo). Em 3 foram testados em conjunto as frações CRA e FRA em um pool de amostras positivas e pôde ser observado reatividade das proteínas.
Em testes de antigenicidade (ELISA indireto) as proteínas recombinantes foram avaliadas separadamente utilizando-se algumas amostras aleatórias de soros de pacientes humanos reagentes e não reagentes no qual foi observado reatividade em pelo menos uma das proteínas em amostras reagentes. Os soros não reagentes, não apresentaram reatividade contra as proteínas.
4.2.2- Proteína rK39 (Leishmania infantum)
A rK39 foi avaliada somente pela técnica de ELISA indireto e demonstrou reatividade em diversas amostras de cães controles positivos e não reatividade em amostras negativas. Optou-se por testar amostras aleatoriamente, conforme os testes iniciais empregados para as proteínas CRA e FRA para testes de antigenicidade.
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4.3- Análise sorológica (Imunorreagentes- Conjugados espécie-específicos)
Os coelhos inoculados contra IgGs purificadas para as diferentes espécies
silvestres foram avaliados através do ELISA direto após o período de imunização e estes resultados foram satisfatórios ao verificar-se a resposta imune contra as IgGs e IgY purificadas. Dessa forma prosseguiu-se com o procedimento de conjugação da peroxidase nas IgGs de coelhos contra IgGs das espécies silvestres conforme descrito no item 3.6.3.
Foram coletadas 30 frações que foram submetidas a cromatografia por gel filtração para separar as IgGs conjugadas das peroxidases livres. Os resultados de leituras em espectrofotometria nos comprimentos 280 nm (IgGs conjugadas) e 403 nm (peroxidases livres) para as diferentes espécies silvestres estão representadas nas Figuras 8 e 9. As frações no comprimento de onda 280 nm com DO ≥0,4 foram misturadas em um único tubo e avaliadas através do ELISA direto para verificar a reatividade contra anticorpos (IgGs) purificadas de animais silvestres e conjugados, obtendo-se êxito na avaliação dos anticorpos marcados.
44 Figura 8-Perfil de leituras em espectofotômetro nos comprimentos de onda 280 e 403 nm após separação cromatográfica em Sephadex G-100 das 30 frações coletadas de anti IgGs de cotia e primatas não humanos marcadas com a peroxidase.
45 Figura 9-Perfil de leituras em espectofotômetro nos comprimentos de onda 280 e 403 nm após separação cromatográfica em Sephadex G-100 das 30 frações coletadas de anti IgG de tatu- galinha, gambá e anti IgY de teiú marcadas com a peroxidase.
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4.4- Ensaio imunoemzimático
4.4.1- Determinação das condições de diluição e concentração dos imunoreagentes para amostras controles e animais silvestres
Os valores de concentrações e diluições de conjugados e soros (testes e controles) estão representados no Quadro 3. Para as proteínas CRA e FRA foi determinada a concentração de 1 µg/mL (100ng/poço) e para a proteína rK39 foi determinada a concentração de 0,2µg/mL (20ng/poço) em uma reação de um volume final de 100 µL. Testes com a proteína A conjugada para animais silvestres no ensaio com emprego da rK39, foi utilizada a diluição de 1:20000.
Quadro 3- Diluição ótima de soros e conjugados espécie-específicos em diferentes
espécies de animais silvestres e das amostras controles no ensaio imunoenzimático de ELISA indireto.
ANIMAIS SILVESTRES CONJUGADOS
(diluição) (diluição) SOROS
Bugio preto 1:2000 1:100 Cateto 1:2000 1:100 Gato Mourisco 1:1000 1:100 Macaco prego 1:2000 1:100 Queixada 1:2000 1:50 Cotia 1:1000 1:100 Gambá 1:2000 1:100 Tatu galinha 1:2000 1:100 Teiú 1:2000 1:100 Rato domestic 1:8000 1:100
AMOSTRAS CONTROLES CONJUGADOS
(diluição) (diluição) SOROS
Cães (Leishmaniose Visceral) 1:600 1:100
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4.4.3- ELISA indireto em amostras de cães (controles) para Leishmaniose Visceral Canina
Observou-se reatividade da rK39 nas amostras de cães controles positivos. Porém alguns resultados foram divergentes ao serem comparados com os resultados obtidos através das técnicas de ELISA com emprego de antígeno bruto e RIFI. O ponto de corte estabelecido foi de DO ≥ 0, 127. No Quadro 4 estão representados os valores de DO em Níveis de ELISA para este ensaio imunoenzimático. No item Apêndices nas Tabelas 1, 2 e 3 estão referidos os valores de DO, AP e Nível ELISA (NE) para os testes de ELISA com emprego de antígeno bruto, recombinante e resultados de RIFI.
Quadro 4- Nível de ELISA para ELISA indireto com emprego de rK39 em amostras
soros controles cães para doença de Chagas.
Valores de Nível ELISA (NE) em Densidade Óptica (DO) de soros cãescontroles para Leishmaniose Visceral
NE rK39 0 0,000 - 0,200 1 0,201 - 0,270 2 0,271 - 0,365 3 0, 366 - 0,493 4 0, 494 - 0,665 5 0,666 - 0,898 6 0,899 - 1,213 7 1,214 - 1,637 8 1,638 - 2,211 9 2,212– 2,985
4.4.4- ELISA indireto em a amostras de pacientes humanos (controles) para doença de Chagas
Neste testes considerou-se como soro reagente para T. cruzi, amostras que obtiveram reatividade em pelo menos uma das proteínas testadas. Também observou-se reatividade para ambas proteínas, principalmente as que apresentaram alto índice de anticorpos através da técnica de CL-ELISA. O ponte de corte estabelecido para CRA
48 foi de DO ≥ 0,201 e para FRA (DO ≥ 0,224). Foram calculados Nível de ELISA para as duas proteínas e os dados estão representados no Quadro 5. O valores de AP, NE a partir das DO obtidas, bem como os resultados pela técnica de CL-ELISA, e ELISA indireto com CRA e FRA estão ilustrados no item Apêndices (Tabelas 4 e 5).
Quadro 5- Nível de ELISA para ELISA indireto com emprego de CRA e FRA em
amostras soros controles de pacientes humanos para doença de Chagas
Valores de Nível ELISA (NE) em Densidade Óptica (DO) de soros humanos controles para doença de Chagas
NE CRA FRA 0 0,000 - 0,201 0,000 - 0,190 1 0,202 - 0,272 0,191 - 0,256 2 0,273 - 0,367 0,257 - 0,346 3 0, 368 - 0,495 0,347 - 0,467 4 0, 496 - 0,669 0,468 - 0,631 5 0,670 - 0,903 0,632 - 0,851 6 0,904 - 1,219 0,852 - 1,149 7 1,220 - 1,646 1,150 - 1,552 8 1,647 - 2,222 1,553 - 2,095 9 2,223 - 3,000 2,096 - 2,829
4.4.5- ELISA indireto para animais silvestres
De acordo com os dados obtidos a partir dos valores de Densidade Óptica (DO) para os diferentes grupos de animais silvestres para as proteínas recombinantes estabeleceram-se dois pontos de corte, no qual foi classificado como animais (soro): não reagente, inconclusivo e reagente para as enfermidades pesquisadas, conforme ilustrado abaixo:
49 Exceto para o grupo queixadas, de acordo com os resultados obtidos foi estabelecido em: soro não reagente: DO ≤ 0,2; inconclusivo: DO ˃ 0,2 ≤ 0,3 e reagente: DO˃ 0,3.
O número de amostras de animais silvestres classificados seguindo estes critérios mencionados, estão representados no Quadro 6 para rK39 em amostras com emprego de proteína A conjugada e conjugados espécies-específicos. Para ratos e teiús não foi realizado testes com conjugado a proteína A, devido não afinidade dessa em